Методическая статья

Новая платформа для экстракорпорального клеточного растяжения и визуализации

408 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69779

⸱

10 марта 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Northeastern University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем новое устройство, которое применяет изотропные и униаксиальные формы волн деформации к клеткам, поддерживая культуру на субстратах с регулируемой жёсткостью и настраиваемыми белковыми матрицами. Эта простая и экономичная платформа позволяет исследователям изучать, как механические сигналы регулируют функцию клеток как в фундаментальных исследованиях, так и в контекстах, связанных с заболеваниями.

Аннотация

Клетки реагируют на механические сигналы окружающей среды, такие как изменения жёсткости внеклеточного матрикса (ECM) и циклическое напряжение, которые регулируют клеточные процессы, включая определение судьбы клеток, межклеточную коммуникацию и развитие. Изменения этих сил способствуют прогрессированию заболевания при таких состояниях, как астма, гипертония и рак. Хотя существующие устройства для растяжения in vitro могут навязывать униаксиальные или изотропные напряжения, они часто используют нефизиологическую жёсткость, ограничивают живую визуализацию или не могут достичь высоких амплитуд деформации, соответствующих физиологическим и патологическим состояниям. Здесь мы представляем компактное, совместимое с микроскопом устройство для подтяжки, которое прикладывает контролируемое изотропное или униаксиальное напряжение к прилипшим клеткам на эластомерных сосисках. Эти тарелки имеют регулируемый модуль Юнга и совместимы с различными матричными белковыми покрытиями для клеточной адгезии, позволяя самостоятельно модулировать жёсткость субстрата и состав ECM. Важно отметить, что простота работы устройства обеспечивается его конструкцией с шаговым двигателем, которая поддерживает генерацию программируемых циклических волн. Мы демонстрируем возможности устройства, количественно измеряя внутриклеточную динамику кальция и клеточные тяговые силы в первичных гладких мышечных клетках дыхательных путей при механическом растяжении. Эта платформа предоставляет универсальный инструмент для изучения влияния механических сигналов на функцию клеток как в здоровых, так и в контекстах, связанных с заболеваниями.

Введение

Клетки испытывают механические силы окружающей среды, которые играют критическую роль в регулировании многих аспектов клеточной функции, включая определение судьбы клетки 1,2, межклеточноеобщение 3,4 и здоровыйрост 2,5. Кроме того, изменения этих механических сил могут привести к усиленному прогрессированию заболевания и его появлению, включая ремоделирование внеклеточного матрикса(ECM) 6 и ростопухоли 7,8,9,10. Клетки могут ощущать и реагировать на эти механические сигналы, включая изменения жёсткостиECM 4, а также циклическую нагрузку в органах, таких как сердце, лёгкие имышцы 11,12. Исследования in vitro показали, что жёсткость и состав ECM могут влиять на жёсткость цитоскелета клетки как в состоянии покоя, так и после воздействия сократительныхагонистов 13. Многочисленные in vitro и in situ исследования изучали, как временные, статические и циклические штаммы влияют на клетки и ткани, показывая, что ответы варьируются в зависимости от типа штамма, частоты и амплитуды14. Например, недавние исследования показали, что временное растяжение снижает жёсткость клеток пропорционально приложенному напряжению, при этом устойчивое увеличение напряжения приводит к первоначальному быстрому увеличению жесткости, за которым следует постепенноерасслабление 15. Кроме того, кальциевая сигнализация, основной молекулярный регулятор генерации силы, подвержена воздействию растяжения и других механическихсил 4,16,17,18,19,20. Изучение того, как жёсткость и деформация влияют на механобиологические пути, требует модуляции обоих факторов с мониторингом клеточных реакций. Поэтому мы разработали новый клеточный растяжитель, совместимый с микроскопом, способный вызывать как изотропную, так и униаксиальную растяжение, с независимым контролем жёсткости подложки, матричного белкового покрытия и ряда программируемых форм волн.

