Методическая статья

Поясничная интратекальная инъекция SOD1-ASO для точного нацеливания на ЦНС и предиктивной эффективности у мышей ALS человека с SOD1-G93A

1.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69788

⸱

24 февраля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biogen

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье подробно описаны методы интратекальной доставки терапии, направленных на ЦНС, у взрослых мышей, с акцентом на точность протокола и возможность повторных инъекций. В нем представлены результаты валидационного исследования, в котором антисенсовые олигонуклеотиды снижали экспрессию мутантного SOD1 у мышей модели SOD1-ALS, что подтверждает полезность подхода в доклинических исследованиях нейродегенеративных заболеваний.

Аннотация

Интратекальное (ИТ) введение терапии, направленных на центральную нервную систему (ЦНС), предлагает минимально инвазивный путь для прямой доставки лекарств в спинномозговую жидкость (СМЖ), способствуя повышению специфичности и задействию цели. Хотя ИТ-катетеризация является стандартом для длительной доставки у крыс, её применение у мышей ограничено анатомическими ограничениями и повышенным риском осложнений, связанных с процедурой, включая травмы позвоночника и инфекции. Для преодоления этих ограничений мы применили острый метод проколов иглы для доставки ИТ-препаратов взрослым мышам, предоставляя воспроизводимую и менее инвазивную альтернативу, совместимую с одноразовыми или повторяющимися схемами дозирования. В трансгенной мышиной модели амиотрофического латерального склероза (БАС), содержащей мутацию SOD1-G93A, мы добились эффективной доставки антисмысловых олигонуклеотидов (ASO), направленных на ген SOD1. Этот подход эффективно снизил экспрессию мутантного SOD1 и значительно улучшил фенотип заболевания, что продемонстрировали электрофизиологические и биомаркерные оценки. Эти результаты подтверждают как метод доставки ИТ, так и терапевтическую эффективность, с результатами, сопоставимыми с применением внутримозговой вентрикулярной (ICV). Самое важное — эта техника отражает процедуры, используемые в клинических исследованиях на людях, обеспечивая высокую трансляционную значимость и полезность в доклинической оценке вмешательств, направленных на ЦНС. Хотя для обеспечения согласованности и предотвращения нецелевых эффектов требуется техническая экспертиза, эта стратегия предоставления ИТ представляет собой надёжную, воспроизводимую и клинически значимую методологию для продвижения терапевтической разработки на моделях мелких животных.

Введение

В этом исследовании мы описываем протокол инъекций в поясничный интратекальный (ИТ), сравниваем его с введением в интрацеребровентрикулярную (ICV) и оцениваем фармакодинамические результаты и переносимость для направления разработки терапевтических препаратов, ориентированных на центральную нервную систему (ЦНС). Терапии, направленные на РНК, особенно антисенсовые олигонуклеотиды (ASO), представляют собой перспективный метод лечения заболеваний ЦНС, позволяя посттранскрипционную модуляцию экспрессии генов. Эти подходы особенно актуальны при нейродегенеративных расстройствах, где прогрессирующая потеря нейронов подчёркивает необходимость точных, локализованных и своевременных вмешательств для возможного изменения прогрессирования заболевания. Здесь мы напрямую сравниваем эффективность протокола инъекции ИТ с введением ICV для ASO-терапии.

В доклинических исследованиях инъекции в поясничные интратекальные инъекции у взрослых мышей (самцов или самок, 30-70 дней, вес 13-20 г) использовались для доставки фармакологических агентов или биологических векторов непосредственно в спинномозговую жидкость (ЦЖ) с целью нацеления наЦНС 1,2. Объёмы инъекций 5-10 мкл обычно вводятся медленно, чтобы ограничить временное повышение давления СМВ и рефлюкс, при этом интратекальный доступ достигается через межпозвоночное пространство L5-L6 1,2. Успех процедуры зависит от тщательной техники для предотвращения неврологических повреждений, при этом возраст и вес тела влияют на объём и обработку спинномозговой жидкости. Использование игл мелкой калибровки (например, иглы 27-30 G в сочетании с шприцем Hamilton на 25 мкл) обеспечивает надёжнуюдоставку 2. Ключевые технические задачи включают минимизацию потерь в мёртвом пространстве, предотвращение неправильной инъекции и утечки эпидуральной анестезии, а также снижение вариабельности, зависящей от оператора, что может влиять на точность дозирования и распределение СМС.

Разработка эффективных методов лечения заболеваний ЦНС остаётся серьёзной задачей из-за структурной сложности и клеточной гетерогенности ЦНС. Эти особенности затрудняют целенаправленную доставку лекарств и ограничивают биораспределение по множеству анатомических и физиологических барьеров, что требует специализированных стратегий доставки. Ключевым препятствием являются физиологические и анатомические барьеры по всему центральному нервному системе, ограничивающие проникновение лекарств. Мозг и спинной мозг заключены тремя менингеальными слоями: твердой мозговой матер, арахноидальной матерой и пиа-матер, которые вместе с гематоэнцефалическим барьером (БББ) обеспечивают мощную защиту от циркулирующих терапевтических средств и других молекул в крови. Хотя эти барьеры жизненно важны для поддержания стабильности ЦНС, они значительно затрудняют доставку крупных гидрофильных молекул, таких как ASO, моноклональные антитела и вирусныевекторы 1,2,3,4. ИТ-администрация предлагает способ обойти эти ограничения, вводя терапевтические средства непосредственно в спинномозговую жидкость в субарахноидальное пространство. Этот путь доставки способствует распределению лекарств по компартментам ЦНС, способствуя более широкому проникновению тканей и, тем самым обеспечивая эффективное взаимодействие с мишенями, экспрессируемыми в различных типах клеток внутри ЦНС. С момента первого использования Хайлденом и Уилкоксом в 1980 году для доставки морфинамышам 1, ИТ-инъекции стали более широко применяемым методом доставки различных терапевтических препаратов, включая малые молекулы, биологические препараты, векторы генной терапии иASO 5,6,7,8,9,10.

ASO — это химически инженерные одноцепочечные олигонуклеотиды, предназначенные для связывания комплементарных РНК-последовательностей и модуляции экспрессии генов с помощью таких механизмов, как деградация, опосредованная РНазой H, модуляция сплетений и стерическое ингибированиетрансляции 11,12,13,14,15. Химические улучшения, такие как модификации фосфоротиоатного позвоночника, замены 2'-О-метоксиэтил (2'-MOE) и ограниченные этиловые остатки, повышают их стабильность, аффинность связывания и устойчивость кнуклеазам 6. Эти свойства способствовали их применению для таргетирования патогенных генов, связанных с нейрогенетическими заболеваниями. Лечение на основе ASO, применяемое интратекально, продемонстрировало клиническую пользу при таких заболеваниях, как спинально-мышечная атрофия (SMA) и боковой амиотрофический склероз (ALS)12,13,14,15. Например, Nusinersen (Spinraza) усиливает включение экзона 7 в транскрипты SMN2, чтобы компенсировать потерю SMN1 при SMA 7,14. Похожие стратегии, направленные на транскрипты мутантного хантингтина, также исследовались в болезниХантингтона 12,13. Хотя эти испытания были прекратены вначале 16 года, они подчёркивают продолжающийся интерес к подходам ASO, управляемым ЦНС.

БАС — это смертельное нейродегенеративное заболевание, характеризующееся прогрессирующей дегенерацией как верхних, так и нижних моторных нейронов. Заболевание, поражающее от 6 до 9 человек на 100 000 человек по всему миру и встречающееся примерно 2 случая на 100 000 человеко-лет, постепенно ухудшается мышечная слабость и спастичность, при этом большинство пациентов умирают от нервно-мышечной дыхательной недостаточности в течение 2–3 лет после началасимптомов 17 лет. Хотя большинство случаев спорадические (sALS), около 10% — семейные (fALS), что даёт представление о генетических факторах заболевания. Одним из наиболее изученных генов является супероксиддисмутаза Cu/Zn 1 (SOD1), которая составляет почти 15–20% fALS, менее 2% sALS, и наследуется аутосомно-доминантнымобразом 18. SOD1 кодирует цитоплазматический антиоксидантный фермент, который детоксикирует реактивные виды кислорода, превращая радикалы супероксида в перекись водорода. Мутантные формы SOD1, такие как G93A, A4V и H46R, демонстрируют конформационную нестабильность, что приводит к агрегации белков и токсичному усилению функции, способствующему окислительному стрессу, дисфункции митохондрий и экситотоксичности 19,20,21,22,23,24,25. Кроме того, патология БАС усугубляется неклеточными автономными механизмами, включающими микроглию и астроциты, которые способствуют формированию хронической воспалительной среды и прогрессирующему повреждениюнейронов 26,27,28,29. Таким образом, подавление экспрессии SOD1 с помощью ASO представляет собой перспективный терапевтический путь для смягчения патогенеза заболеваний.

