Многосуставное синхронное отслеживание на основе глубокого обучения для объективной количественной оценки кинематики задней конечности у крыс

Summary

Этот протокол устанавливает конвейер кинематической оценки задних конечностей крысы с использованием теста на беговой дорожке без маркеров с автомаркировкой многосуставной траектории на основе глубокого обучения, что позволяет воспроизводимо количественно оценивать движение.

Abstract

Точная и объективная оценка походки крыс необходима для исследований нейронауки и кинезиологии. Традиционные системы часто полагаются на визуализацию отпечатков для косвенного вывода походки, которая не может полностью отразить многосуставные кинематики задних конечностей. В этом исследовании создана система анализа походки на беговой дорожке без маркеров, интегрирующая индивидуальные алгоритмы глубокого обучения с программируемой беговой дорожкой с поддержкой веса, что позволяет отслеживать несколько суставов нижних конечностей в реальном времени и многомерную кинематическую количественную оценку. Система автоматически извлекает параметры цикла походки, траектории суставов, схемы распределения сил и плавность движений при условии модулированной скорости (0-300 мм/с), наклона (градиент ±30°) и градуированной поддержки веса (0-500 г), предоставляя объективный инструмент оценки для исследований поведения нервно-мышечных мышц. Используя модели травмы спинного мозга (ТСМ), результаты демонстрируют чувствительность системы к обнаружению многомерных различий в диапазоне движений суставов, непрерывности траектории, выходе тяги и плавности движения между здоровыми и травмированными грызунами, подтверждая её способности различать заболевания и градировать. По сравнению с традиционными методами субъективных оценок или методов покрытия, эта платформа устраняет личные предвзятости и ограничения малоразмерных данных, сочетая архитектуру на основе глубокого обучения и преимущества высокопроизводительного сбора данных. Он применим к исследованиям, связанным с повреждением центральных или периферических нервов, нейродегенеративными заболеваниями, нарушениями опорно-двигательного аппарата и процессами старения. Благодаря синхронной интеграции нейроэлектрофизиологических модулей система дополнительно обеспечивает временную связь походки и нейронных сигналов, формируя методологическую основу для анализа центрально-периферических механизмов управления и разработки нейромодуляторных стратегий.

Introduction

В современной нейронауке и локомоторных исследованиях объективная количественная оценка походки теперь крайне важна для анализа нейромышечных функций, выяснения механизмов заболеваний и оценки стратегий^{реабилитации. 1}. Высокое пространственно-временное разрешение позволяет фиксировать тонкие различия в синергиях между нейронными командами, профилями активации мышц и скелетной механикой, создавая эмпирическую основу для изучения координации надспинальных путей, периферической обратной связи и механических контекстов. Воспроизводимые кинематические метрики повышают чувствительность к выявлению поражений, дегенеративных изменений и терапевтических эффектов, ускоряя процесс разработки лекарств^{и приборов 2}.

Традиционные платформы оценки, такие как CatWalk, DigiGait или упрощённый анализ отпечатка, косвенно делают выводы о кинематике суставов на основе подошвовых контактных паттернов. Эти подходы приводят к низкоразрешённым и несогласованным метрикам, которые не отражают многосуставную кинематическую сложность задней^{конечности 3,4}. Общая цель нашего метода — создать высокоточную, без маркеров и с поддержкой веса систему анализа походки, специально разработанную для моделей грызунов. Поэтому мы создаём новую концепцию, которая: (i) поддерживает грызунов в вертикальном положении при контролируемой осевой нагрузке (0-100% массы тела) при непрерывной многосуставной съёмке, (ii) напрямую локализирует анатомические ориентиры сагиттальной плоскости с помощью анализа бокового обзора через глубокое обучение для создания двумерных пространственных траекторий, (iii) экспортирует временно разрешённые углы суставов и сегментарную кинематику для статистического^{моделирования 5}. В основе этого фреймворка основана на применении глубокого обучения к задачам компьютерного зрения, что обеспечивает надёжное совместное извлечение признаков из видеоданных.

По сравнению с существующими системами, эта платформа обладает четырьмя ключевыми преимуществами. Его работа без маркеров устраняет отражающие или имплантированные метки, одновременно значительно снижая процедурную сложность и артефакты движения⁶. Интегрированная система подвески с обратной связью обеспечивает точную градиационную поддержку веса тела (0-100%), что позволяет провести комплексную оценку походки на полном континууме от нагрузки до разгрузки, чего нет в коммерческих беговых^{дорожках 7}. Архитектура глубокого обучения позволяет быстро переучить новые штаммы, возраст или патологические состояния, превосходя ручное отслеживание по^{масштабируемости 8}. А высокоточные многосуставные пространственные координаты позволяют детально анализировать кинематику межсуставных суставов в сочетании с количественным профилированием аномальных паттернов походки.