Ранее исследователи также создавали устройства для наложения специфических движений и механических растяжений на клеточные культуры иткани 21,22. Самый простой случай — одноосное движение — это механическое растяжение, наложённое на одно измерение. Например, некоторые устройства были разработаны для наложения механического растяжения и напряжения на полоскитканей 23 иколлагеновые волокна 24, либо для выравнивания ориентации клеток и индуцирования миграцииклеток 25. Изотропное растяжение — это тип растяжения, при котором равная сила прикладывается к гелю или подложке со всех сторон, что приводит к равномерной деформации по всему материалу. Это растяжение имитирует равномерное распределение сил, которое клетки испытывают в определённых физиологических средах, например, в альвеолах лёгких, где клетки подвергаются радиальному расширению и сокращению во времядыхания 26,27.

Существующие носилки имеют ряд ограничений, ограничивающих их использование в исследованиях, связанных с механобиологией. Во многих конструкциях используются значения жесткости подложки, превышающие типичный физиологический диапазон, чтобы выдержать механические нагрузки и поддерживать вес клеточной культуры28. Однако использование такой нефизиологической жесткости может также влиять на поведение клеток, что потенциально ограничивает актуальность модели для естественных тканевыхсред 29. Кроме того, некоторые конструкции носилок блокируют объектив или световой путь, препятствуя визуализации, в то время как другие используют мембраны, слишком толстые для чёткогонаблюдения 28. Даже если подрамники совместимы с микроскопами и используют тонкие подложки, такие проблемы, как провисение мембраны и потеря фокуса, часто встречаются. Коммерческие платформы, такие как Flexcell, используют вакуумную деформацию для растяжения гибких мембран. Хотя этот подход может генерировать стабильные, однородные поля деформации, он не оптимизирован для микроскопии живых клеток, а конфигурации, совместимые с микроскопом, требуют дорогостоящих дополнительных аксессуаров. Кроме того, эти платформы могут достигать максимального штамма всего 21,8%30, тогда как глубокие вдохновения могут вызывать штаммы свыше 30%, а ещё более высокие штаммы наблюдаются при таких заболеваниях, как астма иХОБЛ 31.

Поэтому мы разработали новое устройство для растяжения ячеек, которое позволяет точно контролировать жёсткость субстрата и состав ЭБМ, одновременно применяя переменные изотропные и униаксиальные деформации к приклеенным ячейкам. Эта платформа отлично подходит для исследователей, изучающих механобиологические вопросы, которым требуется живое изображение во время механической стимуляции с использованием субстратов с физиологически значимой жесткостью. Устройство использует механически управляемый подход, вдохновлённый геометрией двумерной сферы Хобермана, которая расширяется и сжимается за счёт ножничкоподобных соединений (Рисунок 1, Дополнительный рисунок 1). Один шаговый двигатель приводит в движение 16 радиально расположенных рук через механизм тяги, обеспечивая координированное расширение и сжатие восьми крепительных стойк. Такая конфигурация создаёт однородную деформацию в плоскости за счёт одновременного применения равного радиального смещения ко всем столбам. Уникальная конструкция и компактная площадь устройства позволяют проводить живую клетку с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа во время изотропного и униаксиального растяжения в плоскости, что значительно дешевле, чем коммерческие альтернативы. Линейный шаговый двигатель управляется с помощью индивидуального кода Arduino, что позволяет программировать циклические сигналы с регулируемыми периодами и амплитудами. В этом исследовании мы демонстрируем, что устройство выдает точные и воспроизводимые штаммы от менее 1% до 15% с геометрической ёмкостью более 200%. Кроме того, мы количественно оцениваем влияние механического растяжения на динамику внутриклеточного кальция и клеточные тяговые силы первичных гладких мышц дыхательных путей человека.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Первичные гладкомышечные клетки человеческих дыхательных путей (ASMC), использованные в этом исследовании, были получены из ATCC (Вирджиния), а информация о донорах была де-идентификация в соответствии с рекомендациями NIH. Это исследование было одобрено Комитетом по биобезопасности Северо-Восточного университета до проведения экспериментов.

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения инструкций по изготовлению устройства, а также по размерам устройства, пожалуйста, смотрите CAD-файл, доступный в нашем репозитории GitHub: https://github.com/Breathe-Lab/A-Novel-Platform-for-In-Vitro-Cellular-Stretching-and-Imaging.