Трансгенная мышиная модель SOD1-G93A (Jax Strain #: 004435), экспрессирующая мутантную форму SOD1 человека G93A под контролем эндогенного промотора SOD1, подробно повторяет клинические характеристики БАС, включая ранние моторные дефициты, нейродегенерацию спинного мозга и сокращениевыживаемости 30. Предыдущие доклинические исследования показали, что введение специфических для SOD1 ASO с помощью устойчивой внутрижелудочковой доставки с помощью осмотических насосов у крыс SOD1-G93A на 65-й день после родов при дневной дозе 100 мкг в течение 28 дней подряд приводит к значительному подавлению уровня SOD1, снижению нейровоспалительных реакций, задержке появления клинических признаков и улучшению моторнойработы 31. Кроме того, снижение SOD1, опосредованное ASO, у людей, живущих с SOD1-ALS, связано со снижением уровня лёгкой цепи нейрофиламента (NfL), биомаркера на основе крови, указывающего на повреждениеаксонов 32. В этом исследовании мы ввели ASO, направленные на SOD1, с помощью ИТ-инъекции мышам SOD1-G93A и оценивали их влияние по молекулярным, электрофизиологическим и биомаркерным показателям. Количественный анализ ткани спинного мозга выявил значительное снижение уровня мРНК SOD1. Электрофизиологические оценки сложных мышечных потенциалов действия (CMAPs) показали сохранение нейромышечной функции. Одновременно уровень NfL в сыворотке снизился, что отражает смягчение продолжающегося повреждения нейронов.

Для оценки пространственного распределения и относительной эффективности альтернативных методов доставки ЦНС мы включили сравнительную группу с применением инъекции внутримозговой бровентрикулярной (ICV), при которой терапевтический агент вводится в латеральные желудочки для распространения через циркулярное течение по эпендимальной и периваскулярнойпространствам 33. Сравнивая пути введения ИТ и ИКВ, мы стремились выявить различия в фармакодинамических результатах и таргетировании тканей, тем самым уточняя стратегии применения терапии ASO, направленных на ЦНС. Кроме того, для оценки трансляционной осуществимости мы провели независимые исследования переносимости, включающие до четырёх ИТ-инъекций на животное с интервалом в восемь недель. Во всех протестированных режимах явных признаков дискомфорта или заболеваемости не наблюдалось, что подтверждает переносимость дозировки IT ASO в контексте выживаемости. Эти результаты согласуются с предыдущими данными, показывающими переносимость повторных интратекальных инъекций умышей 34.

Клиническая значимость доставки IT ASO дополнительно подтверждается недавними регуляторными одобрениями tofersen (QALSODY®) для ALS-35, ассоциированного с SOD1. Клинические исследования показали устойчивое взаимодействие мишеней, отражённое в снижении белка CF SOD1, а затем снижением уровня лёгкой цепи нейрофиламента — биомаркера нейроаксонального повреждения. Хотя первичная конечная цель не была достигнута в первоначальном исследовании фазы 3 VALOR, интегрированные анализы, включая открытое расширение, показали потенциальные преимущества более раннего началалечения 35.

В совокупности приведенные данные показывают, что доставка ИТ-таргетируемых ASO, направленных на SOD1, в модели мышей SOD1-G93A ALS обеспечивает эффективное молекулярное снижение, улучшение биомаркеров и сохранение функций с благоприятной переносимостью. Эти результаты поддерживают внедрение ИТ ASO как рациональный и клинически жизнеспособный подход для генетических заболеваний ЦНС и обеспечивают надёжную доклиническую основу для дальнейшего трансляционного развития.

Протокол

Все процедуры здесь были одобрены и проведены в соответствии с одобренными IACUC протоколами и институциональными рекомендациями по химической гигиене и биобезопасности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите исследования трансгенных мышей C57BL/6J (JAX #000664) и SOD1-G93A (JAX #004435), содержащихся в стандартных условиях (12-часовой свет/тёмный цикл, 22-24 °C, импровизация доступа к продукту и воде).

1. Применение химически модифицированных ASO для воздействия на человеческий SOD1

  1. Использование валидированных антисмысловых олигонуклеотидов (ASO) для целенаправленного воздействия нуклеотидов 613-629 в 3'-нетранслированной области (UTR) гена SOD1 человека (RefSeq: NM_000454.5)36: A*GoToG*T*T*T*A*A*T*G*T*ToToA*T*C
  2. Включать валидированные химические модификации для повышения стабильности и эффективности путём включения MOE (2'-O-метоксиэтил) (обозначен обычным шрифтом), cEt (ограниченный этил) (курсив), ДНК (жирный), фосфатные связи (o) и фосфоротиоатные связи (*), как сообщалось ранее36. Дополнительный файл 1 представляет химию ASO с соответствующим цветовым кодированием.
  3. Подготовьте нецеленаправленную контрольную ASO без комплементарности к геному человека или грызунов, используя ту же схему модификации для использования в качестве контроля: C*CoToAoT*A*G*A*C*T*A*T*C*C*AoGoGoA*A

2. Подготовка и обработка ASO-решений в стерильных условиях

  1. Восстановление ASO в стерильной искусственной спинномозговой жидкости (aCSF; Таблица 1) до концентрации 10 мг/мл в стерильных условиях, с целью конечного объёма инъекции 10 мкл (100 мкг) на животное.
  2. Аккуратно смешайте раствор стерильной пипеткой для сохранения целостности молекулы, затем слегка выкрутите в течение 5-10 секунд, чтобы хорошо перемешать.
  3. Фильтруйте разбавленный раствор через стерильный шприцовый фильтр диаметром 0,2 мм для удаления частиц и загрязнителей.
  4. Асептически аликвотируйте окончательный раствор в стерильные микроцентрифугальные трубки и храните при 4 °C в контролируемом термоконтролируемом устройстве до 1 недели, избегая циклов замораживания и оттаивания для поддержания стабильности.

3. Подготовка мыши перед интратекальной инъекцией

  1. Взвесьте каждую мышь до ближайших 0,1 г с помощью цифровых весов, затем перенесите на носовой конус и индуцируем анестезию изофлураном при концентрации 2-2,5% кислорода; Постоянно отслеживайте глубину и подтверждайте хирургическую плоскость по потере педального рефлекса.
  2. Подготовьте термостатически контролируемую грелку и установите её на 37 °C для поддержки мышей во время подготовки и восстановления.
  3. Нанесите офтальмологическую смазку на оба глаза сразу после анестезии, чтобы предотвратить высыхание роговицы. Затем поставьте мышь в вентральное положение на грелке, чтобы предотвратить переохлаждение, минимизировать физиологический стресс и поддерживать нормальные сердечно-сосудистые и дыхательные функции на протяжении всей процедуры.
  4. Вводите бупренорфин с продленным высвобождением инъекционной суспензии (1,3 мг/мл) подкожно в дозе 3,25 мг/кг с помощью стерильного шприца с иглой 25 г и вводите 0,05 мл на 20 г массы тела перед процедурой.
  5. Сбрийте поясничную область от середины до тазового пояса, затем продезинфицируйте область чередующимися палочками изопропилового спирта и повидон-йода, повторите это три раза и дайте месту полностью высохнуть на воздухе.

