Циклическая вольтамметрия быстрого сканирования (FCV) — это электрохимический метод, разработанный для мониторинга быстрых колебаний электроактивныхнейротрансмиттеров 1. В отличие от традиционной циклической вольтамметрии, которая использует медленные частотысканирования 1, FCV применяет треугольную потенциальную сигнальную форму с гораздо более высокой скоростью сканирования (обычно 400 В/с) через микроэлектрод из углеродного волокна в микрометре, что позволяет измерять субсекундную концентрациюнейромедиатора 2. Эти высокие скорости сканирования создают большой, но стабильный фоновый зарядный ток, который можно цифровым образом вычитать для выделения фарадаических токов, возникающих в результате окисления и восстановлениянейромедиаторов 2,3.
FCV позволяет в реальном времени измерять концентрацию внеклеточных нейромедиаторов в определённых областях мозга, обеспечивая высокое временное разрешение и умеренную химическуюселективность 4. Эти особенности делают FCV отлично подходящим для изучения быстрых нейрохимических сигналов как in vivo, так и ex vivo препаратов, включая свободно движущихся или анестезируемых животных и острые срезымозга 5,6,7. Этот метод имеет несколько преимуществ: (1) контролируемые протоколы стимуляции могут использоваться для вызова определённых дофаминергических реакций; (2) малый диаметр микроэлектродов из углеродного волокна минимизирует повреждение тканей и позволяет точные пространственные записи; (3) FCV высокосовместима с фармакологическими манипуляциями, что позволяет эффективно исследовать кинетику высвобождения моноаминов и его поглощение; и (4) сочетание химической селективности и высокого временного разрешения обеспечивает лучшее обнаружение по сравнению с другими электрохимическими методами, такими как амперометрия, и методами отбора проб, такими как микродиализ, которые часто не хватают скорости для захвата быстрых временных событий нейромедиатора или сталкиваются с трудностями при выявлении и количественной оценке конкретныхмолекул 5.
Дофамин (ДА) — ключевой нейромодулятор, отвечающий за вознаграждение, мотивацию, моторный контроль и множество аспектов обучения и памяти, характеризующийся быстрой и временной динамикойвысвобождения 8. В FCV треугольная форма напряжения, обычно с диапазоном от -0,4 В до +1,2 В, многократно прикладывается к микроэлектроду из углеродного волокна. Во время анодического (вверх) сканирования DA возле поверхности электрода окисляется примерно при +0,6 В, высвобождая два электрона и образуя дофамин-о-хинон. Во время катодного (нисходящего) сканирования это соединение восстанавливается обратно до DA при -0,2 В, поглощая дваэлектрона 9. Полученный сигнатура ток-напряжение позволяет точно обнаруживать и количественно оценивать быстрое высвобождение и зазор DA с высоким пространственным и временным разрешением, выявляя секундные колебания внеклеточных уровней DA. В наших экспериментах записи FCV собирались на частоте 10 Гц в течение 15-30 секунд, что было достаточно для фиксации выделения DA, вызванного электрической стимуляцией.
Внутри стриатума высвобождение DA строго регулируется локальными холинергическими интернейронами (ChIs). Хотя ChIs составляют лишь ~1%–2% стриатальных нейронов, они активно арборизируются и имеют сильный контроль над дофаминергическими аксонами через аксоаксоническиевзаимодействия 10,11. Это правило, вероятно, сыграет ключевую роль в стриатальном обучении. Во время обучения нейроны среднего мозга проявляют фазовое возбуждение в ответ на вознаграждения или сигналы предсказаниявознаграждения 12, тогда как ChIs демонстрируют высокосинхронизированный многофазный паттерн возбуждения-паузы-отскока13. Временное совпадение между паузой ChI и фазовой активностью DA дополнительно подчёркивает важность ChI-опосредованной регуляции выделения DA через никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (nAChRs)14,15. Помимо регулирования высвобождения DA, это временное совпадение оказалось необходимым для индукции синаптической пластичности, связанной с обучением, встриатум-16, что подчеркивает важность уточнения взаимодействий между сигналами ChIs и DA в этой цепи.
ChIs влияют на высвобождение DA как минимум двумя разными механизмами. Во-первых, синхронная активация ChIs может вызывать быстрое, кратковременное высвобождение DA, которое происходит независимо от дофаминергического соматического возбуждения через активацию nAChR на DAаксонах 17,18,19. Эта форма высвобождения аксонального DA, вероятно, опосредована генерацией экстремальных потенциалов внематочного действия ваксонах DA 17. Во-вторых, активация ChI может глубоко подавлять последующее высвобождение DA, предотвращая деполяризацию аксоновDA 20. Примечательно, что это подавление происходит с очень короткой латентностью и может быть вызвано относительно низким уровнем активности ChI, которые сами по себе не вызывают обнаруживаемого высвобождения DA, что говорит о том, что активация nAChR более эффективна для подавления продолжающегося высвобождения DA, чем вызывает выброс DA. Таким образом, эти факторы указывают на то, что ChIs может оказывать общее подавляющее влияние на высвобождение ДА в физиологических условиях. Однако на более тонком пространственном уровне ChIs может локально способствовать высвобождению аксональных аксонов DA.
В совокупности эти результаты подчёркивают тонко налаженную регуляторную роль ChIs в контроле стриатальногоDA-сигнала 20. FCV предоставляет мощный подход для анализа этих взаимодействий Chl-DA, поскольку высокое временное разрешение позволяет точно измерять как облегчающие, так и подавляющие эффекты активности ChI на выделение DA.
В этой статье изложены основные процедуры изготовления микроэлектродов из углеродного волокна и измерения концентраций вызванных внеклеточных ДА с использованием препаратов FCV in ex vivo .