1. Проектирование 3D-печатной формы

  1. Изотропные размеры формы
    1. Внешний диаметр формы составляет 37 мм.
    2. Внешняя высота формы составляет 4,1 мм.
    3. Толщина внешней стенки составляет 2,1 мм.
    4. Толщина основания формы составляет 2 мм.
    5. Отверстия для крепления расположены в 2 мм от края.
    6. Внутренняя площадь колодца для культивирования клеток имеет диаметр 20 мм и глубину 1,9 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Готовая форма PDMS должна иметь толщину площади клеточной культуры 200 мкм.
  2. Одноосные размеры формы
    1. Внешние размеры формы — 41 мм x 12 мм x 4 мм (L x W x H).
    2. Отверстия для крепления находятся в 3 мм от края ширины и 4 мм от края длины, глубина столба составляет 1 мм.
    3. Толщина внешней стенки — 1,5 мм по краю ширины и 2 мм по краю длины.
    4. Размеры колодца для внутренней клеточной культуры составляют 26 мм x 5,5 мм x 1 мм (L x W x H).
    5. Толщина основания — 2 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Формы были разработаны в SolidWorks, 3D-печать с использованием жидкой серой смолы FormLabs и изготовлена в makerspace Северо-Восточного университета.
  3. Инструкции только для первоначального использования формы
    1. Отшлифуйте шероховатые края формы.
    2. Покрыть негативную форму прозрачным лаком для ногтей, чтобы облегчить последующее удаление PDMS после затвердевания. Дайте форме высохнуть на воздухе 24 часа.

2. Изготовление оптически прозрачных, эластичных гелей с регулируемой жёсткостью подложки для культивирования клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с PDMS и NuSil используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (перчатки, лабораторный халат, защитные средства для глаз).

  1. Добавьте основу Sylgard 184 и сушитель в соотношении 10:1 по весу в пластиковую чашу.
  2. Тщательно перемешайте с депрессором для языка (или похожим инструментом) в течение 2-3 минут.
  3. Дегазируйте смесь в течение 1 часа.
  4. Вылейте смесь PDMS в индивидуальную негативную форму (рисунок 2A,B).
    1. Добавьте 1,3 г в изотропную форму.
    2. Добавьте 0,5 г для униаксиальной формы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за равномерным распределением геля по плесени.
  5. Дегазируйте форму в течение 1 часа.
  6. Дайте гелю в форме осесть на ровной поверхности при комнатной температуре в течение 2 часов.
  7. Засолить при 60 °C за ночь.
  8. Смешивайте части A и B NuSil Gel-8100 в равных пропорциях (1:1) в течение 15 минут.
    1. Смешайте с перекрестным сшивателем Sylgard 184 при 0,36% от общего объёма, чтобы получить субстрат с жёсткостью 13 кПа 32.
    2. Не добавляйте перекрестный сшиватель, чтобы получить субстрат с жёсткостью 0,3 кПа.
  9. Дегазируйте смесь в течение 30 минут.
  10. Аккуратно удалите гель PDMS из индивидуальной формы. Положите гель на накладку на 40 мм накладку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не порвать гели, так как они хрупкие.
  11. Вылейте смесь NuSil в отрицательную область геля PDMS.
    1. Изотропный гель: 100 мкл.
    2. Одноосевой гель: 50 мкл.
  12. Покрыть соответствующие гели PDMS смесью NuSil с помощью спин-коутера в течение 50 секунд при 7 x g , чтобы достичь равномерной толщины подложки 100 мкм.
  13. Дайте гелю осесть на ровной поверхности при комнатной температуре в течение 2 часов, прежде чем он вытвердится при 60 °C за ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, следите за тем, чтобы все этапы отверждения выполнялись на ровной поверхности. Неравномерный гель не позволит всей интересующей области оставаться в плоскости изображения микроскопа. Если визуализация показывает вариацию фокуса по полю зрения, гель мог затвердеть на неровной поверхности и его следует переделать.
  14. Храните готовые чашки для клеточной культуры в закрытых чашках Петри до использования (рисунок 2D-E).

