Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Исследовательская статья
* These authors contributed equally
В этом исследовании выявлена окислительный стресс-сигнатура 10-лнкРНК при плоскоклетичной карциноме лёгких (LUSC), используя данные из The Cancer Genome Atlas. Хотя валидация показала ограниченную клиническую прогнозную эффективность, подпись дифференцировала паттерны иммунной микросреды, а тесты in vitro поддержали LINC01615 как кандидата, связанного с миграционным вторжением, для дальнейших механистических исследований.
Длинноцепочечная некодирующая РНК (lncRNA) существенно влияет на прогностическую ценность плоскоклеточной карциномы лёгких (LUSC) и иммунную инфильтрацию. Целью данного исследования было показать, как лнкРНК, связанные с окислительным стрессом, влияют на плоскоклеточный карцинома лёгких (СКК). Набор данных Cancer Genome Atlas (TCGA) собирал информацию о транскриптомах и сопутствующие клинические данные для LUSC. Для построения прогностической модели было выявлено 10 генов, связанных с прогностикой, с помощью серии биоинформатических анализов, в которых сравнивалась аномальная экспрессия гена OS в опухолях и здоровых тканях, а также его связь с злокачественными опухолищами. Участников стратифицировали на группы с высоким и низким уровнем риска на основе медианного рейтинга риска, полученного из 10-генной подписи. В то время как математическая модель риска показала ограниченную независимую предиктивную эффективность в валидационной когорте (AUC ~ 0,5), функциональные и иммунологические оценки выявили значительные различия в микроокружении опухоли (TME) между слоями риска. В частности, пациенты с высоким риском демонстрировали выраженные профили иммунной инфильтрации и изменённые иммунологические показатели по сравнению с низкорисковыми коллегами. Таким образом, вместо того чтобы служить прямым клиническим инструментом прогнозирования, этот сигнатура LNCRNA, связанная с окислительным стрессом, предоставляет ценные биологические данные об иммунном ландшафте LUSC и выделяет потенциальные терапевтические цели для дальнейших механистических исследований.
Рак лёгких демонстрирует наивысшую глобальную заболеваемость и смертность средизлокачественных заболеваний 1. Среди гистологических вариантов немелкоклеточного рака лёгких (НМРЛ) преобладающим подтипом является плоскоклеточный рак лёгких (LUSC), часто коррелирующий с неблагоприятными клиническими исходами и отсутствием высокоэффективных таргетных методов лечения по сравнению с аденокарциномойлёгких 2. Хотя основные терапевтические подходы включают хирургическое вмешательство, лучевую терапию и химиотерапию, пациенты с прогрессирующим LUSC часто проявляют терапевтическуюрезистентность 3. Следовательно, существует острая необходимость в выявлении надёжных молекулярных биомаркеров для улучшения прогностической стратификации и направления исследовательских терапевтических стратегий дляLUSC 4.
Окислительный стресс, характеризующийся патологическим накоплением реактивных форм кислорода (ROS), играет критическую роль в возникновении, росте и метастазах опухоли. При отсутствии эффективных механизмов очистки ROS повышенные уровни ROS вызывают повреждение ДНК и генотоксичность, что в конечном итоге приводит к различным геномным изменениям, способствующим развитию рака. В частности, исследования постоянно показывают повышение уровня РОС и окислительный стресс, особенно в патогенезе ракалёгких 5,6. Недавние исследования дополнительно показали, что кластеры генов, связанных с окислительным стрессом, могут служить проспективными прогностическими биомаркерами при злокачественных пухолинахлёгких 7. Длинные некодирующие РНК (lncRNA) стали ключевыми регуляторами экспрессии генов и представляют собой перспективные прогностические биомаркеры при различных злокачественных опухолях. Хотя предыдущее заметноеисследование 7 успешно установило прогностическую модель аденокарциномы легких (LUAD), связанную с окислительным стрессом, специфические прогностические и иммунные последствия таких lncRNA в LUSC остаются в значительной степени неизученными.