4. Прямая интратекальная инъекция

  1. После анестезии и подготовки места операции переместите мышь в чистую зону для инъекции и положите её в вентральное положение на грелку.
  2. Поместите мышь в положение, где позвоночник выгибается, чтобы облегчить пальпацию и инъекцию.
    1. Вставьте изогнутую лопатку под брюшком на уровне нижней груди и верхней поясницы, чтобы вызвать лёгкое сгибание позвоночника и расширить межпозвоночные пространства между пятой и шестой (предпочтительно L5-L6) или четвёртой и пятой (L4-L5) пластинками.
    2. Продвигайте скос иглы между пластинками, чтобы попасть в поясничный цистерна и получить доступ к субарахноидальному пространству, избегая прямого контакта с костью для повышения безопасности и точности инъекций.
  3. Стабилизируйте тазовый пояс, аккуратно обхватив тазовый пояс между большим и указательным пальцами одной руки и пальпировав спинную среднюю линию другой рукой, чтобы определить целевое межпозвоночное пространство между L4-L5 или L5-L6.
  4. Выровняйте стерильный инсулиновый шприц объёмом 0,3 мл, оснащённый иглой 29-G, 1/2 дюйма, перпендикулярной к поверхности спинной кожи или под углом 70-80°, при этом фаска будет ориентирована черепно. Продвигайте иглу до небольшого сопротивления при проникновении твердой мозговой мозговой мозги, затем продолжайте в интратекальное пространство.
  5. Вводите ровно до тех пор, пока кончик не войдёт в интратекальное пространство, что подтверждается рефлексом взмаха хвоста, указывающим на успешное вход в интратекаль.
  6. Если наблюдается значительное сопротивление или нет рефлекса взмаха хвостом, убрате иглу, заново определите анатомические ориентиры и скорректируйте расположение иглы перед повторной попыткой инъекции. Если первоначальная попытка была выполнена в межпозвоночном пространстве L5-L6, затем выполните последнюю попытку в межпозвоночном пространстве L4-L5.
  7. Вводите 10 мкл раствора ASO медленно (более 10 секунд), чтобы минимизировать изменения давления и избежать рефлюкса СМС. Иглу можно удерживать на месте ещё 10 секунд после инъекции.
  8. Аккуратно вытягивайте иглу вертикально и плавно, чтобы предотвратить повреждение тканей и обратный поток.
  9. Постоянно наблюдайте за мышью в период восстановления, наблюдая за дыханием, моторной функцией, осанкой и признаками боли или страдания.
  10. Убедитесь, что мышь восстановила нормальную подвижность и поведение, прежде чем вернуть её в домашнюю клетку.
  11. Документируйте все соответствующие процедурные детали, включая место инъекции, дозу ASO, объём инъекции и любые поведенческие или физиологические наблюдения во время и после процедуры, в соответствии с протоколами IACUC.

5. Мониторинг мышей и поддержка восстановления после инъекции

  1. Поместите каждую мышь в отдельный или хорошо расположенный отсек в предварительно нагретой камере восстановления с температурой 37 °C.
  2. Держите температуру камеры под контролем во время восстановления после анестезии, чтобы предотвратить гипотермию.
  3. Постоянно отслеживайте частоту дыхания и паттерны, осанку и реакцию на тактильные стимулы.
  4. Наблюдайте за мышью, пока она не восстановит рефлекс выпрямления и не проявит скоординированные движения.
  5. Избегайте переполнения, чтобы обеспечить хорошую видимость и предотвратить помехи.

6. Определение критериев возвращения в домашнюю клетку

  1. Убедитесь, что мышь стабильна с координированным спонтанным движением.
  2. Убедитесь, что нет признаков дискомфорта, включая затруднённое или нерегулярное дыхание, вокализацию и длительное отсутствие реакции.
  3. Обеспечивайте мягкую пищевую поддержку, например, полноценную гелевую диетическую добавку, чтобы поддерживать гидратацию и потребление калорий с минимальными усилиями.

7. Проведение послевосстановленных наблюдений за мышами

  1. Проверяйте нормальное поведение, такое как исследование, уход и социальное взаимодействие, если мыши содержатся в группе.
  2. Постоянно следите за признаками аномального восстановления, таких как необычная осанка, слабость или паралич, нерегулярное дыхание или снижение реакции, и своевременно переоценивайте, если эти симптомы появляются.
  3. Обратитесь за ветеринарной помощью, если восстановление задерживается или нарушено.

8. Инъекция внутри мозгового желудочка в латеральный желудочек с использованием стереотаксичной хирургии и послеоперационного ухода

ПРИМЕЧАНИЕ: Включить сравнительную группу с использованием инъекции в мозговой бровенулучечку (ICV) для оценки пространственного распределения и относительной эффективности, доставки ASO в латеральные желудочки для распространения, опосредованного СМС, и сравнения с интратекальной доставкой. Выполнять инъекции ICV согласно хорошо устоявшимся, стандартизированным протоколам длямышей 37.

  1. Анестезируйте мышь изофлураном в концентрации 2-2,5 % кислорода для неподвижности и разместите мышь в вентральное положение на грелке, а затем подкожно введите бупренорфин с пролонгированным высвобождением инъекционной суспензии (1,3 мг/мл бупренорфина гидрохлорида) подкожно в дозе 3,25 мг/кг стерильным шприцем объёмом 1 мл с иглой 25 г при 0,05 мл на 20 г массы тела перед процедурой. Побрийте кожу головы мыши машинкой.
  2. Проводите все хирургические процедуры под анестезией. Поддерживайте стерильное асептическое поле на протяжении всей операции ICV. Используйте только стерильные инструменты и обращайтесь с ними аккуратно, чтобы избежать контакта с нестерильными поверхностями.
  3. Закрепите мышь в стереотаксичной рамке с помощью цифровой консоли в стандартном положении на лёже. Вставьте передние зубы в зубную планку мышиного адаптера, чтобы обездвижить головку, затем закрепите адаптер с помощью дыхательных трубок для вдыхания и выпуска, подающих изофлуран. Вставьте ушные планки в уши и затяните винты, чтобы надёжно стабилизировать головку.
  4. Дезинфицируйте область чередующимися мазками изопропилового спирта и повидон-йода, повторяя три раза, и сделайте разрез по средней линии стерильным скальпелем, чтобы открыть череп. Используйте стерильный хлопковый наконечник для удаления мягких тканей и убедитесь, что брегма хорошо видна.
  5. Отметьте брегму на черепе. Разместите шприц, содержащий ASO, иглом (26-G, 26s/2"/2, с точкой) чуть выше брегмы. Выровняйте иглу по координатам цели: AP -0,3 мм, ML ±1,0 мм, DV -3 мм от поверхности черепа. Отметьте череп на координатах AP и ML.
  6. Создайте отверстие для заусенцев на отмеченных координатах, а затем с помощью стереотаксической рамки опустите иглу шприца на глубину -3 мм от поверхности черепа. Вводите раствор со скоростью 10 мкл/мин, пока не будет получен общий объём 10 мкл. После завершения инъекции держите иглу на месте 4 минуты, затем медленно убирайте её, чтобы минимизировать рефлюкс.
  7. Зашвите разрез на коже головы, поместите мышь в заранее нагретую камеру при 37 °C до полного пробуждения, а затем верните её в домашнюю клетку после подтверждения стабильности. Предоставляйте полноценную гелевую диетическую добавку и постоянно отслеживайте признаки аномального восстановления, такие как необычная осанка, слабость или паралич, нерегулярное дыхание или снижение чувствительности; Немедленно переоцените, если появятся какие-либо из этих симптомов.

9. Электрофизиологическая оценка потенциалов действия сложных мышц (CMAP)

  1. Убедитесь, что экспериментаторы не замечают как генотипа, так и группу обработки каждой мыши, чтобы устранить смещение при сборе и анализе данных.
  2. Обезболить мышь изофлураном для неподвижности и комфорта, а также поддерживать температуру тела на уровне 37 °C.
  3. Подтвердите адекватную анестезию, убедившись в потере педального рефлекса.
  4. Используйте одноразовые монополярные игольчатые электроды 28 G как для стимуляции, так и для записи. Введите записывающий электрод на 1 мм в переднюю большеберцовую мышцу.
  5. Стимулируйте седалищный нерв возле седалищной выемки с помощью 0,1 мс монофазных импульсов квадратной волны, подаваемых каждые 2 секунды, начиная с 1,0 мА и увеличиваясь с шагом 0,5 мА, пока не достигнут супрамаксимальный отклик (обычно 1,5-3,5 мА).
  6. После определения надмаксимального порога фиксируйте ответы CMAP на 0,5 мА выше этого уровня. Измеряйте амплитуду CMAP (от пика к пику) на 0,8 мс после стимула, чтобы исключить задержку, и усреднить амплитуды с левой и правой лапок для каждой мыши.

10. Измерение уровня pNFH в сыворотке

  1. Собрать 100 мкл цельной крови путём пункции вены на лице с помощью капиллярных трубок с активатором тромба и гелем для разделения сыворотки в определённые моменты времени.
  2. Центрифугуйте образцы крови при 2000 г в течение 10 минут при 4 °C для выделения сыворотки.
  3. Количественно определить уровни сывороточных фосфорилированных нейрофиламентов с тяжелой цепью (pNFH) с помощью валидированных иммуноанализированных реагентов для измерения pNFH в биологических образцах на полностью автоматизированном микрофлюидном иммуноанализаторе на картридже.