3. Матричное белоковое покрытие

  1. Добавьте 500 мкл поли-L-лизина (PLL, 500 мкг/мл) на каждый субстрат.
  2. Инкубировать при комнатной температуре 1 час.
  3. Промывание субстратов 3 × с 1 мл PBS, затем 3 × с 1 мл буфера HEPES 10 мм (pH 8,0).
  4. Добавьте на каждый субстрат 500 мкл mPEG-SVA (50 мг/мл).
  5. Инкубировать при комнатной температуре 1 час.
  6. Промывайте субстраты на 3 × с 1 мл PBS.
  7. Замените PBS на 500 мкл PLPP (14,5 мг/мл).
  8. Используя систему микропаттерна PRIMO с программным обеспечением Leonardo, проецируйте заранее заданный узор на поверхность подложки с помощью ультрафиолетового света в течение 30 секунд.
  9. Промыйте субстраты 3 × с 1 мл PBS и поместите под ультрафиолет на 15 минут для стерилизации.
  10. Добавьте на каждый субстрат 500 мкл желатина, конъюгированного флуоресцеином.
  11. Инкубировать при комнатной температуре 1 час.
  12. Промывайте 3 × 1 мл PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы визуализировать паттерны, инкубировать с желатином, конъюгированным флуоресцеином, в течение 1 часа при комнатной температуре.
  13. Приступайте к визуализации.

4. Культура гладкомышечных клеток человеческих дыхательных путей в эластичных посудах

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все процедуры по культивированию клеток в биозащитном капюшоне с использованием стандартной асептической техники.

  1. Получите первичные гладкомышечные клетки человеческих дыхательных путей (ASMC) из ATCC (Вирджиния) и убедитесь, что информация о доноре де-идентификация в соответствии с рекомендациями NIH. Подтвердите одобрение Институционального комитета по биобезопасности перед началом экспериментов.
  2. Используйте клетки трёх здоровых доноров разных полов и возрастов без истории астмы или заболеваний. Пример: одна женщина (18 лет) и два мужчины (34 и 59 лет).
  3. Культивировать клетки в стандартных условиях (37 °C, 5% CO ₂) и использовать клетки до шестого прохода для всех экспериментов.
  4. Выращивать клетки в следующей полной среде роста:
    1. DMEM/F12 (500 мл)
    2. 10% плодовая бычья сыворотка (FBS) (50 мл)
    3. 1× пенициллин/стрептомицин (5 мл)
    4. 1× МЭМ-незаменительные аминокислоты (5 мл)
    5. Амфотерицин B (0,5 мл)
  5. Переходите клетки на безсывороточную среду как минимум за 24 часа до измерений. Приготовьте среду без сыворотки с помощью следующего:
    1. F-12 среднего калибра Хэма (500 мл)
    2. 1 × пенициллина/стрептомицина (5 мл)
    3. Амфотерицин B (50 мкг/л)
    4. 1× МЭМ-незаменительные аминокислоты (5 мл)
  6. УФ-стерилизуйте растягиваемые контейнеры для клеточной культуры в течение 15 минут.
  7. Инкубировать стерилизованные блюда с желатином 0,1% в течение 1 часа при комнатной температуре перед посевом (рисунок 2F).
    1. Для узорчатых субстратов:
      1. Семенные клетки в эластичной клеточной культуре сохраняются с плотностью10-4 клетки/см².
      2. Инкубировать в 10% сывороточной среде в течение 10 минут, чтобы улучшить прикрепление к узорчатым участкам.
      3. Промывайте колодцы с помощью PBS, чтобы удалить отдельные элементы.
      4. Наполните колодцы 10% сывороточной средой и инкубируем 24 часа.
      5. Замените на субстрат без сыворотки и инкубируйте 24 часа до замеров.
    2. Для субстратов без узоров:
      1. Семенные клетки с нужной плотностью: 102 клеток насм² для изолированных клеток. 103 ячейки/см² для редких клеток. 104клетки/см² для слияющихся клеток.
      2. Инкубировать в сывороточной среде 10% в течение 24 часов.
      3. Замените на субстрат без сыворотки и инкубируйте 24 часа до замеров.

5. Флуоресцентная кальциевая визуализация и анализ

  1. ASMC, испытывающие нехватку сыворотки, в течение 24 часов.
  2. Приготовьте краску FLIPRCa 2+6 согласно инструкции производителя.
  3. Смешайте краситель FLIPRCa 2+6 с безсывороточной средой в соотношении 1:1.
  4. Инкубировать клетки раствором FLIPR Ca ² ⁺ 6 при 37 °C и 5% CO ₂ в течение 2 часа.