В этом исследовании авторы систематически проанализировали наборы данных TCGA, чтобы создать новый сигнатуру lncRNA, связанную с окислительным стрессом, специально адаптированную для LUSC. Кроме того, в отличие от чисто биоинформатических анализов, настоящее исследование включает экспериментальную валидацию in vitro для подтверждения биологической функциональной роли ключевых идентифицированных lncRNA (например, Linc01615). Вместо того чтобы утверждать немедленное клиническое применение для диагностических и лечебных решений, это исследование в первую очередь направлено на изучение потенциальных механизмов окислительного стресса в LUSC и его корреляции с иммунной микросредой опухоли. Эти результаты призваны предоставить ценные биологические знания и выделить потенциальные терапевтические цели для будущих механистических исследований.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Сбор и предобработка данных
Все данные, проанализированные в этом исследовании, были получены из общедоступной базы данных TCGA, указанной в Таблице материалов. Это исследование строго соблюдало политику обмена геномными данными Национального института здравоохранения (NIH) и рекомендации по публикации, предоставленные TCGA. Поскольку наборы данных состоят из неидентифицированных, общедоступных клинических и мультиомикс-данных, это исследование было освобождено от дальнейшего одобрения Институциональным обзорным советом (IRB). Транскриптомные данные и соответствующая клиническая информация по LUSC были скачаны из базы данных Cancer Genome Atlas (TCGA). Изначально в когорте было 551 образец (502 опухоли и 49 нормальных). Для обеспечения надёжности этой прогностической модели пациенты с отсутствующими полными данными о общей выживаемости (ОС), статусом выживаемости или существенными клиническими характеристиками были исключены из дальнейшего анализа выживаемости. После этого строгого процесса фильтрации была сформирована окончательная аналитическая когорта из 470 пациентов с LUSC. Эти 470 пациентов были случайным образом разделены на обучающий набор (n = 235) и набор тестирования (n = 235) для построения и валидации модели риска. Всего было собрано 792 гена, связанных с окислительным стрессом, через базу данных GeneCards, перечисленную в Таблице материалов, с использованием критерия включения в виде балла релевантности ≥ 7. Пакет лимма (версия 3.66.0) использовался для скрининга генов дифференциально экспрессируемого окислительного стресса. Планы вулканов создавались с использованием пакета ggplot2 (версия 4.0.2). Между обучающей и тестовой группой не наблюдалось заметных различий в клинических характеристиках (p > 0,05). Обучающий набор использовался для построения модели, а тестовый набор — для внутренней валидации.
Построение и проверка модели риска
Для выявления lncRNA, связанных с окислительным стрессом, был проведён анализ коэкспрессии Пирсона. Авторы оценили корреляцию между профилями экспрессии идентифицированных дифференциально экспрессированных генов, связанных с окислительным стрессом, и всеми аннотированными lncRNA в наборе данных TCGA-LUSC. Критерии корреляции для выбора соэкспрессированных lncRNA были установлены с коэффициентом корреляции |R| > 0,4, а p-значение < 0,001. На основе этих порогов было получено и извлечено в общей сложности 6 088 кандидатов lncRNA, связанных с окислительным стрессом. Впоследствии эти 6 088 кандидатных lncRNA были оценены с помощью регрессии LASSO и дополнительных аналитических подходов для построения модели прогностического риска. Используя обработанные данные, участники были классифицированы на группы с высоким и низким риском.
Независимые множители и кривые ROC
Для выявления независимых прогностических переменных использовались модели одномерной и многомерной регрессии Кокса. В частности, для контроля уровня ошибок по семейству во время множественных одномерных регрессионных анализов Кокса (n = 236 тестов) была применена коррекция Бонферрони, установив строго скорректированный порог значимости на уровне p < 0,00021 (рассчитанный как 0,05 / 236).
Анализ выживаемости и анализ основных компонентов
Пакет выживаемости (версия 3.8-6) использовался для расчёта общего уровня выживаемости (OS), а для оценки устойчивости модели риска применялся анализ основных компонентов (PCA).
Номограмма
Индекс соответствия оценивался с помощью пакета rms в R для надёжности номограммы. Мутационное бремя опухолей (TMB) было оценено и визуализировано с помощью пакета maftools (версия 2.22.0). Алгоритмы, включая ssGSEA, использовались для обнаружения иммунной инфильтрации. Кроме того, пакет ggpubr (версия 0.6.3) использовался для сравнения иммунных контрольных точек между группами риска. Алгоритм ESTIMATE использовался для характеристики микросреды опухоли (TME).
