Research Article

Холинергическая лиганд-зависимая модуляция окислительного фосфорилирования в клетках нейробластомы BE(2)-C с дигитонином-пермеабилизированной

DOI:

10.3791/69789

⸱

April 28th, 2026

 , 
1Department of Psychology and Neuroscience, College of Psychology, Nova Southeastern University, 2Capillus

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем протокол селективной пермеабилизации плазматической мембраны, что позволяет целенаправленно доставлять субстраты и ингибиторы для оценки окислительного фосфорилирования митохондрий (OXPHOS) в культивируемых клетках, преодолевая барьеры транспорта плазматических мембран, которые обычно препятствуют такому анализу. Используя этот метод, мы продемонстрировали, как функция OXPHOS регулируется мускариновым агонистами и антагонистами.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Целью данного исследования было оценить функцию окислительного фосфорилирования (OXPHOS) в культивируемых клетках с использованием определённых комбинаций субстрата и ингибиторов при сохранении клеточной структуры и цитозольного контекста, потерянных в изолированных митохондриальных препаратах. Поскольку целые клетки плохо проницаемы для нескольких промежуточных веществ цикла Кребса, прямая оценка дыхания, поддерживаемого субстратом, через точки входа в специфическую цепь электронного транспорта (ETC) ограничена. Чтобы преодолеть это, мы применили селективную проницаемость плазматической мембраны с помощью дигитонина и провели анализ связей и электронного потока с помощью внеклеточного анализатора потока в клетках нейробластомы BE(2)-C. Для определения зависимости от типа клеток дигитонин был эмпирически титрирован в клетках HEK293 и первичных нейронах дорсального корня крыс (DRG) с помощью сукцината + ротенона для выделения дыхания, вызванного комплексом II–IV.

Дыхание, поддерживаемое сукцинатом, с ингибированием комплекса I, показало повышенное потребление кислорода, вызванного комплексом II–IV, в пермеабилизированных клетках по сравнению с непроницаемыми клетками, что соответствует улучшенному доступу мембранно-проницаемого субстрата к митохондриям. В отличие от этого, дыхание, поддерживаемое субстратами, входящими через эндогенные транспортные пути (например, пируват/малат), показало меньшие различия между условиями. Используя эту платформу для тестирования мускариновых лигандов, мы наблюдали различия в потреблении O₂ в анализе связки между агонистами и антагонистами, тогда как анализ потока электронов выявил минимальные эффекты, связанные с лигандами, в исследуемых условиях. Эти результаты свидетельствуют о том, что обнаруживаемые эффекты лиганда были более заметны на уровне дыхательных состояний, определяемых связью, чем при максимальной емкости переноса электронов. В целом, селективная проницаемость расширяет доступность субстрата в биоэнергетических анализах культивированных клеток и позволяет анализировать фармакологическую модуляцию митохондриального дыхания.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нарушение или перепрограммирование метаболизма митохондриальной энергии является центральным фактором широкого спектра заболеваний, включая нейродегенерацию, рак, воспалительные заболевания, кардиометаболические заболевания и различные генетические расстройства. Для лучшего понимания роли митохондриального метаболизма в патогенезе заболеваний были разработаны несколько аналитических стратегий. К ним относятся измерения скорости потребленияO2 (OCR), скорости внеклеточной кислотности (ECAR), количественной оценки АТФ, использования субстрата, профилирования или анализа метаболитов цикла Кребса, а также трассировкаизотопов 1. Среди этих методов OCR является ключевым индикатором митохондриального дыхания и может оцениваться с помощью таких приборов, как высокоразрешающая респирометрия (HRR; например, OroborosO 2k)2, электрод типа Кларка или анализатор внеклеточного потока