6. Установка визуализации

  1. Используйте инвертированный микроскоп Leica DMi8, оснащённый следующим:
    1. Leica DFC6000 камера
    2. Легкий двигатель Leica LED8
    3. 5×/0,12 сухой объектив
  2. Выставьте возбуждение на 480/40 нм, а излучение — на 527/50 нм.
  3. Получайте 16-битные изображения с частотой кадров 2 Гц во время экспериментов с растяжением.

7. Анализ данных

  1. Импорт последовательностей изображений на Фиджи (ImageJ) 33.
  2. Ручное определение интересующих областей (ROI) в цитоплазме каждой клетки.
  3. Извлекайте средние значения интенсивности оттенков серого для каждого ROI со временем.
  4. Обрабатывайте данные интенсивности флуоресценции с помощью собственного скрипта MATLAB.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность флуоресценции пропорциональна цитозольной [Ca2+].

8. Измерения и анализ тяговых сил

ПРИМЕЧАНИЕ: Все коды, включая те, что используются для анализа изображений, микроскопии силы тяги и управления моторами, доступны в нашем репозитории GitHub: https://github.com/Breathe-Lab/A-Novel-Platform-for-In-Vitro-Cellular-Stretching-and-Imaging

  1. Покрытие гелевых субстратов PDMS-NuSil слоем флуоресцентных шариков для использования фидуциальных маркеров для микроскопии силы тяги.
  2. Приготовьте 0,025% раствор микросфер с красными флуоресцентными карбоксилатоми диаметром 1 мкм в HBSS, разбавляя до соотношения 1:4000.
  3. Вихрь — решение для бусинок на 10 секунд.
  4. Добавьте раствор бусинок в гель.
    1. 880 мкл в изотропный гель.
    2. 420 мкл в одноосевой гель.
  5. Инкубировать при комнатной температуре в течение 1 часа, чтобы бусины прилипли.
  6. Через час аккуратно удалите раствор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно вылейте раствор бусины на мягкие гели. Неправильное удаление мешает правильному распределению бусин.
  7. Аккуратно промокните остатки раствора ватной палочкой или Kimwipe.
  8. Сфотографируйте шарики с помощью микроскопа Leica DMi8 с сухим объективом 10x/0.32.
  9. Делайте снимки в состоянии до растяжения и непрерывно на протяжении всего протокола растяжения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все изображения проводите в центре подложки, где равномерность деформации наиболее высока. При необходимости перефокусируйте микроскоп в растянутом положении перед тем, как снимать изображения.
  10. Проанализировать изображения с помощью индивидуального кода MATLAB на основе микроскопии силы тяги Фурье для расчёта векторов смещений и соответствующих полей плоских деформаций 34.
  11. Представить данные как среднее по N испытаний.

9. Калибровка устройства для растяжения ячеек

  1. Добавьте в колодец 500 мкл H₂O, чтобы смоделировать массу клеточной культуры и поддерживать влажный образец белка.
  2. Для протокола создания специфических белковых паттернов см. раздел 3 под названием «Матричное белоковое покрытие».
  3. Изобразите флуоресцентные узоры каждые 400 мкм шагов моторного смещения, увеличивая максимальную мощность 2800 мкм, а затем возвращаясь к нулю с обратными шагами на 400 мкм.
  4. Охарактеризовать связь между линейным смещением от шагового мотора и изотропной деформацией растягиваемой антенны для культивирования клеток на макроскопическом и региональном уровнях, измеряя изменения площади и эксцентриситета букв с флуоресцентным белковым узором, составляющих «BREATHE» на эластичном субстрате во время растяжения. Используйте прямоугольную ограничивающую рамку, охватывающую все буквы, чтобы вычислить площадь и эксцентриситет всего слова.
  5. Применяйте сегментацию изображений в MATLAB для количественной оценки этих параметров для каждой отдельной буквы.
  6. Определите нулевое смещение по нерастянутым размерам контейнера клеточной культуры.
  7. Повторяйте каждый эксперимент в двух-трёх независимо подготовленных растягиваемых клеточных культурных колодцах, чтобы обеспечить воспроизводимость.