Функциональный анализ
Пакет clusterProfiler (версия 4.14.6) в R использовался для анализа обогащения. Для дальнейшего изучения функциональных путей был проведён анализ GSEA. С помощью Cytoscape была создана ко-экспрессионная сеть для наблюдения.
Экспериментальные методы
Условия и группировка клеток
Клеточная линия плоскоклеточной карциномы человеческого легкого NCI-H520 (RRID: CVCL_1566; указана в Таблице материалов) была культивирована в среде RPMI-1640 с добавлением 10% (v/v) сыворотки плода и 1% пенициллин-стрептомицина. Лог-фазовые клетки были посеяны в культиваторные пластины с 6 колодцами. После успешного присоединения клетки случайным образом делились на три отдельные экспериментальные группы: пустую контрольную группу, поддерживаемую в стандартных условиях культуры, отрицательную контрольную группу (si-NC), трансфектирующую нетаргетирующей siRNA, и экспериментальную группу knockdown (si-LINC01615), трансфектированную LINC01615-специфической siRNA.
Трансфекция клеток
Реагенты si-LINC01615 и si-NC были разморажены на льду. Для подготовки трансфексионного комплекса 95 мкл среды без сыворотки RPMI-1640 было пипетировано в стерильные центрифугные трубки, после чего последовательно добавляли 3 мкг соответствующего siRNA и 5 мкл трансфекционного реагента Lipo3000. Идентичная процедура применялась как для группsi LINC01615 , так и для siNC. Растворы аккуратно смешивались и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут для облегчения сложного образования, в результате чего общий объём на трубку составлял примерно 200 мкл. Впоследствии эта смесь равномерно распределялась в назначенные культурные колодцы, содержащие 800 мкл базальной среды RPMI-1640. После 6-часового инкубационного периода при 37 °C трансфекционная среда аккуратно аспирировала и заменялась свежей полной культурной средой.
Анализ заживления ран (царапин)
Для анализа заживления ран логарифмически растущие клетки NCI-H520 (RRID: CVCL_1566) были посеяны в культиваторные пластины с 6 колодцями при плотности 5,6 × 105 клеток на колодцу. При достижении слияния 95–100% была искусственно создана линейная рана путём вертикального царапания монослоя клетки по центру ямы с помощью стерильного наконечника пипетки объёмом 200 мкл. Впоследствии скважины были промыты трижды с помощью PBS для удаления отсоединённых клеток и клеточных остатков, а затем инкубировали в безсывороточной среде RPMI-1640. Изображения одинаковых раненых областей были сделаны на 0, 24 и 48 часах с помощью перевёрнутого микроскопа. Область заживления раны была количественно определена путём измерения расстояния между ранами с помощью ImageJ (RRID: SCR_003070; указано в Таблице материалов), а скорость миграции рассчитывалась относительно начальной площади раны на 0 час.
Анализы миграции и инвазии Трансвелла
Возможности клеточной миграции и инвазии оценивались с использованием 24-колодцевых камер Трансвелла, оснащённых вставками из поликарбонатных мембран диаметром 8,0 мкм пор, указанными в Таблице материалов. Для инвазионного анализа апикальные камеры предварительно покрывались 50 мкл Матригеля (разбавленным 1:8 в безсывороточной среде; указано в Таблице материалов) и инкубировали при 37 °C в течение 2 часов для полимеризации, тогда как миграционный анализ использовал непокрытые вставки. После трансфекции клеток и 24-часового периода голодания в сыворотке клетки NCI-H520 были собраны, вновь суспендированы в безсывороточной среде RPMI-1640 и засеяны в апикальные камеры с плотностью 1,8 × 105 клеток/скважину в 200 мкл. Базальные камеры были заполнены 600 мкл среды RPMI-1640, дополненной 10% FBS в качестве хемоаттрактанта. После 48-часовой инкубации при 37 °C с 5% CO₂ вставки были сняты и три раза промыты с помощью PBS. Клетки, оставшиеся на апикальной поверхности мембраны, аккуратно убирались влажным ватным тампоном. Клетки, мигрировавшие или проникшие в базолатеральную поверхность, фиксировались 4% параформальдегидом в течение 20 минут и окрашивались раствором Gimsa, указанным в Таблице материалов , в течение 30 минут при комнатной температуре. Мигрировавшие и вторгшиеся клетки визуализировались и перечислялись по трём случайно выбранным оптическим полям на вставку с помощью инвертированного микроскопа при увеличении в 40 раз.