11. Изоляция РНК и проведение RT-qPCR

  1. Измельчить ткани шейного и грудного спинного мозга мышей с помощью 6-мм стального шарика в криогенной программируемой высокоэнергетической колебательной бусинной мельнице для дробления образца на скорости 1 000–1 200 ударов в минуту в течение 30-40 секунд.
  2. Гомогенизировать измельчённую ткань (15 мг) с помощью керамических шариков диаметром 2,8 мм в лизе на основе фенол-гуанидиния тиоцианата и реагента для экстракции РНК с использованием программируемого высокоскоростного механического гомогенизатора на основе бусинок при скорости 5,62 м/с в течение двух циклов по 30 секунд.
  3. Извлечение полной РНК с помощью обработки ДНКазой на колонке, следуя инструкциям производителя.
  4. Синтезировать кДНК с помощью системы реагентов обратной транскрипции с высокой ёмкостью для синтеза кДНК.
  5. Для обнаружения qPCR разработайте специальные наборы праймеров/зондов для обнаружения интересующего гена, направленного на экзон 4 человеческого гена SOD1:
    передний капсюль (5′-TGGTGTGGGGGGGTGTCTA-3′),
    Обратный праймер (5′-ATGATGCAATGGTCTCCTGAGA-3′)
    зонд (5′-6FAM-TGAAGATTCTGTGATCTCA-MGB/NFQ-3′)
  6. Используйте мышь GAPDH (TaqMan Assay ID: Mm99999915_g1) как ген для уборки.
  7. Проведите qPCR на высокопроизводительном инструменте в реальном времени количественного ПЦР (qPCR) с использованием 20 нг кДНК на реакцию, быстроциклирующей мастер-смеси qPCR на базе зонда, геноспецифических праймеров и флуоресцентно маркированных гидролизных зондов для обнаружения транскриптов домашних (VIC/MGB) и целевых (FAM/MGB) транскриптов.

12. Статистический анализ данных

  1. Представлены данные по измерениям в жизни (CMAP), анализа pNFH в сыворотке и экспрессии генов как среднее ± стандартное отклонение (SD).
  2. Оценить статистическую значимость между групповыми средними средствами с помощью одностороннего ANOVA, затем провести тест множественных сравнений Тьюки, считая p < 0,05 статистически значимым.
  3. Используйте соответствующее программное обеспечение для статистического анализа для создания графиков и проведения всех анализов, соответствующих тем, что были проведены в исследовании.

Результаты

Для тщательной характеристики точности и эффективности интратекального (ИТ) введения у взрослых мышей мы сначала провели фундаментальные валидационные эксперименты с использованием синего красителя Evans (0,5%) как визуального индикатора течения ликвора и проникновения тканей. Взрослые мыши дикого типа C57BL/6J (штамм #000664; вес 25-30 г) были анестезиированы изофлураном (2-2,5%) в кислороде для устранения артефактов движения, а поясничная область была подготовлена в асептических условиях. ИТ-инъекции проводились люмбальной пункцией в субарахноидальное пространство с одиничными восходящими дозами 20 мкл, 30 мкл и 50 мкл для оценки дозы/объёма и зависимости интенсивности окрашивания. Правильное расположение иглы подтверждалось наблюдением движения хвоста или отрицательного сопротивления во время инъекции.

В течение 5 минут после подачи красителя мышей транскардиально перфузировали холодно-фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) для удаления остаточных красителей из сосудистых судов. Позвоночник затем аккуратно извлекали и фотографировали при стандартном освещении на нейтральном фоне. Визуальный осмотр выявил равномерное и равномерное распределение синего цвета Evans Blue у всех мышей, получивших краситель. Более высокие объёмы инъекции коррелировали с усиленной насыщенностью красителем по рострокаудальной оси, хотя даже мышь, введённая объёмом 20 мкл, также демонстрировала устойчивое окрашивание. В отличие от этого, мыши, не получившие синий краситель Эванса (контрольная группа, введенная стерильным физиологическим раствором), не проявили видимой окраски или фоновых окрашиваний в ткани спинного мозга (рисунок 1). Эти результаты показывают, что ИТ-инъекции мышам обеспечивают быструю, воспроизводимую доставку растворённых веществ по спинному мозгу. Ограничениями этих экспериментов являются отсутствие количественной оценки распределения красителя и отсутствие анализа распределения красителя при объёме инъекции 10 мкл, используемом для введения ASO. Однако количественная оценка была проведена в последующих измерениях целевой активности на уровне экспрессии генов у человеческих мышей SOD1-G93A с использованием анализа экспрессии генов, специфичных для человека SOD1. Объём инъекции 10 мкл, использованный в последующих экспериментах для введения ASO, был выбран для обеспечения безопасной и хорошо переносимой дозировки у мышей и, как ожидается, обеспечит достаточное воздействие ЦНС согласно предыдущимисследованиям 38.

Опираясь на эту анатомическую валидацию, мы затем оценили функциональную значимость доставки ИТ с использованием ASO, направленных на мутантный SOD1 — валидированную терапевтическую стратегию в моделях SOD1-ALS. Гемизиготные трансгенные мыши SOD1-G93A, содержащие мутантный ген SOD1 человека, демонстрируют предсказуемую дегенерацию моторных нейронов и упадок нервно-мышечных нервов, что делает их устоявшейся доклинической моделью. В возрасте 5 недель, до начала симптомов, мыши получали один ИТ-болюс специфического SOD1 ASO с концентрацией 100 мкг в 10 мкл. Эта доза была выбрана на основе предыдущих оптимизационных исследований, проведённых с применением ICV у мышей, как сообщают McCampbell и др. (2018)36. Для сравнения эффективности между ИТ и доставкой ICV отдельная группа получила инъекции ICV той же дозы ASO с использованием стереотаксической доставки. Органы управления получали неактивный ASO (нецеленаправленное управление) через ИТ-канал.

Через пять недель после лечения (в возрасте 10 недель) мыши проходили тестирование на композитный мышечный потенциал действия (CMAP) под лёгкой анестезией изофлурана. Записи CMAP из мышц задних конечностей, полученные стандартизированными протоколами стимуляции седалищного нерва, показали значительное сохранение амплитуды как в группах, проходящих с ИТ, так и в группах с ИКВ, по сравнению с неактивными контролями, обработанными ASO, (p < 0,0001 с помощью одностороннего ANOVA с пост-хок тестом Тьюки). Важно, что сохранение амплитуды не отличалось существенно между методами доставки ИТ и ИКВ (p > 0,05), что указывает на сопоставимую защиту нервно-мышечной системы (рисунок 2A).

Для оценки системных биомаркеров целостности нейронов были измерены уровни в сыворотке с помощью высокочувствительного электрохемилюминесцентного анализа с фосфорилированными нейрофиламентами (pNFH). Образцы крови, полученные в течение 5 недель после инъекции, показали >40% снижение концентрации pNFH у мышей, обработанных ASO, по сравнению с контролями, обработанными транспортными средствами (p < 0,0001), при этом существенных различий между методами IT и ICV не наблюдалось (рисунок 2B). Однородный ответ молекулярных биомаркеров подтверждает электрофизиологические данные, что свидетельствует о эффективной передаче ИТ-системы для снижения нейродегенеративных процессов в этой модели БАС.

Для оценки воздействия SOD1-ASO на молекулярном уровне мы провели количественное ПЦР обратной транскрипции (RT-qPCR) на рассечених тканях шейного и грудного отдела спинного мозга. Общая РНК экстракцировалась с помощью протокола на основе столбцов, обеспечивающего высокую чистоту (A260/A280>1.8), после чего следовал синтез кДНК с случайным гексамерным праймом. Количественная амплификация ПЦР, направленная на человеческие транскрипты SOD1, нормализированная до GAPDH, показала среднее снижение 60% после доставки ИТ и 35% после доставки ICV, что значимо по сравнению с неактивными контролями ASO (p < 0,0001 для обоих). Прямое сравнение маршрутов доставки показало значительно большее снижение ИТ-доставки (p < 0,0001), что свидетельствует о более эффективном поражении мишени в спинном мозге через прямой доступ к позвоночнику (рисунок 3). Необходимы дальнейшие исследования для оценки вовлечения целей в других регионах ЦНС.