Система OroborosO 2k измеряет концентрациюO2 в герметичной камере с помощью полярографического сенсора O 2 типа Кларка (POS)3,4,5 и подходит для образцов, таких как изолированные митохондрии, проницаемые клетки и гомогенаты тканей. Он состоит из катода золота/платины, серебряного анода и электролитного резервуара KCl, отделённых от образца мембраной 25 мкмO2 с проницаемой и химически устойчивой мембраной фторированного этиленпропилена (FEP). Электрод типаКларка 3 также работает в закрытой камере, обнаруживая изменения концентрацииO2 с помощью электрода, чувствительного кO2, и часто используется для изолированных митохондрий или суспензий клеток. В отличие от этого, анализатор внеклеточного потока количественно оценивает OCR и ECAR в живых адхерентных клетках или изолированных митохондриях с помощью флуоресцентных сенсоров, встроенных в микропластины, что обеспечивает высокопроизводительное метаболическое профилирование. Практическим преимуществом платформы внеклеточного анализатора потока является автоматизированная мультипараметрическая оценка в нескольких условиях параллельно, тогда как системы с закрытой камерой (например, электроды типа HRR или Кларка) обычно обеспечивают меньшую пропускную способность и требуют большего ручного обращения.

Анализатор внеклеточного потока особенно полезен для оценки функции митохондрий в целых адгерирующих клетках или суспензионных клетках, которые располагаются на дне микропластины. В анализах с использованием целостных клеток метаболизм митохондриальной энергии можно профилировать с помощью субстратов, таких как глюкоза илипируват-6. Альтернативно, анализы с использованием небольших количеств обогащённых митохондриальных фракций позволяют последовательно измерять базальное дыхание, дыхание, стимулируемое АДП (состояние 3), дыхание в покое (состояние 4) и дыхание, стимулируемое отцеплением, с использованием комбинаций субстратов иингибиторов 7. Однако в целостных клеточных системах метаболиты цикла трикарбоновой кислоты (TCA), которые не являются клеточно-проницаемыми, не могут быть использованы для прямой оценки их метаболизма. Изолированные митохондрии позволяют использовать такие метаболиты из-за отсутствия барьеров плазматических мембран. Анализ метода биоэнергетики изолированных обогащённых митохондрий имеет ограничения: структура митохондрий может изменяться во время изоляции, а цитозольные факторы, влияющие на метаболизм митохондрий и транспорт метаболитов, снижены или отсутствуют. Соответственно, методы селективной проницаемости часто используются как компромисс, позволяющий сохранить элементы клеточной архитектуры и одновременно обеспечивать контролируемый доступ к митохондриям. Чтобы преодолеть ограничения использования целостных клеток или изолированных митохондрий для метаболических анализов, этот протокол описывает метод проницаемости клеток адгерентной нейробластомы (BE(2)-C) с помощью дигитонина. Этот подход облегчает импорт метаболитов, не являющихся клетками, через плазматическую мембрану, при этом сохраняя функциональные митохондриальные реакции на определённые субстраты и ингибиторы.

Селективность дигитонина основана на различиях в липидном составе мембраны: плазматическая мембрана богата холестерином, тогда как митохондриальные мембраны — особенно внутренняя митохондриальная мембрана — содержат очень малохолестерина 8. При низких концентрациях дигитонин (или сапонин) селективно и полностью проницает плазматическую мембрану из-за высокого содержания холестерина, тогда как митохондриальные мембраны поражаются только при высокихконцентрациях 9,10. Дигитонин связывается с холестерином и образует поры в плазматической мембране, позволяя небольшим молекулам, таким как промежуточные продукты цикла TCA, попадать в цитозоль без нарушения структуры или функции митохондрий при правильной оптимизации. Этот подход лучше всего подходит для культивированных клеток, которые можно воспроизводимо покрыть как адгерентные монослои в микропластине внеклеточного анализатора потока, и требует эмпирического титрирования концентрации дигитонина для каждого типа клеток и плотности посева. Операционные показатели сохранения целостности митохондрий включают устойчивые, чувствительные к ингибиторам реакции OCR (например, ожидаемое снижение при приёме ротенона/антимицина A и целое дыхание, вызванное комплексным IV, с аскорбатом/TMPD), а также отсутствие коллапса OCR, который мог бы сигнализировать о чрезмерной пермеабилизации. Поэтому оптимизация дигитонина следует проводить до экспериментальных сравнений и повторяться при изменении условий культуры или плотности клеток. Кроме того, оптимальная концентрация дигитонина варьируется в зависимости от типа клетки и должна быть эмпирически определена для создания окна проницаемости, позволяющего проникать непроницаемым субстратам (например, сукцинату), сохраняя при этом чувствительную к ингибиторам функцию митохондрий. В этом исследовании мы иллюстрируем этот принцип, оптимизируя дигитонин не только в клетках BE(2)-C, но и в клетках HEK293 и нейронах первичного ганглия дорзального корня крыс (DRG).