10. Презентация данных и статистическое тестирование

  1. Для экспериментов по калибровке носилок определяйте испытания как количество циклов.
  2. Показывайте каждое исследование отдельно, а не объединяйте их в одну кривую для демонстрации повторяемости системы.
  3. Указывайте индикаторы ошибок как стандартное отклонение.
  4. Используйте односторонний ANOVA для проверки значимых различий в наборах данных с тремя или более группами, на которые влияет один независимый фактор.
  5. Используйте двусторонние ANOVA, а затем пост-хок парные сравнения для проверки значимых различий в наборах данных, на которые влияют два независимых фактора.
  6. Примените t-тест для парных сравнений, когда данные распределены нормально.
  7. Применим тест суммы рангов Манна-Уитни для сравнения медианных значений, когда данные не распределены нормально.
  8. Сообщите о конкретных использованных тестах, количестве образцов и соответствующих P-значениях вместе с результатами.
  9. Используйте порог P-значения 0,05 для определения статистически значимых различий между наборами данных.
  10. Проведите статистические тесты в SigmaStat.
  11. Сюжетные фигуры в GraphPad Prism и MATLAB.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Клеточный растяжал вызывает макроскопические изменения площади, отражающие локализованные деформации. Для оценки изотропного поведения мы измерили изменения площади флуоресцентного желатинового белка, формирующего слово «BREATHE», на растяжимой клеточной культуре вместе с отдельными буквами на изотропном субстрате. Наши результаты показали, что и слово, и отдельные буквы демонстрируют эквивалентные изменения площади (рисунок 3A,B).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом протоколе мы описываем проектирование, разработку, валидацию и внедрение нового совместимого с микроскопом клеточных растяжителей, которые могут имитировать изотропные и униаксиальные напряжения, одновременно визуализируя живые клетки. Это устройство компактно и может помещаться на ступень микроскопа Leica DMi8, ограничивая все движущиеся части в одной плоскости для живой съёмки при сохранении фокуса на подложке и подлежащих клетках. Это было сделано с помощью наклонных рукавов, в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Ни один из авторов не имеет конкурирующих интересов, чтобы заявить о своих интересах.

Благодарности

Авторы благодарят мистера Ноа Джозефа за помощь в изготовлении форм. Авторы благодарят Хейтора Мурато и Гленна Тэйера из Научного инструментального центра Бостонского университета за помощь в обработке устройства. Эта работа была поддержана грантом Национального научного фонда (NSF) #2047207, присуждённым Харикришнану Парамешварану. Исследование задумалось именно Х.П. S.E.S. и S.R.P. разработали общий дизайн устройства, а S.E.S. и H.P. разработали изотропные эксперименты. S.E.S провела эксперименты с изотропными формами, проанализировала экспериментальные данные и интерпретировала результаты вместе с H.P. V.C. разработала униаксиальные формы, оптимизировала приготовление геля и вышивку бусин. B.M.G провела эксперименты с одноосными гелями, проанализировала экспериментальные данные и интерпретировала результаты вместе с H.P. и V.C. S.E.S. и B.M.G. подготовили эти данные. B.M.G, S.E.S, V.C. и H.P. внесли вклад в составление и редактирование рукописи. Х.П. одобрил окончательную версию рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
  Дульбекко модифицированный Eagle' s средний/F12Fisher Scientific12634010500 mL 
(4-бензоилбензил) триметиламмония хлорид (PLPP)Alvé олеН/Д14,5 мг/мл
0,1% флуоресцеин, конъюгированный желатин и nbsp;ИнвитрогенG13187
0,1% желатиновый растворСигма-ОлдричES-006500 mL 
1 и мю; Микросферы диаметром m с красными флуоресцентными карбоксилатами модифицированыFluoSpheresF8816
1 и раз; Раствор несущественных аминокислот MEMСигма-ОлдричM7145100 мл
1 и раз; Пенициллин/стрептомицинFisher Scientific15-140-122100 мл
10% плодовая сыворотка для крупного рогатого скотаThermo-ScientificA5256701500 mL 
Трубка объёмом 15 млFisher Scientific14-959-53A
1x глутамин Fisher ScientificMT10010CM
1x добавка для роста инсулина-трансферрина-селенаCorning Life Sciences25-800-CR
амфотерицин BСигма-ОлдричA294225 & mu; г/литр
ШарикоподшипникиMcMaster-Carr Н/Д
Хлорид кальция дигидратСигма-Олдрич223506
Вагонный рельсMcMaster-Carr Н/Д
FLIPR Ca2+ 6Молекулярные устройстваR8190
GraphPad PrismДотматикаН/Д
Ветчина s F-12 medium Сигма-ОлдричN8641500 mL 
Сбалансированный сольный раствор Хэнкса Thermo-Scientific14025092500 mL 
Буфер HEPES  Thermo-Scientific15630080100 мл
Leonardo SoftwareAlvé олеН/Д
MatlabMathworksН/Д
метокси-полиэтиленгликоль и НДАШ; Сукцинимидил валерат (mPEG-SVA)Laysan Bio IncН/Д50 мг/мл
Nusil Gel-8100Nusil Н/Д
Чашки ПетриThermo-Scientific26399190 мм 
фосфатно-буферный физиологический раствор  Сигма-Олдрич10010023500 mL 
поли-L-лизин (PLL)Сигма-ОлдричP8920500μ g/mL
Первичные гладкомышечные клетки дыхательных путей человека ATCCPCS-130-011
Оптический модуль PRIMO  Alvé олеН/Д
ВинтыMcMaster-Carr Н/Д
SigmaStatSystat SoftwareН/Д
Spin CoaterЛореллМодель WS-650MZ-23NPPB
Компоненты крепления растяжителей и ступеней и nbsp;Научно-исследовательский центр Бостонского университетаН/ДНержавеющая сталь
Основной эластомер Sylgard 184 и набор для отвержденияДауH047J8Q026
Колба для культуры тканей T-25 — вентиляционная крышка, стерильнаяCellTreat229331
Депрессор языка  Thermo-Scientific22-363-154