В совокупности эти обширные данные обеспечивают убедительное подтверждение того, что ИТ-инъекции являются точными, воспроизводимыми и минимально инвазивными методами доставки ASO в центральную нервную систему (ЦНС) в мышиных моделях. Введение ИТ продемонстрировало терапевтическую эффективность, сопоставимую с доставкой ICV по широкому спектру показателей результатов, включая устойчивое сохранение неврологической функции (CMAP), нормализацию биомаркеров, релевантных к заболеваниям (pNFH), и устойчивое молекулярное снижение человеческих транскриптов SOD1 в целевых областях ЦНС. Эти результаты подчёркивают универсальность ИТ-доставки как клинически переводимого пути для терапии ASO, направленных на ЦНС, обеспечивая эффективность, сопоставимую с ICV, при этом сохраняя процедурную простоту и снижая инвазивность. Таким образом, проведение ИТ и ICV являются одинаково жизнеспособными подходами для вмешательств, направленных на ЦНС, предлагая гибкость в доклинических условиях в зависимости от анатомической доступности, процедурной возможности и терапевтического контекста. Это позиционирует IT-доставку как перспективную платформу для перевода для будущих терапий, направленных на ЦНС. Для поддержки трансляционных усилий мы предлагаем провести дополнительные доклинические исследования для оценки фармакокинетического распределения в спинномозговой жидкости, различных областях ЦНС и поглощения целевых клеток с использованием таких методов, как флуоресцентная гибридизация in situ или иммунофлуоресценция.

Рисунок 1
Рисунок 1: Визуализация распределения синего красителя Эванса после интратекальной инъекции у взрослых мышей. Evans Blue Dye (0,5%) вводили через прямую интратекальную (IT) инъекцию взрослым мышам для качественной оценки его распределения в спинном мозге. Три разных объёма красителей — 20 мкл, 30 мкл и 50 мкл — были введены в отдельных экспериментальных группах (n = 1 мышь на объём). После инъекции спинной мозг был взят и промыван для оценки проникновения красителя по интенсивности окрашивания вдоль ткани. Изображения ткани спинного мозга показывают степень рассеивания красителя при каждом объёме инъекции, демонстрируя увеличение покрытия и интенсивность окрашивания, зависящее от объёма дозы, по всему спинному мозгу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2: Антисенсовая олигонуклеотидная терапия, направленная на SOD1, восстанавливает моторную функцию и снижает уровень патологических нейрофиламентов у мышей. Взрослые трансгенные мыши SOD1-G93A получали одну дозу активного антисенсового олигонуклеотида (SOD1-ASO) через интратекальную (IT) или интрацеребровентрикулярную (ICV) инъекцию в возрасте 5 недель, либо неактивную контрольную ASO с помощью IT-инъекций. Терапевтический эффект оценивался в возрасте 10 недель, что соответствует 5 неделям после лечения. (A) Для оценки нейромышечной функции у лечённых животных были получены записи потенциала действия составных мышц (CMAP). Группы, обработанные SOD1-ASO (n = 5 - 6 на группу) показали обратное снижение CMAP по сравнению с контрольной группой, что указывает на функциональное восстановление. (B) Периферические уровни фосфорилированной нейрофиламентной тяжёлой цепи (pNFH), биомаркера нейродегенерации, были количественно измерены из сыворотки, собранной на 10-й неделе (n = 5 - 8 на группу). Лечение SOD1-ASO привело к значительному снижению циркулирующего уровня pNFH по сравнению с контролем, что свидетельствует о снижении нейронного повреждения, связанного с заболеванием. Все данные представлены в виде среднего ± SD. Статистическая значимость была определена с помощью одностороннего анализа дисперсии (ANOVA), за которым последовал тест множественных сравнений Тьюки, при этом p-значения ≤ 0,0001 указывали на устойчивые различия между группами лечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Введение SOD1-ASO значительно подавляет экспрессию мРНК SOD1 человека в трансгенном спинном мозге SOD1-G93A мыши. Для оценки эффективности таргетирования антисенс-олигонуклеотида (SOD1-ASO), доставляемого через интратекальную (IT) или интрацеребровентрикулярную (ICV) инъекцию, шейный/грудной отдел ткани спинного мозга у трансгенных мышей SOD1-G93A, эвтаназии в возрасте 10 недель (через 5 недель после введения), был проанализирован на экспрессию мРНК SOD1 человека с помощью обратной транскрипции количественной полимеразной цепной реакции (RT-qPCR). Уровни транскрипта SOD1 у человека были количественно измерены и нормализованы относительно экспрессии в группе, обработанной неактивной ASO. На рисунке показано изменение складки в мРНК SOD1 человека (нормализованной до GAPDH) для каждой группы лечения (n = 5-7 мышей на группу), что подчёркивает значительное снижение регуляции в ответ на введение SOD1-ASO. Данные представлены в виде среднего ± SD. Статистические различия между группами были определены с помощью одностороннего анализа дисперсии (ANOVA), за которым последовал тест множественных сравнений Тьюки, при этом p-значения ≤ 0,0001 указывали на устойчивые различия между группами лечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

КомпонентFWСумма сложения (на литр или кг)Подразделения
Монобазовый дигидрат натрия фосфата0.034g
Натрий-фосфат без воды1420.111g
Хлорид натрия58.448.766g
Хлорид калия74.560.224g
Хлорид кальция дигидрат147.020.206g
Гексагидрат хлорида магния0.163g
Вода (Milli-Q)993g
Poloxamer 1880.01g

Таблица 1: состав aCSF.

Дополнительный рисунок 1: Позиционирование мыши для инъекции в поясничную интратекальную инъекцию. Изогнутая лопатка или скупула, размещённая под брюшком, сгибает позвоночник, расширяя межпозвоночное пространство. Инъекция направлена на уровень L4-L5 или L5-L6, с правильным выравниванием вдоль медиальной оси позвоночника, как показано. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Дополнительный файл 1: ASO последовательность и химия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Техника прямой интратекальной (ИТ) инъекции, представленная здесь, представляет собой минимально инвазивный, но очень эффективный метод доставки терапевтических препаратов в центральную нервную систему (ЦНС), особенно у мелких грызунов, таких как мыши. Эта процедура слепой палки технически сложна, но доказала свою воспроизводимость и клиническую значимость при выполнении обученным инжектором. Этот метод использует точную анатомию и эффективную технику для обеспечения быстрого доступа к ЦНС без необходимости катетеризации, что является важным упрощением с существенными преимуществами для расширения доклинических исследований; Однако её трансляционная значимость получит выгоду от дальнейшей количественной оценки и стандартизированной методологическойвалидации 5,8,10.

Успешная ИТ-инъекция зависит от нескольких ключевых этапов. Тщательная подготовка животных крайне важна: анестезия сначала индуцируется в камере и поддерживается с помощью носового конуса, затем брить поясничную область и вводить обезболивающие для обеспечения комфорта животного. Правильное положение мыши достигается за счёт размещения изогнутой лопатки под брюшком, сгибающего позвоночник для расширения межпозвоночного пространства (дополнительный рисунок 1). Цель интратекальной инъекции, описанной здесь, — разместить фаску иглы внутри поясничного цистерны, продвигая её между пластинками на соответствующем уровне позвоночника. Точное наведение межпозвоночного пространства между пластинками L4 и L5, или, желательно, слойки L5 и L6, критически важно для доступа к субарахноидальномупространству 5,10. Субарахноидальное пространство, также называемое интратекальным, находится между арахноидальной и pia mater39. Поскольку спинной мозг короче позвоночного канала, сегменты хвостового мозга расположены более рострально относительно соответствующих уровней позвоночника. Чтобы избежать неоднозначности, места инъекций обозначаются межпозвоночным пространством, а не уровнем спинного мозга. Примечательно, что существует значительная вариабельность сегментации поясничных позвонков у мышей как внутри, так и междуштамми 40. Инъекция должна проводиться вдоль средней линии позвоночника, чтобы избежать бокового отклонения, которое может привести к парезу задней конечности или, в тяжёлых случаях, к параличу из-за травмы спинного мозга. При правильном анатомическом участке риск прямого повреждения спинного мозга минимален. Однако сохраняется небольшой риск раздражения или повреждения корня нерва, что подчёркивает важность адекватной подготовки оператора и процедурного мастерства для минимизации неблагоприятных последствий. Рефлекс взмаха хвоста служит полезным индикатором успешной установки иглы, позволяя инжектору оценивать глубину и избегать поверхностного или чрезмерно глубокого проникновения. Эта техника требует практики, необходимого постоянного контроля глубины, угла и объёма инъекции, чтобы избежать обратного потока и протечки в окружающие ткани. Хотя мы рекомендуем сохранять объём инъекции ≤10 мкл, мы оценили до 20 мкл без побочных эффектов. Предыдущие исследования определили объём интратекальной инъекции 10 мкл как оптимальный для доставкилекарств 38. Хотя это составляет 25–30% от общего объема ликвора умышей 41,42, максимальный допустимый интратекальный объём инъекции у взрослых мышей составляет 30мкл 10. Объёмы инъекций, превышающие рекомендуемые пределы, могут нарушать динамику спинномозговой жидкости (СМЖ), что приводит к снижению давления ликвора и повышению риска побочных эффектов. Общий объём ликворовой жидкости у мышей оценивается в 35-40 мкл и меняется 12-13 раз вдень 41,42, что соответствует полному обновлению примерно каждые 1,8 ч42,43. Учитывая быстрый оборот спинномозговой жидкости и эмпирические наблюдения, а также предыдущие исследования, демонстрировавшие безопасное использование интратекальных инъекций до 20-30 мкл без осложнений, объём инъекции 10 мкл не ожидается вызывать побочныхэффектов 10,44.