Этот протокол был продемонстрирован с помощью клеток нейробластомы BE(2)-C, которые изначально были выделены из мозга мужчины с нейробластомой. Клетки BE(2)-C экспрессируют различные мускариновые рецепторы, особенно холинергический рецептор мускаринового типа 1 (CHRM1). В наших предыдущих исследованиях мы показали, что CHRM1 связан с митохондриями как в клеточных телах, так и в нейритах нейронов ганглиозных нейронов дорзального корня крыс, а также в клетках HEK293, трансфектируемыхCHRM1 11. Кроме того, генетическая делеция Chrm1 у мышей изменяет множество аспектов структуры и функции митохондрий12,13. Поэтому мы выдвигаем гипотезу, что клетки BE(2)-C можно использовать для изучения модулирующего влияния мускариновых лигандов на функцию OXPHOS. В этой демонстрации мы изучили влияние мускариновых агентов — включая агониста ацетилхолина, смещённого антагонистапирензепина 14 и антагониста атропина — на митохондриальное дыхание в присутствии сукцината или пирувата/малата в качестве субстратов и сравнили их воздействие.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Оттаивание и начальное покрытие

ПРИМЕЧАНИЕ: Базовая среда для клеток BE(2)-C — это смесь 1:1 Eagle's Minimum Essential Medium и F12 Medium, добавленная 10% сывороткой плода (FBS).

  1. Разморозить замороженные клетки BE(2)-C из криовиального раствора в водяной бане при температуре 37 °C. После размораивания центрифугуйте клетки на 200 × г в течение 5 минут, чтобы удалить криопротектор.
  2. Суспензировать клеточную гранулу в полной среде роста и уложить их в контейнер для культуры 10 см. Инкубировать культуру при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5% CO₂ в воздухе, пока клетки не достигнут субслияния.

2. Субкультурирование

  1. Субкультивировать клетки на протяжении 2–3 проходов, чтобы обеспечить их стабильную экспоненциальную фазу роста.

3. Трипсинизация и подготовка суспензии с одной ячейкой

  1. Когда культура достигает 60–80% слияния, трипсинизуйте клетки. Пропустите подвеску ячейки несколько раз через пипетки с тонким наконечником и полированными наконечниками, чтобы отделить комки и получить подвеску на одной ячейке.
  2. Добавьте свежую среду с FBS, чтобы нейтрализовать трипсин. Центрифугуйте клетки при 200 × г в течение 5 минут, чтобы их гранулировать.

4. Протокол клеточного засева для 24-колодочных микропластин, используемых в анализаторе внеклеточного потока

  1. Повторная суспензия гранулы в полной среде при конечной концентрации 10 000 клеток на 100 мкл на одну скважину.
  2. Засейте клетки с оптимальной плотностью, чтобы они полностью достигли слияния в течение 1–2 дней. Оставляйте либо четыре угловых колодца, либо одну угловую яду, в зависимости от экспериментального дизайна. Эти скважины будут служить контролем фона.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это может потребовать проб и ошибок, включая корректировки громкости и тайминга медиа.
  3. Следите за культурой на предмет изменений цвета среды — пожелтение указывает на снижение pH и требует немедленной замены свежей среды для поддержания здоровья клеток.

5. Подготовка к анализу с использованием внеклеточного анализатора потока

ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые здесь форматы анализа на связь и электронный поток соответствуют установленным методам митохондриального дыхания на основе микропластин7, с модификациями, включая проницаемость клеток BE(2)-C с использованием титрования дигитонина и условий обработки мускариновым лигандом.