Ссылки

  1. Alvarez, Y., Smutny, M. Emerging role of mechanical forces in cell fate acquisition. Front Cell Dev Biol. 10, 864522(2022).
  2. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nat Rev Mol Cell Biol. 18, 728-742 (2017).
  3. Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. Mechanical force-induced signal transduction in lung cells. Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).
  4. Stasiak, S. E., Jamieson, R. R., Bouffard, J., Cram, E. J., Parameswaran, H. Intercellular communication controls agonist-induced calcium oscillations independently of gap junctions in smooth muscle cells. Sci Adv. 6 (32), eaba1149(2020).
  5. Riley, D. J., Rannels, D. E., Low, R. B., Jensen, L., Jacobs, T. P. NHLBI workshop summary: effect of physical forces on lung structure, function, and metabolism. Am Rev Respir Dis. 142, 910-914 (1990).
  6. Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 802-812 (2014).
  7. Gong, F., et al. An overview of the role of mechanical stretching in the progression of lung cancer. Front Cell Dev Biol. 9, 781828(2021).
  8. Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 63-73 (2009).
  9. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS One. 5, e12905(2010).
  10. Hannezo, E., Heisenberg, C. -P. Mechanochemical feedback loops in development and disease. Cell. 178, 12-25 (2019).
  11. Das, S., Ippolito, A., McGarry, P., Deshpande, V. S. Cell reorientation on a cyclically strained substrate. PNAS Nexus. 1, pgac199(2022).
  12. Dartsch, P. C., Hämmerle, H., Betz, E. Orientation of cultured arterial smooth muscle cells growing on cyclically stretched substrates. Acta Anat. 125, 108-113 (1986).
  13. An, S. S., et al. Cell stiffness, contractile stress and the role of extracellular matrix. Biochem Biophys Res Commun. 382, 697-703 (2009).
  14. Arold, S. P., Bartolák-Suki, E., Suki, B. Variable stretch pattern enhances surfactant secretion in alveolar type II cells in culture. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L574-L581 (2009).
  15. Trepat, X., et al. Universal physical responses to stretch in the living cell. Nature. 447, 592-595 (2007).
  16. Benavides Damm, T., Egli, M. Calcium 's role in mechanotransduction during muscle development. Cell Physiol Biochem. 33, 249-272 (2014).
  17. Ito, S., et al. A novel Ca2+ influx pathway activated by mechanical stretch in human airway smooth muscle cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 407-413 (2008).
  18. Ito, S. Stretch-activated calcium mobilization in airway smooth muscle and pathophysiology of asthma. Curr Opin Physiol. 21, 65-70 (2021).
  19. Ito, S., et al. Actin cytoskeleton regulates stretch-activated Ca2+ influx in human pulmonary microvascular endothelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 26-34 (2010).
  20. Tanaka, Y., Hata, S., Ishiro, H., Ishii, K., Nakayama, K. Quick stretch increases the production of inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) in porcine coronary artery. Life Sci. 55, 227-235 (1994).
  21. Brown, T. D. Techniques for mechanical stimulation of cells in vitro: a review. J Biomech. 33, 3-14 (2000).
  22. Kamble, H., Barton, M. J., Jun, M., Park, S., Nguyen, N. T. Cell stretching devices as research tools: engineering and biological considerations. Lab Chip. 16, 3193-3203 (2016).