Масштабируемость — значительное преимущество этой техники. После освоения обученные инжекторы могут лечить 10–12 животных в час, что позволяет проводить более масштабные доклинические исследования без логистических затрат имплантации катетера или более инвазивных хирургических методов. Процедура избегает сложных инструментов, снижает стресс у животных и сокращает время восстановления по сравнению с хронической катетеризацией, что делает её пригодной для лонгитюдных исследований, требующих повторного дозирования. Для моделирования клинических схем дозирования мы подтвердили серийные ИТ-введения у мышей, вводя до четырёх доз с интервалом в восемь недель. Эти инъекции хорошо переносились, не имели признаков стресса, изменений в поведении или признаков болезни, что соответствует предыдущим исследованиям, которые не сообщали о значимых изменениях в динамике СМЖ или архитектуре спинного мозга после многократных ИТ-процедур34,45. Таким образом, наши исследования подтверждают, что повторное дозирование ИТ возможно с подходящими интервалами, что соответствует парадигмам лечения человека, где для терапевтической пользы необходимо устойчивое воздействие мишеней. По нашему опыту, эти повторные IT-инъекции успешно проводились в широком возрастном диапазоне от 5 до 29 недель. Хотя увеличение возраста и массы тела может немного повлиять на доступность спинного мозга из-за увеличения подкожной ткани, успешное введение по-прежнему возможно с опытным оператором, который хорошо владеет техникой и хорошо знаком с ощущением установки иглы. Однако мы отмечаем, что несколько факторов, выходящих за рамки места инъекции и объёма болюса, в частности скорости инъекции и физических свойств вводного раствора, таких как плотность относительно СМС, могут существенно влиять на распределение растворённых веществ внутри ЦНС. Хотя эти параметры не были напрямую измерены и не изменялись в настоящем исследовании, недавние исследования Линнингера и др. (2023) демонстрируют с помощью механистической фармакокинетической модели, что такие факторы существенно влияют на биораспределение интратекального антисенсового олигонуклеотида (ASO) и таргетированиетканей 46. Соответственно, мы признаём это как ограничение нашего исследования и выделяем скорость инъекции и свойства раствора как важные переменные для будущих исследований с целью оптимизации доставки ЦНС и трансляционной значимости. Вместе эти результаты подчёркивают надёжность и осуществимость повторного ИТ-дозирования в многодозных доклинических парадигмах, поддерживая его использование для устойчивого взаимодействия целей и трансляционного моделирования терапевтических схем человека.

ИТ-подход также обеспечивает гибкость в терапевтическом тестировании. Он охватывает широкий спектр методов, включая ASO, малые молекулы, пептиды и вирусные векторы, что позволяет напрямую оценивать вмешательства, направленные на ЦНС. Возможность вводить точные, контролируемые объёмы терапевтических средств в поясничный резервуар обеспечивает эффективное воздействие спинного мозга и более широкое воздействие ЦНС, одновременно ограничивая системное распространение. Рефлекс взмаха хвоста и другие процедурные сигналы позволяют в реальном времени проверять успешную интратекальную поставку, что дополнительно повышает воспроизводимость и снижает вероятность неудачэкспериментов 5,6,8,47.

Предыдущие исследования на мышах SOD1-G93A показали, что патология заболевания заметно поражает спинной мозг, особенно поясничную область, чем кору29,48. Поэтому этот метод особенно актуален в контексте SOD1-ALS — генетической формы БАС, вызванной мутациями в гене супероксиддисмутазы 1 (SOD1). Эти мутации вызывают неправильно свернутые белковые агрегаты SOD1, что приводит к токсичному усилению функции в моторных нейронах и прогрессирующему снижению нервно-мышечногоупадка 49,50. В этом исследовании мы использовали ASO, нацеленные на SOD1, чтобы продемонстрировать успешное взаимодействие с мРНК и функциональное восстановление. RT-qPCR-анализ показал значительное подавление человеческих транскриптов SOD1 в спинном мозге после введения ИТ, в то время как записи CMAP показали обратимость дисфункции моторных нейронов. Кроме того, анализ сыворотки показал снижение уровня фосфорилированных нейрофиламентов с тяжелыми цепями (pNFH), биомаркера нейродегенерации, что усиливает эффективность терапевтической стратегии.

Клиническая значимость этой модели подчёркивает недавнее одобрение FDA препарата tofersen (QALSODY),® ASO, предназначенного для таргетирования мРНК SOD1 для лечения SOD1-ALS35. Тоферсен вводится интратекально у людей, живущих с SOD1-ALS, и демонстрирует явную фармакодинамическую активность, включая снижение общего уровня белка CF SOD1 (косвенный маркер поражения цели) и NfL в плазме (маркер аксонального повреждения и нейродегенерации). В интегрированных анализах третьего этапа исследования VALOR и его OLE более раннее начало лечения тоферсеном было связано с уменьшением снижения показателей клинической функции, силы и качества жизни, а также снижением риска событий, эквивалентныхсмерти 35. Эти данные подтверждают интратекальный путь как мощный путь для терапии ASO, направленной на ЦНС, и придают значительный трансляционный вес доклиническим исследованиям с использованием аналогичных стратегий доставки.

Помимо своей полезности при БАС, ИТ-путь показал успех при атрофии спинальной мышцы (SMA)14,51,52, где ИТ-применяемый ASO Nusinersen (Spinraza®) стал первым одобреннымлечением 14,51,52. ИТ-инъекции обходят гематоэнцефалический барьер и обеспечивают широкое распространениеЦНС 53, что критически важно для заболеваний, характеризующихся диффузной нейронной патологией. Хотя повторное дозирование создает логистические и переносимые трудности, достижения в формулировании и методах доставки продолжают делать применение ИТ более жизнеспособным для долгосрочного лечения.

Администрирование ИТ имеет большую трансляционную значимость для клинической практики людей, чем инъекции ICV. ICV и IT инъекции у взрослых мышей различаются главным образом по их целевому расположению в ЦНС, а также по распределению и эффектам введённого вещества. Инъекции ICV вводят вещества непосредственно в спинномозговую жидкость (СМЖ) в латеральных желудочках мозга, в основном нацелено на сверхспинальные участки. В отличие от этого, ИТ-инъекции вводят вещества в спинномозговую субарахноидальную область, главным образом направленные на спинной мозг. Хотя оба метода обходят гематоэнцефалический барьер и позволяют осуществлять прямую доставку ЦНС, введение ИТ может привести к увеличению продолжительности действия54 для некоторых соединений и обычно приводит к более сильной трансдукции в спинном мозге, тогда как ICV может достигать высокой локальной концентрации в областях мозга, прилегающих клатеральному желудочку 54. Однако важно отметить, что соединения, вводящиеся в спинномозговую спинномозговую спину, могут достигать мозга, хотя скорость транспортировки оченьмедленная 1. Эти различия также отражаются в процедурных рисках. Инъекции ICV имеют более высокий риск заражения при нарушении стерильности, тогда как ИТ-инъекции, хотя и не безопасны, имеют меньше уязвимостей, связанных с устройствами. После процедуры инъекции ИТ могут вызывать временный дискомфорт или реакции, связанные с задними конечностями, тогда как инъекции ИВВ сопровождаются менее немедленным дискомфортом, хотя локальное раздражение черепа остаётся возможным.