  1. Подготовьте стоковые растворы и 2 раствора митохондриального анализа (MAS). Заранее подготовьте 2x смеси MAS и рабочие растворы реагентов (субстраты и ингибиторы) (см. таблицу 1, таблицу 2 и таблицу 3).
  2. Храните все запасные решения и MAS при -20 °C для будущего использования, что позволит эффективно настроить активы.
    БЕЗОПАСНОСТЬ: Ротенон, антимицин А, олигомицин, FCCP, дигитонин и TMPD являются опасными и должны использоваться в соответствии с институциональными стандартами безопасности. Все растворы с ингибиторами должны быть подготовлены и обработаны в сертифицированной химической вытяжке с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты (лабораторный халат, нитриловые перчатки и защита глаз). Растворы, содержащие эти реагенты, а также отходы, содержащие DMSO, должны собираться и утилизировать как опасные химические отходы в соответствии с институциональными и местными нормативами. Рабочие поверхности следует деконтаминировать после использования.
  3. Гидратация сенсорного картриджа
    1. Накануне эксперимента гидратировать картридж датчика внеклеточного анализатора потока, добавив в каждую скважину 1 мл буфера для калибровки картриджа сенсора или фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS, pH 7,4). Оставьте картридж датчика на ночь (12–18 часов) при комнатной температуре (20–25 °C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация в инкубаторе без CO₂ при 37 °C не требуется, так как в процессе загрузки патрон уравновесится до комнатной температуры. После размещения в внеклеточном анализаторе потока для калибровки картридж достигает 37 °C примерно за 15 минут.

6. День эксперимента

ПРИМЕЧАНИЕ: Готовьте все растворы свежими, при необходимости регулируйте pH и держите на льду до использования.

  1. Разморозить замёрзший субстрат и дважды MAS при комнатной температуре (20–25 °C) на 15–30 минут или в водяной бане при 37 °C на 5–10 минут.
  2. Подготовьте все растворы для подложки и инъекции (см. таблицу 4, таблицу 5, таблицу 6 и таблицу 7) и проверьте, что pH составляет 7,4. При необходимости отрегулируйте растворы и держите растворы на льду до использования. Используйте таблицы 4 и 5 для анализа соединения. Для анализа потока электронов используйте таблицы 6 и 7.
  3. Загрузите ингибиторы и подложки в соответствующие порты сенсорного картриджа и подготовьтесь к запуску анализа. В зависимости от типа анализа — анализ на сцепление или анализ потока электронов 7 — по мере необходимости обращайтесь к Таблице 4 и Таблице 5 или Таблице 6 и Таблице 7 соответственно.
  4. Подготовьте все рабочие растворы субстрата и ингибиторов до определённых конечных объёмов (массовые смеси: 15 мл; картриджные смеси: 2 мл на порт). Рассчитать концентрации для достижения желаемых конечных концентраций в скважине после закачки (итоговый объём скважины: 700 мкл после порта D).
  5. Добавьте 450 мкл подготовленного анализного раствора в каждую скважину 24-колодной внеклеточной пластины анализатора потока, содержащей мускариновые лиганды (конечная концентрация лиганда: 1 мкМ; общий объём ямы: 500 мкл). Убедитесь, что каждая скважина уже содержит 50 мкл 1x MAS буфера и погружённых ячеек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг непосредственно перед загрузкой пластины в анализатор.
  6. Загрузите 50 мкл каждого подготовленного реагента в соответствующий порт впрыска сенсорного патрона.

7. Инструментальное программирование и выполнение анализов

  1. Включите анализатор внеклеточного потока не менее чем за 1–2 часа до начала эксперимента, чтобы внутренний инкубатор стабилизировался при температуре 37 °C. Поддерживайте камеру при температуре 37 °C на протяжении всей калибровки и анализа анализа.
  2. Запрограммируйте анализатор на выполнение соответствующих циклов смешивания, ожидания и измерения согласно таблице 8.
  3. Маркировка скважин и экспериментальных групп в программном обеспечении согласно экспериментальной конструкции.
  4. Начинайте анализ анализа. Позвольте прибору откалибровать картридж датчика (~15 мин).
  5. Подготовьте пробную пластину к загрузке во время калибровки патрона. При необходимости задерживать загрузку; картридж датчика останется стабильным при 37 °C внутри прибора.
  6. Завершите анализ после окончания окончательного цикла измерения после впрыска порта D. Немедленно переходите к нормализации после анализа и анализу данных.

8. Подготовка клеточной пластины для анализа внеклеточного анализатора потока

  1. Начинайте подготовку яченой пластины сразу после установки сенсорного картриджа в анализатор для калибровки. Добавьте 700 мкл 1x MAS буфера в каждую яму, содержащую адгезионные элементы. Инкубировать при комнатной температуре (20–25 °C) в течение 1 минуты.
  2. Аккуратно аспирируйте буфер, не нарушая прикреплённые клетки. Повторяйте этап промывания не менее 3 x 1 минуты, чтобы удалить остаточный материал от культуры, и завершить все промывки в течение 10 минут.
  3. Добавьте 50 мкл 1x MAS буфера в заданную фоновую яму, чтобы установить визуальный объём.
  4. Аспирированный буфер из экспериментальных скважин, оставляя примерно 50 мкл остаточного буфера в каждой скважине.
  5. Инкубировать пластину при 37 °C в водяной бане, держа её выше поверхности воды, чтобы предотвратить испарение. Поддерживайте температуру 37 °C в течение 10 минут (максимум 20 минут) перед загрузкой.
  6. Непосредственно перед загрузкой пластины добавьте 450 мкл буфера 1x MAS, содержащего соответствующие субстраты, в каждую скважину для достижения конечного объёма 500 мкл.
  7. Вставьте пластину в анализатор внеклеточного потока.

9. Завершение анализа и анализа данных

  1. После завершения работы извлеките ячейную пластину и датчик из анализатора.
  2. Нормализуйте значения OCR на одну скважину, используя общее количественное определение белков или общее количество клеток. Лизируйте клетки с помощью RIPA и количественно оценивайте общий белок с помощью Брэдфордского анализа или другого спектрофотометрического белкового анализа.
  3. Нормализуйте значения OCR с помощью программного обеспечения для анализа и экспортируйте данные по мере необходимости.
  4. Примените следующие критерии приема: подтвердите исходную устойчивость OCR (≤15% дрейфа за два последовательных цикла измерений) и подтверждение снижения OCR ≥60% после инъекции ротенона, олигомицина или антимицина A.
  5. Исключать пробеги, которые не соответствуют этим критериям, и ре-оптимизировать концентрацию проницаемости или плотность посева клеток по мере необходимости.

10. Экспорт результатов

  1. Вставьте USB-накопитель в прибор.
  2. Экспортировать данные анализа.

11. Обработка данных

  1. Анализируйте данные с помощью инструментального программного обеспечения.
  2. Экспортировать обработанные данные в форматы, совместимые с выбранным программным обеспечением для анализа и визуализации.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оптимизация концентрации дигитонина для проницаемости клеток BE(2) C в анализе связей
В начале этого протокола мы стандартизировали оптимальную концентрацию дигитонина, необходимую для эффективной проницаемости клеток без ущерба для митохондриального дыхания. В этом протоколе мы тестировали 5 мкм и 10 мкм дигитонин в качестве начальных концентраций и провели анализ связи. Этот анализ оценивает степень связи между ETC и OXPHOS-аппаратом, позволяя различать дыхание, выз...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование вводит быстрый и экономичный протокол оценки модуляции OXPHOS, опосредованной мускариновым лигандом, в культивируемых клетках нейробластомы. Используя селективный плазматический мембранный пермеабилизатор дигитонин в сочетании с определёнными парами субстрат-ингибитор, мы позволили целенаправленно доставлять метаболические субстраты, такие как сукцинаты, непосредственно в митохондрии in situ. Этот подход преодолевает ограничения целых клеточных мембран, которые ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы отмечают исследования больницы Святого Бонифация, Университет Манитобы, Виннипег, Канада; и Университета Нова Саут-Истерн (NSU), Форт-Лодердейл, Флорида, США, за предоставление финансирования и инфраструктурной поддержки. Авторы также выражают признательность Alzo Biosciences из Сан-Диего, Калифорния, и Capillus, Майами, Флорида, США за финансовую поддержку.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ацетилхолин хлоридMilliporeSigmaA6625Мускариновый агонист
ADPMP Biomedicals, IncICN19014901Электронный акцептор, субстрат для синтеза АТФ.
Антимицин АAAJ63522MAThermo ScientificИнгибирует митохондриальный комплекс III
АтропинMilliporeSigma1044990Мускариновый антагонист
Ячейки Be2CКоллекция американской типографической культурыCRL-2268Нейробластная клетка, выделенная из мозга мужчины с нейробластомой, экспрессирует мускариновые рецепторы
ДигитонинMilliporeSigmaD141Мягкое моющее средство, мембранная проницаемость.
D-MannitolThermo Scientific ChemicalsAA3334236Неметаболизируемый сахарный спирт, используемый для осмотической стабилизации и защиты мембран
EGTAMilliporeSigmaE0396Хелатирование кальция, предотвращает активацию кальциевых протеаз и других ферментов, способных разрушать митохондриальные белки.
БСА без жирных кислотMilliporeSigma126575Предотвращает неконтролируемое воздействие жирных кислот, стабилизирует митохондрии
FCCPCayman ChemicalNC0904863Протонофор и развязка окисляющего фосфорилирования в митохондриях
HEPESMilliporeSigma391340Буферизация pH, совместимость с функцией митохондрий
L-AscorbateTCI AmericaA053925GПромежуточный продукт цикла TCA, субстрат OXPHOS
Хлорид магнияMilliporeSigmaM8266Для ионного баланса — поддержка ферментативной активности
N1,N1,N1,N1-тетраметил-1,4-фенилендиамин (TMPD)Электронный донор цитохрома c, оценка функции комплекса IV путём обхода комплексов I и II, TMPD/аскорбат позволяет напрямую измерять потребление кислорода, зависящего от комплексного IV.
ОлигомицинMilliporeSigma1404-19-9Ингибирует синтез митохондриального АТФ, комплекс V
Пирензепин дигидрохлоридMilliporeSigmaP7412Мускариновый смещённый агонист
Пирувиновая кислотаThermo Scientific ChemicalsAC132155000Субстрат цикла TCA
РотенонеMilliporeSigma557368Ингибирует митохондриальный комплекс I
Микропластины для культуры клеток Seahorse XF24 V7 PSAgilent102340-100Микропластинки для культивирования клеток
Анализатор Seahorse XFe24AgilentS7801BRАнализаторы Agilent Seahorse XFe24 измеряют скорость потребления кислорода (OCR) и скорость внеклеточного закисления (ECAR) живых клеток в формате пластин с 24 лунками.
Сукциновая кислотаФишер КемикалAC158742500Промежуточный продукт цикла TCA, субстрат OXPHOS
Буфер калибровки картриджа датчика XFe24Agilent102340100pH буфера PBS 7.2
Сенсорные картриджи XFe24Agilent102340-100датчик для измерения OCR и ECAR