Этот протокол широко применяется. Она позволяет исследовать надспинальный контроль, проприоцептивные петли обратной связи и синергию мышц при модулированных механических^{требованиях 9}. С патофизиологической точки зрения он обеспечивает чувствительные локомоторные биомаркеры для травмы спинного мозга (ТСМ), инсульта, нейродегенерации, периферических невропатий и нервно-мышечных^{расстройств 8,10}. С терапевтической точки зрения он поддерживает продольную оценку фармакологических или устройствных вмешательств с усиленной статистической мощностью благодаря высокоразрешающей^{кинематике 11}. Модульная архитектура позволяет бесшовно интегрироваться с дополняющими платформами, например, электромиограммой (ЭМГ) или сигналами мозга, что способствует механистическому декодированию нейронных коррелятов в движении нижних конечностей.

Protocol

Все процедуры на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Пекинского института исследований мозга и соответствовали Руководящим принципам по уходу и использованию лабораторных животных. Побочных эффектов, связанных с процедурой, не наблюдалось.

1. Подготовка оборудования

1. Включите блок питания беговой дорожки и выберите кнопку управления скоростью на сенсорном экране.
2. Пусть ремень работает на низкой скорости 30 секунд, чтобы наблюдать, отклоняется ли ремень беговой дорожки.
3. Выберите кнопку управления наклоном , затем установите наклон на 0°, нажмите Ноль и убедитесь, что отображаемое значение совпадает с пузырём уровня.
4. Входите в интерфейс подвески , подвесьте груз весом 10 г и проверьте, близок ли показатель натяжения к 0,10 Н.
5. Включите промышленный персональный компьютер (IPC) и введите программное обеспечение для захвата и анализа видео.
6. Создайте каталог для эксперимента дня, включая такие данные, как название эксперимента, идентификация животного, группа эксперимента, скорость, наклон и процент снижения веса.
7. Фиксируйте высокоскоростную промышленную камеру (UC70, разрешение: 1280X1024, частота кадров: 60 кадров в секунду), оснащённую объективом ручной фокусировки (f = 12 мм), на алюминиевом профильном брекете. Разместите объектив камеры перпендикулярно продольной оси беговой дорожки, чтобы запечатлеть строго боковой обзор, сохраняя горизонтальное рабочее расстояние 15 см от плоскости пояса беговой дорожки.
8. Разместите линзу горизонтально с помощью уровня пузырьков и убедитесь, что торс крысы занимает центральные две трети кадра. Отрегулируйте фокус и диафрагму так, чтобы линии масштаба на задней линейке (сетка длиной 1 см) стали чётко видны.
9. Нажмите «Предпросмотр », чтобы убедиться, что следа отсутствует и яркость фона одинаково. Если изображение слишком тёмное, используйте светодиодную подсветку для увеличения яркости; При переэкспонировании уменьшайте усиление и соответствующим образом сузьте диафрагму.
10. Нажмите «Начать запись», чтобы проверить качество записи данных. Нажмите «Остановить запись» и задайте путь хранения данных. После завершения вышеуказанных испытаний оборудования начинайте испытания на животных.