Будущие применения этой техники выходят за рамки текущих доклинических исследований. Доставка ИТ может использоваться для оценки терапии, направленных на ЦНС следующего поколения, включая инструменты редактирования генов (например, системы CRISPR/Cas), методы интерференции РНК и генные терапии на основе вирусных векторов. Подход адаптируем для комбинированных терапий, направленных на несколько путей ЦНС, позволяя в реальном времени оценивать фармакодинамическиевзаимодействия 55,56. Кроме того, ИТ-администрирование может быть интегрировано с методами визуализации для отслеживания распределения и целевого взаимодействия in vivo, ускоряя трансляционные процессы. Этот метод также предоставляет платформу для изучения стратегий прецизионной медицины на генетически определённых мышиных моделях неврологических заболеваний, облегчая обнаружение биомаркеров, продольные функциональные оценки и оценки безопасности перед клинической трансляцией.

В заключение, техника прямой поясничной ИТ-инъекции с использованием изофлурановой анестезии представляет собой минимально инвазивный, быстрый и клинически переводимый метод введения терапевтических средств в ЦНС мыши. Его успешное применение в моделях SOD1-ALS и совместимость с серийным дозированием создают прочную основу для более широкого внедрения в исследованиях трансляционной нейронауки. По мере развития отрасли с растущим акцентом на модуляцию генов ЦНС, РНК-таргетированные терапии и прецизионную медицину, ИТ-путь останется ключевой стратегией доставки лекарств, связывая доклинические модели с клиническим успехом.

Раскрытие информации

SM и S-C L являются действующими сотрудниками Biogen, Inc., а TC, DF, YL, JD и MZ — бывшими сотрудниками компании. Антисмысловые олигонуклеотиды, обсуждаемые в этой статье, были предоставлены авторам компанией Ionis Pharmaceuticals. Tofersen (QALSODY) — это совместно разработанный продукт Biogen и Ionis Pharmaceuticals.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить компанию Ionis Pharmaceuticals за поставку ASO, описанных в статье. Мы благодарны Райану Гэмблу, Стиву Гарафало, Адрии Мартиг, Изабель Исазе, Тарасу Тучкевичу и Дэвиду Коске из Biogen за их экспертный вклад, который значительно обогатил рукопись благодаря их существенным правкам.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,3 мл 29 Г, инсулиновый шприц диаметром 1/2 дюйма для ИТ-инъекцииSmiths Medical4429-3
Стерильный бур диаметром 0,5 ммFine Science Tools (FST) или эквивалент1900705
5-0 Монофиламентный шов из проленаEthicon 8870H 
Спиртовые палочкиДинарекс1203
Спиртовые палочкиДинарекс1203
Анальгетик — Бупренорфин с пролонгированным высвобождениемТребуется рецепт
Машинка для животныхВаль08787-450A
Комплект для обратной транскрипции высокоёмких кДНК Applied BiosystemsFisher Scientific43-688-14
Гомогенизатор Bead Ruptor 24Omni International, Inc.19-070
Анализ крови и отдельные трубки сывороткиБектон Дикинсон (BD)365967
Хлорид кальция дигидратДжей Ти Бейкер1335
Цифровой шприцовый насосАппаратура Гарварда70-4507
Автоматизированная система иммуноанализа EllaR& D Systems600-100
Глазная мазь — PuralubeДекра17033-211-38
Geno/GrinderSPEX SamplePrep2010
Dry-стерилизатор Germinator 500Braintree Scientific, или эквивалентGER 5287-120V
Шприц Hamilton с иглой (26s/2"/2 (наконечник)Гамильтон8030026s/2"/2:                                                                                              26 с: 26 G;                                                                                                             Длина 2";                                                                                                                             2: стиль точек
Твердая ткань для гомогенизации 2,8 мм керамическая (2 мл усиленные трубки) (50/пк)Fisher Scientific50-280-9286Поставщик: Revvity Health Sciences Inc
ГрелкаK& H Manufacturing1060
Платформа ICVШтёльтинг502063
Камера изофлурана с системой скавангаVetEquip901820
Магний хлорид геагидратEMD Chemicals1.05832
Ножницы МетценбаумаFine Science Tools (FST) или эквивалент14016-14
Mouse GAPDH TaqMan Assay ID Mm99999915_g1ThermoFisher Scientific4331182
Игольчатые электроды для CMAP, 28 GNatus Medical (бренд Teca)#902-DMF25-TP
NutraGel: полноценное питаниеBio ServNGB-2
Держатель для игл Олсен-ХегарFine Science Tools (FST) или эквивалент12502-12
Poloxamer 188Мутчлер
Хлорид калияДжей Ти Бейкер3045
Предусилитель (для CMAP)Мировые прецизионные приборы (WPI)SYS-DAM50
Набор pNFH ProteinSimpleR& D SystemsSPCKB-PS-000519
Провидон-йодидные палочкиДинарекс1201
QIAзол Лизис Реагент Цягэн79306
Система QuantStudio 12K FlexПрикладные биосистемы4471087
СкупулаФишербранд01-257-567
Signal v6.04Cambridge Electronic DesignСерийный номер 061144CMAP Software 
Камера для извлечения мелких животныхПереносные отделения интенсивной терапии животных Thermocare модели FW-1FW-1 
Стереотаксичная рама для мелких животных с цифровой пультомKOPFМодель 940 
Мыши SOD1 G93AЛаборатория ДжексонаЗапас # 004435
Хлорид натрияEMD Chemicals1.16224
Натрий-фосфат без водыСигма Олдрич55136
Монобазовый дигидрат натрия фосфатаСигма Олдрич3819
Стерильный одноразовый скальпельMed Vet International или эквивалентMIL4410
Стерильная драпировкаДинарекс4410
Стерильные марлевые подушечкиДинарекс или эквивалентDRX-3354
Стерильный физиологический растворThermoFisher Scientific14190094
Стерильные хирургические перчаткиАнселл или эквивалент20277290
Изолатор стимулов (для CMAP)Мировые прецизионные приборы (WPI)SYS-A365D
Stoelting Micro Drill Штёльтинг58610
Хирургические изогнутые щипцы (щипцы Graefe — титан)Fine Science Tools (FST) или эквивалент11652-10
Хирургические щипцы (Graefe Pinps - Titanium)Fine Science Tools (FST) или эквивалент11650-10
Хирургическая лентаДинарекс или эквивалент3572
Шприц для подкожной инъекции обезболивающегоBD309582
TaqMan Fast Advanced Master MixThermoFisher Scientific4444556
Вода (Milli-Q)
Весы для взвешиванияМеттлер Толедо                                        Модель XSR2002S23-112795
Дикие мыши типа C57BL/6JЛаборатория ДжексонаЗапас # 000664