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yin, Y., Shen, H. Common methods in mitochondrial research (review). Int J Mol Med. 50 (4), 148(2022).
  2. Walsh, M. A., Musci, R. V., Jacobs, R. A., Hamilton, K. L. A practical perspective on how to develop, implement, execute, and reproduce high-resolution respirometry experiments: the physiologist's guide to an Oroboros O2k. FASEB J. 37 (12), e23280(2023).
  3. Severinghaus, J. W., Astrup, P. B. History of blood gas analysis. IV. Leland Clark's oxygen electrode. J Clin Monit. 2 (2), 125-139 (1986).
  4. Gnaiger, E. Mitochondrial pathways and respiratory control. Drug-induced mitochondrial dysfunction. , 325-352 (2008).
  5. Chance, B., Williams, G. R. A simple and rapid assay of oxidative phosphorylation. Nature. 175 (4469), 1120-1121 (1955).
  6. Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 cell mito stress test. STAR Protoc. 2 (1), 100245(2021).
  7. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746(2011).
  8. Subczynski, W. K., Pasenkiewicz-Gierula, M., Widomska, J., Mainali, L., Raguz, M. High cholesterol/low cholesterol: effects in biological membranes: a review. Cell Biochem Biophys. 75 (3-4), 369-385 (2017).
  9. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
  10. Fan, H. Y., Heerklotz, H. Digitonin does not flip across cholesterol-poor membranes. J Colloid Interface Sci. 504, 283-293 (2017).
  11. Sabbir, M. G. Cholinergic receptor muscarinic 1 co-localized with mitochondria in cultured dorsal root ganglion neurons, and its deletion disrupted mitochondrial ultrastructure in peripheral neurons: implications in Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 98 (1), 247-264 (2024).
  12. Sabbir, M. G., Swanson, M., Speth, R. C., Albensi, B. C. Hippocampal versus cortical deletion of cholinergic receptor muscarinic 1 in mice differentially affects post-translational modifications and supramolecular assembly of respiratory chain-associated proteins, mitochondrial ultrastructure, and respiration: implications in Alzheimer's disease. Front Cell Dev Biol. 11, 1100854(2023).
  13. Sabbir, M. G., Swanson, M., Albensi, B. C. Loss of cholinergic receptor muscarinic 1 impairs cortical mitochondrial structure and function: implications in Alzheimer's disease. Front Cell Dev Biol. 11, 1158604(2023).
  14. Sabbir, M. G., Fernyhough, P. Muscarinic receptor antagonists activate ERK-CREB signaling to augment neurite outgrowth of adult sensory neurons. Neuropharmacology. 143, 268-281 (2018).
  15. Sabbir, M. G., Taylor, C. G., Zahradka, P. CAMKK2 regulates mitochondrial function by controlling succinate dehydrogenase expression, post-translational modification, megacomplex assembly, and activity in a cell-type-specific manner. Cell Commun Signal. 19 (1), 98(2021).
  16. Sabbir, M. G., Calcutt, N. A., Fernyhough, P. Muscarinic acetylcholine type 1 receptor activity constrains neurite outgrowth by inhibiting microtubule polymerization and mitochondrial trafficking in adult sensory neurons. Front Neurosci. 12, 402(2018).
  17. Facino, R. M., Carini, M., Stefani, R., Aldini, G., Saibene, L. Anti-elastase and anti-hyaluronidase activities of saponins and sapogenins from Hedera helix, Aesculus hippocastanum, and Ruscus aculeatus: factors contributing to their efficacy in the treatment of venous insufficiency. Arch Pharm (Weinheim). 328 (10), 720-724 (1995).
  18. Dervishi, M., et al. Sterols govern membrane susceptibility to saponin-induced lysis. bioRxiv. , (2025).
  19. Mhada, M., Metougui, M. L., El Hazzam, K., El Kacimi, K., Yasri, A. Variations of saponins, minerals and total phenolic compounds due to processing and cooking of quinoa (Chenopodium quinoa Willd.) seeds. Foods. 9 (5), 660(2020).
  20. Fasciani, I., et al. The C-terminus of the prototypical M2 muscarinic receptor localizes to the mitochondria and regulates cell respiration under stress conditions. PLoS Biol. 22 (4), e3002582(2024).
  21. Skok, M. Mitochondrial nicotinic acetylcholine receptors: mechanisms of functioning and biological significance. Int J Biochem Cell Biol. 143, 106138(2022).
  22. Felmlee, M. A., Jones, R. S., Rodriguez-Cruz, V., Follman, K. E., Morris, M. E. Monocarboxylate transporters (SLC16): function, regulation, and role in health and disease. Pharmacol Rev. 72 (2), 466-485 (2020).
  23. Wohlrab, C., Phillips, E., Dachs, G. U. Vitamin C transporters in cancer: current understanding and gaps in knowledge. Front Oncol. 7, 74(2017).
  24. Rovini, A. Tubulin-VDAC interaction: molecular basis for mitochondrial dysfunction in chemotherapy-induced peripheral neuropathy. Front Physiol. 10, 671(2019).
  25. Heuck, A. P., Moe, P. C., Johnson, B. B. The cholesterol-dependent cytolysin family of gram-positive bacterial toxins. Subcell Biochem. 51, 551-577 (2010).
  26. Murase, K. Cytolysin A (ClyA): a bacterial virulence factor with potential applications in nanopore technology, vaccine development, and tumor therapy. Toxins (Basel). 14 (2), 107(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Oxidative PhosphorylationCholinergic LigandsDigitonin PermeabilizationBE 2 C CellsNeuroblastoma CellsExtracellular Flux AnalyzerMitochondrial RespirationComplex II RespirationPlasma Membrane PermeabilizationElectron Transport Chain

Related Articles