2. Подготовка животных и беговые испытания

1. Перенесите крысу вместе с её оригинальной клеткой в экспериментальную комнату и дайте ей отдохнуть 10 минут. В этот период предоставляйте свободный доступ к еде и воде.
2. Фиксируйте вес тела с помощью электронных весов (точность до 0,1 г). Включайте крыс с одинаковым весом тела (±10 г), чтобы минимизировать смешивающие эффекты размера тела.
3. Если цвет шерсти задних конечностей недостаточно контрастирует с фоном, используйте электробритву, чтобы аккуратно удалить полоску шерсти шириной 1 см с внешней стороны бедра и задней части ноги, чтобы повысить точность распознавания суставов.
4. Затем используйте мягкую ленту, чтобы измерить расстояние от бедра до голеностопа (мм), что послужит основой для последующего нормализации шага.
5. Наденьте перчатки, возьмите крысу и обмотайте эластичный ремень вокруг переднего подмышки, прикрепив его к регулируемому направляющему. Убедитесь, что ремень достаточно свободен, чтобы вставить один палец, не мешая дыханию животного.
6. Медленно поворачивайте рукоятку рычага подвески, наблюдая за значением натяжения на экране, постепенно увеличивая его до целевого коэффициента уменьшения веса. Убедитесь, что задние конечности крысы всё ещё полностью соприкасаются с землёй.
7. Отрегулируйте высоту рукоятки. Ослабьте верхнюю ручку и расположите переднюю ручку чуть ниже кончика носа крысы, когда стоит прямо, чтобы животное могло легко схватить её, не запрокидывая голову назад и не наклоняясь.
8. На сенсорном экране установите скорость 150 мм/с, а наклон — 0°. Проведите 10-минутную сессию адаптации, чтобы адаптировать животное к конкретному уровню поддержки по весу тела. Следите за крысой на наличие симптомов стресса, например, замерзания, дефекации.
   1. Если походка остаётся нерегулярной (определяется как [>3 прерыва/мин]), увеличивайте продолжительность на 2 минуты, максимум до 20 минут.
9. Акклиматизация считается успешной, если крыса поддерживает непрерывный, равномерный шаг не менее 60 секунд без волочки лапы, а хвост свободно свисает, но без жёсткости. Исключать животных, которые не соответствуют этим критериям после максимального периода адаптации.
10. Введите параметры, необходимые для формального эксперимента. Последовательно вводите на сенсорном экране желаемую скорость (любое значение от 0 до 300 мм/с) и наклон (от 30° до +30°) и выбирайте направление ремня беговой дорожки.
11. После запуска беговой дорожки обратите внимание на поза ходьбы крысы. Если она отклоняется от центральной трети области, аккуратно постучите кулаком по правой стенке. Большинство животных сами исправляют своё положение. Если две последовательные коррекции оказываются неэффективными, переместите крысу и заново запишите испытание.
12. После стабилизации нажмите «Начать запись » и непрерывно зафиксируйте как минимум пять полных циклов походки.
13. В конце каждого испытания немедленно уменьшите скорость до 0, отстегнуте нагрудный ремень и верните крысу в соответствующую клетку.
14. Вводите воду в отдых, с минимум 3 минутами между попытками.
15. Запишите как минимум три испытания при одинаковых условиях. Если животное бегает непрерывно более шести испытаний, добавьте дополнительный 2-минутный отдых, чтобы избежать накопленной усталости.
16. Проводите предварительную тренировку в течение пяти дней подряд перед формальным экспериментом: ежедневно ходите по 10 минут на скорости 150 мм/с, с уклоном 0° и без снижения веса, наблюдая за походкой.

3. Извлечение данных о походке

1. Сначала извлекать сегменты с целевым алюром, обычно около 10 секунд, которые должны включать как минимум 10 анализируемых стабильных циклов походки.
2. Импортируйте .mov файл в программное обеспечение анализа и зарегистрируйте индивидуальную информацию о крысах, включая ID-номер, группу и экспериментальные условия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Система использует архитектуру YOLO-NAS Pose — современную нейросеть, оптимизированную для высокопроизводительной оценки поз.
   Построение набора данных: модель была обучена на надёжном наборе данных из 6 000 видеокадров. Эти кадры вручную аннотировались с координатами пяти ключевых суставов задних конечностей (подвздошный гребень, бедро, колено, лодыжка и палец) с помощью графического интерфейса DeepLabCut для обеспечения точности точности на земле.
   Обучение: Сеть прошла трансферное обучение на видеокарте NVIDIA RTX 3080 для адаптации весов YOLO-NAS Pose к специфическим особенностям задней конечности крысы.
   Инициализация: В программном обеспечении выберите предварительно обученную модель 'Rat_Hindlimb_YOLO_v1' и установите порог доверия на 0,8, чтобы исключить ключевые точки с низкой определённостью.
   На этапе анализа модель YOLO-NAS Pose обрабатывает видеопоток покадр за кадром. В отличие от традиционных методов компьютерного зрения, основанных на фоновых вычитаниях, эта архитектура глубокого обучения напрямую локализирует крысу и предсказывает совместные координаты внутри ограничивающей рамки.
   Постобработка: алгоритм извлекает координаты x и y из отображений вероятностей. Для снижения высокочастотного джиттера на исходные траектории применяется медианный фильтр (размер окна: 3 кадра).
   Выход: Система успешно фиксирует пять целевых соединений внутри видеокадра, генерируя временно разрешённые пространственные координаты для всей последовательности походки. Эти данные автоматически экспортируются в .csv файлы для кинематических расчётов. Используя линейку задней панели (сетка размером 1 см), захваченную одновременно, система устанавливает отношение преобразования, автоматически вычисляет коэффициент масштабирования и пакетно преобразует координаты пикселей в миллиметры.
3. Экспортировать координаты пространственного положения каждого соединения во времени в виде .csv-файла для последующего расчёта индекса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Программа автоматически рассчитывает длину шага, частоту шагов и высоту стопы, а также экспортирует изменения пространственного положения и углов пяти нижних суставов конечностей со временем. На основе высоты носка программа автоматически делит каждый шаг на фазу качания и фазу стойки, а также рассчитывает пропорцию фазы раскачивания и фазы стойки в каждом цикле походки.