Статистический анализ
Все статистические анализы и визуализации данных выполнялись с использованием программного обеспечения R (версия 4.1.2; RRID: SCR_001905; перечислено в Таблице материалов). Конкретные номера версий всех R-пакетов, использованных в этом исследовании, были подробно описаны в соответствующих методологических подразделах. Значимое значение традиционно определялось как p < 0,05, если не было указано иное. При проведении нескольких сравнений (например, множественных одномерных регрессии Кокса), метод Бонферрони строго применялся для поддержания семейного уровня ошибки (FWER), при этом точный скорректированный порог (например, p < 0,00021) был подробно описан в соответствующем методологическом подразделе. Количественные данные in vitro выражались в среднем ± стандартном отклонении и анализировались с помощью t-теста Стьюдента или одностороннего ANOVA по мере необходимости.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Идентификация дифференциально экспрессированных генов окислительного стресса
Рабочий процесс показан на рисунке 1. Клинические характеристики финальной аналитической когорты, включающей 470 пациентов с LUSC, подробно описаны в Таблице 1. Исходя из установленного порога показателя релевантности ≥ 7, авторы получили в общей сложности 792 гена, связанных с окислительным стрессом, из базы данных GeneC...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Плоскоклеточная карцинома легких (LUSC) — это преобладающий и крайне агрессивный гистологический подтип немелкоклеточного рака лёгких, часто характеризующийся низкими показателями выживаемости и устойчивостью к традиционным терапевтическимметодам 8,9. Новые данные подчёркивают окислительный стресс как ключевой фактор патогенеза и прогрессирования различных злокачественных заболеваний. Патологическое накопление реактивных форм кис...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторы не заявляют о конкурирующих интересах. При подготовке рукописи не использовались инструменты искусственного интеллекта (ИИ) или технологии с поддержкой искусственного интеллекта; Весь научный контент, анализы, исходные данные и выводы были независимо сгенерированы, рассмотрены и утверждены авторами.
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (грант No 8200430). Мы искренне благодарим участников и участвующие учреждения, включая Университет традиционной китайской медицины Хунань и Академию традиционной китайской медицины Хунань, за их ресурсы и поддержку. Мы также выражаем благодарность всем исследователям и участникам, которые внесли вклад в это исследование.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 4% Параформальдегид | Beyotime | P0099 | Используется для фиксации клеток |
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | https://cytoscape.org/ | Используется для создания сети сопряженного экспрессии |
| Фета́льная сы́воротка бы́чья (FBS) | Gibco | 10099-141 | Конечная концентрация 10% (в/в) |
| База данных GeneCards | Генетическая база данных человеческих генов | https://www.genecards.org/ | Скрининг генов, связанных с окислительным стрессом |
| Стаин Гимзы | Sigma-Aldrich | GS500 | Используется для окрашивания мигрированных/инвазированных клеток |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | Используется для количественной оценки ран |
| Реагент для трансфекции Lipo3000 | GLPBIO | GK20006 | Используется для трансфекции siRNA |
| Матригель | Corning | 356234 | Разбавлен 1:8 в бессеменной среде |
| NCI-H520 человеческий плоскоклеточный рак легкого | ATCC | HTB-182 | Используется для in vitro валидационных анализов |
| ПБС (фосфатно-буферный раствор) | Gibco | 10010-023 | Используется для промывания клеток |
| Пенициллин-стрептомицин (1%) | Gibco | 15140-122 | Антибиотическая добавка для культуры клеток |
| ПО R (v4.1.2) | R Foundation | https://www.r-project.org/ | Статистический анализ и визуализация |
| Среда RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | Среда для культуры клеток |
| Атлас раковых геномов (TCGA) | Общая геномная база данных | https://portal.gdc.cancer.gov/ | Источник транскриптомных и клинических данных |
| Трансвелл камеры (8,0 мкм) | Corning | 3422 | Используется для анализов миграции и инвазии |