Ссылки

  1. Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. Eur J Pharmacol. 67 (2-3), 313-316 (1980).
  2. Li, D., Li, Y., Tian, Y., Xu, Z., Guo, Y. Direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice. J Vis Exp. (144), e58565(2019).
  3. Banks, W. A. Characteristics of compounds that cross the blood-brain barrier. BMC Neurol. 9 Suppl 1 (Suppl 1), S3(2009).
  4. Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx. 2 (1), 3-14 (2005).
  5. Ajeeb, R., Clegg, J. R. Intrathecal delivery of macromolecules: clinical status and emerging technologies. Adv Drug Deliv Rev. 199, 114949(2023).
  6. Bennett, C. F., Swayze, E. E. RNA targeting therapeutics: molecular mechanisms of antisense oligonucleotides as a therapeutic platform. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 50, 259-293 (2010).
  7. Corey, D. R. Nusinersen, an antisense oligonucleotide drug for spinal muscular atrophy. Nat Neurosci. 20 (4), 497-499 (2017).
  8. Bey, K., et al. Efficient CNS targeting in adult mice by intrathecal infusion of single-stranded AAV9-GFP for gene therapy of neurological disorders. Gene Ther. 24 (5), 325-332 (2017).
  9. Kennedy, Z., Gilbert, J. W., Godinho, B. Intrathecal delivery of therapeutic oligonucleotides for potent modulation of gene expression in the central nervous system. Methods Mol Biol. 2434, 345-353 (2022).
  10. Stavrou, M., Georgiou, E., Kleopa, K. A. Lumbar intrathecal injection in adult and neonatal mice. Curr Protoc. 4 (6), e1091(2024).
  11. Zou, Z. Y., Liu, C. Y., Che, C. H., Huang, H. P. Toward precision medicine in amyotrophic lateral sclerosis. Ann Transl Med. 4 (2), 27(2016).
  12. Quemener, A. M., et al. The powerful world of antisense oligonucleotides: from bench to bedside. Wiley Interdiscip Rev RNA. 11 (5), e1594(2020).
  13. Rook, M. E., Southwell, A. L. Antisense oligonucleotide therapy: from design to the Huntington disease clinic. BioDrugs. 36 (2), 105-119 (2022).
  14. Neil, E. E., Bisaccia, E. K. Nusinersen: a novel antisense oligonucleotide for the treatment of spinal muscular atrophy. J Pediatr Pharmacol Ther. 24 (3), 194-203 (2019).
  15. Amanat, M., Nemeth, C. L., Fine, A. S., Leung, D. G., Fatemi, A. Antisense oligonucleotide therapy for the nervous system: from bench to bedside with emphasis on pediatric neurology. Pharmaceutics. 14 (11), 2389(2022).
  16. Kingwell, K. Double setback for ASO trials in Huntington disease. Nat Rev Drug Discov. 20 (6), 412-413 (2021).
  17. Mead, R. J., Shan, N., Reiser, H. J., Marshall, F., Shaw, P. J. Amyotrophic lateral sclerosis: a neurodegenerative disorder poised for successful therapeutic translation. Nat Rev Drug Discov. 22 (3), 185-212 (2023).
  18. Gros-Louis, F., Gaspar, C., Rouleau, G. A. Genetics of familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1762 (11-12), 956-972 (2006).
  19. Valentine, J. S., Hart, P. J. Misfolded CuZnSOD and amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 3617-3622 (2003).
  20. Rotunno, M. S., Bosco, D. A. An emerging role for misfolded wild-type SOD1 in sporadic ALS pathogenesis. Front Cell Neurosci. 7, 253(2013).
  21. Winkler, D. D., et al. Structural and biophysical properties of the pathogenic SOD1 variant H46R/H48Q. Biochemistry. 48 (15), 3436-3447 (2009).
  22. Kaur, S. J., McKeown, S. R., Rashid, S. Mutant SOD1 mediated pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis. Gene. 577 (2), 109-118 (2016).
  23. Rosen, D. R., et al. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 362 (6415), 59-62 (1993).
  24. Bruijn, L. I., et al. Aggregation and motor neuron toxicity of an ALS-linked SOD1 mutant independent from wild-type SOD1. Science. 281 (5384), 1851-1854 (1998).
  25. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
  26. Peggion, C., et al. SOD1 in ALS: taking stock in pathogenic mechanisms and the role of glial and muscle cells. Antioxidants (Basel). 11 (4), 614(2022).
  27. Beers, D. R., et al. Endogenous regulatory T lymphocytes ameliorate amyotrophic lateral sclerosis in mice and correlate with disease progression in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 134 (Pt 5), 1293-1314 (2011).
  28. Marchetto, M. C., et al. Non-cell-autonomous effect of human SOD1 G37R astrocytes on motor neurons derived from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 649-657 (2008).
  29. Filipi, T., et al. Cortical glia in SOD1(G93A) mice are subtly affected by ALS-like pathology. Sci Rep. 13 (1), 6538(2023).
  30. Turner, B. J., Talbot, K. Transgenics, toxicity and therapeutics in rodent models of mutant SOD1-mediated familial ALS. Prog Neurobiol. 85 (1), 94-134 (2008).
  31. Smith, R. A., et al. Antisense oligonucleotide therapy for neurodegenerative disease. J Clin Invest. 116 (8), 2290-2296 (2006).
  32. Simonini, C., et al. Neurodegenerative and neuroinflammatory changes in SOD1-ALS patients receiving tofersen. Sci Rep. 15 (1), 11034(2025).
  33. Naseri Kouzehgarani, G., et al. Harnessing cerebrospinal fluid circulation for drug delivery to brain tissues. Adv Drug Deliv Rev. 173, 20-59 (2021).
  34. Duan, C., et al. Intrathecal administration of a novel siRNA modality extends survival and improves motor function in the SOD1(G93A) ALS mouse model. Mol Ther Nucleic Acids. 35 (1), 102147(2024).
  35. Miller, T. M., et al. Trial of antisense oligonucleotide tofersen for SOD1 ALS. N Engl J Med. 387 (12), 1099-1110 (2022).
  36. McCampbell, A., et al. Antisense oligonucleotides extend survival and reverse decrement in muscle response in ALS models. J Clin Invest. 128 (8), 3558-3567 (2018).
  37. DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. J Vis Exp. (75), e50326(2013).
  38. Bhusal, A., Suk, K. Protocol for delivering proteins, peptides, and shRNAs via the intrathecal route in the experimental allergic encephalomyelitis mouse model. STAR Protoc. 5 (3), 103219(2024).
  39. Rahman, M. M., Lee, J. Y., Kim, Y. H., Park, C. K. Epidural and intrathecal drug delivery in rats and mice for experimental research: fundamental concepts, techniques, precaution, and application. Biomedicines. 11 (5), 1413(2023).
  40. Rigaud, M., et al. Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain. Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).
  41. Simon, M. J., Iliff, J. J. Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 442-451 (2016).
  42. Law, V., et al. A murine Ommaya xenograft model to study direct-targeted therapy of leptomeningeal disease. J Vis Exp. (167), e62033(2021).
  43. Christensen, J., Li, C., Mychasiuk, R. Choroid plexus function in neurological homeostasis and disorders: the awakening of the circadian clocks and orexins. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (7), 1163-1175 (2022).
  44. Wu, W., et al. In vivo imaging in mouse spinal cord reveals that microglia prevent degeneration of injured axons. Nat Commun. 15 (1), 8837(2024).
  45. Shi, L., et al. Repeated intrathecal administration of plasmid DNA complexed with polyethylene glycol-grafted polyethylenimine led to prolonged transgene expression in the spinal cord. Gene Ther. 10 (14), 1179-1188 (2003).
  46. Linninger, A. A., Barua, D., Hang, Y., Iadevaia, S., Vakilynejad, M. A mechanistic pharmacokinetic model for intrathecal administration of antisense oligonucleotides. Front Physiol. 14, 1130925(2023).
  47. Chen, Y., et al. Intrathecal delivery of antisense oligonucleotides in the rat central nervous system. J Vis Exp. 152, e60274(2019).
  48. Molnar-Kasza, A., et al. Evaluation of neuropathological features in the SOD1-G93A low copy number transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Front Mol Neurosci. 14, 681868(2021).
  49. Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3548-3553 (2011).
  50. Une, M., et al. SOD1-interacting proteins: roles of aggregation cores and protein degradation systems. Neurosci Res. 170, 295-305 (2021).
  51. Gidaro, T., Servais, L. Nusinersen treatment of spinal muscular atrophy: current knowledge and existing gaps. Dev Med Child Neurol. 61 (1), 19-24 (2019).
  52. Hoy, S. M. Nusinersen: first global approval. Drugs. 77 (4), 473-479 (2017).
  53. Metz, T., et al. Biodistribution of radioactively labeled splice-modulating antisense oligonucleotides after intracerebroventricular and intrathecal injection in mice. Nucleic Acid Ther. 34 (1), 26-34 (2024).
  54. Adank, D. N., et al. Comparative intracerebroventricular and intrathecal administration of a nanomolar macrocyclic melanocortin receptor agonist MDE6-5-2c (c[Pro-His-DPhe-Arg-Trp-Dap-Ala-DPro]) decreases food intake in mice. ACS Chem Neurosci. 11 (19), 3051-3063 (2020).
  55. Sharma, A., et al. Multiple doses of cell therapy and neurorehabilitation in amyotrophic lateral sclerosis: a case report. Clin Pract. 10 (3), 1242(2020).
  56. Modol-Caballero, G., et al. Gene therapy overexpressing neuregulin 1 type I in combination with neuregulin 1 type III promotes functional improvement in the SOD1(G93A) ALS mice. Front Neurol. 12, 693309(2021).

Перепечатки и разрешения

Теги

SOD1
Поясничная интратекальная инъекция SOD1-ASO для точного нацеливания на ЦНС и предиктивной эффективности у мышей ALS человека с SOD1-G93A
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.