4. Межгрупповые кинемматические сравнения

1. Нормализуйте каждый цикл походки в группе с 0% (контакт стопой) до 100% (снова тот же контакт ногой), чтобы унифицировать разные длины циклов и облегчить усреднение и сравнение групп. Типы изображений, которые можно сгенерировать для иллюстрации динамики походки, приведены в дополнительном файле 1.

5. Статистический анализ

1. Выполняйте все статистические анализы с помощью программного обеспечения GraphPad Prism.
2. Проверьте нормальность распределения данных с помощью теста Шапиро-Вилка.
3. Для демонстрационных сравнений кинематической валидации и индекса массы тела (ИМТ) представлены данные как среднее ± SEM.
4. Оценить различия между двумя экспериментальными условиями с помощью t-теста Стьюдента без пары.
5. Определите порог статистической значимости как *p < 0,05, **p < 0,01 и ***p < 0,005. Обратите внимание, что в этом пилотном валидационном исследовании было включено всего n = 3 крысы.

6. Вложение электрофизиологического модуля

1. После завершения моделирования на животных имплантируйте электрофизиологическое устройство для записи.
2. Для нейронной записи разместите электроды на поверхности черепа, эпидуральное пространство или кору головного мозга для записи сигналов мозга.
3. Для записи в спинной мозг вводите электроды в эпидуральное пространство межпозвоночного отверстия.
4. Для записи ЭМГ вкопывайте биполярные серебряные провода в мышцы, чтобы фиксировать электрическую активность мышц.
5. После имплантации дайте животному восстановиться 5-7 дней, ежедневно проверяя рану и походку, чтобы не было признаков инфекции или боли, прежде чем перейти к эксперименту на беговой дорожке.
6. Завершите оборудование и подготовку животных, как описано выше.
7. Синхронизировать сбор электрофизиологических параметров и видео движения, обеспечивая, чтобы электрофизиологические и видеоданные имели одинаковое время.
8. После сбора данных выровняйте нейронные сигналы с видеокадрами во время анализа, чтобы интуитивно наблюдать электрофизиологические паттерны на разных фазах цикла походки, предоставляя прямые доказательства для изучения механизма связи между центральным и периферическим языком.

Results

Схематическая схема и фактическая фотография структуры системы беговой дорожки показаны на рисунках 1A, B соответственно. Устройство способно получать высококонтрастные боковые изображения без маркеров. Беговая дорожка поддерживает регулировки скорости, наклона, направления и снижения веса, а также оснащена числовой панелью управления. Сопутствующий программный интерфейс включает интерфейс мониторинга и получения информации в реальном времен...

Discussion

Этот протокол определяет систему анализа походки на беговой дорожке для крыс и её операционные процедуры, предоставляя многомерный и объективный инструмент оценки для нейромышечных поведенческих исследований. Как показано в межгрупповых сравнениях параметров походки между ТСМ и здоровыми крысами в примерном исследовании, система получает необработанные координаты пространственного движения нижних конечностей испытуемых с помощью непрерывной видеосъёмки походки с высокой частотой кадров и...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Аннотация и аннотация ИИ по походке Программное обеспечение для приобретения	Shanghai ClinAITrial Technology Co., Ltd.	MouseAI	MouseAI — это интегрированное программное обеспечение для анализа для беговой дорожки MOVEMETRICS, объединяющее видеозапись, логирование метаданных и автоматизированный анализ походки в единый рабочий процесс.
Механический удар	RWD Life Science, Шэньчжэнь, Китай
Многоканальная система логической электрофизиологической записи	Kedou (Suzhou) мозг — компьютерная технологическая компания, & nbsp;	KedouBC RHD128A	KedouBC RHD128A — это компактная 128-канальная система электрофизиологии in vivo для получения электрофизиологии, разработанная для высокоразрешающей нейронной записи у малых и крупных лабораторных животных. Интегрируя лёгкие, plug-and-play головные сцены (и 1,3 g), 16-битное преобразование A/D и программируемые усилители, он захватывает сигналы EEG, ECoG, LFP, спайки, EMG и ECG с частотой 0,1 Гц до 30 кГц с ≤ 2.4 и микро; Шум системы V и > 10 GΩ Входной импеданс. RHD128A предоставляет надёжные, масштабируемые пользователем нейронные данные для ускорения исследований интерфейсов мозг-машина, нейродегенерации и реабилитации.
Беговая дорожка	Shanghai ClinAITrial Technology Co., Ltd.	MOVEMETRICS	MOVEMETRICS — это высокоточная инструментальная беговая дорожка для продвинутого анализа походки грызунов.