  23. Fredberg, J. J., Bunk, D., Ingenito, E., Shore, S. A. Tissue resistance and the contractile state of lung parenchyma. J Appl Physiol. 74, 1387-1397 (1993).
  24. Shen, Z. L., Dodge, M. R., Kahn, H., Ballarini, R., Eppell, S. J. Stress-strain experiments on individual collagen fibrils. Biophys J. 95, 3956-3963 (2008).
  25. Atcha, H., et al. A low-cost mechanical stretching device for uniaxial strain of cells: a platform for pedagogy in mechanobiology. J Biomech Eng. 140, 0810051-0810059 (2018).
  26. Tschumperlin, D. J., Margulies, S. S. Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro. Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).
  27. Meza, D., Abejar, L., Rubenstein, D. A., Yin, W. A shearing-stretching device that can apply physiological fluid shear stress and cyclic stretch concurrently to endothelial cells. J Biomech Eng. 138, 4032550(2016).
  28. Ursekar, C. P., et al. Design and construction of an equibiaxial cell stretching system that is improved for biochemical analysis. PLoS One. 9, e90665(2014).
  29. Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 13661-13665 (1997).
  30. Cell stretching bioreactor FAQs. , Flexcell International. https://www.flexcellint.com/resources/faq (2024).
  31. Bossé, Y. The strain on airway smooth muscle during a deep inspiration to total lung capacity. J Eng Sci Med Diagn Ther. 2, 010802(2019).
  32. Yoshie, H., et al. Traction force screening enabled by compliant PDMS elastomers. Biophys J. 114, 2194-2199 (2018).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: an open source platform for biological image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Butler, J. P., Toli ć-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. Am J Physiol Cell Physiol. 282, C595-C605 (2002).
  35. Dessalles, C. A., Leclech, C., Castagnino, A., Barakat, A. I. Integration of substrate- and flow-derived stresses in endothelial cell mechanobiology. Commun Biol. 4, 764(2021).
  36. Ji, G., Barsotti, R. J., Feldman, M. E., Kotlikoff, M. I. Stretch-induced calcium release in smooth muscle. J Gen Physiol. 119, 533-543 (2002).
  37. Davis, M. J., Meininger, G. A., Zawieja, D. C. Stretch-induced increases in intracellular calcium of isolated vascular smooth muscle cells. Am J Physiol. 263, H1292-H1299 (1992).
  38. Naruse, K., Sokabe, M. Involvement of stretch-activated ion channels in Ca2+ mobilization to mechanical stretch in endothelial cells. Am J Physiol. 264, C1037-C1044 (1993).
  39. Arold, S. P., Bartol ák-Suki, E., Suki, B. Variable stretch pattern enhances surfactant secretion in alveolar type II cells in culture. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L574-L581 (2009).
  40. Cell stretching bioreactors. , Flexcell International. https://www.flexcellint.com (2024).
  41. Mitrossilis, D., et al. Single-cell response to stiffness exhibits muscle-like behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18243-18248 (2009).
  42. Parameswaran, H., Lutchen, K. R., Suki, B. A computational model of the response of adherent cells to stretch and changes in substrate stiffness. J Appl Physiol. 116, 825-834 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи