Методическая статья

Микродиссекция с помощью лазерного захвата ткани печени мышей, фиксированной на параформальдегиде, для анализа РНК

DOI:

10.3791/69814

⸱

17 апреля 2026 г.

 ,  ,  , 
1Biomedical Research Center, Southern Medical University, 2School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, 3School of Pharmaceutical Science, Southern Medical University, 4Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co., Ltd., 5The Seventh Affiliated Hospital, Southern Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает метод изоляции РНК из определённых гистологических областей тканей печени мышей с фиксированным параформальдегидом с оптимальной температурой резки с помощью микродиссекции лазерного захвата, что позволяет проводить целенаправленный анализ экспрессии генов на последующих этапах.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микродиссекция с лазерным захватом (LCM) обеспечивает пространственный доступ к конкретным популяциям клеток в сложных тканях посредством визуализации и изоляции in situ . Для проведения транскриптомного анализа гистологически определённых областей в неподвижной ткани представлен подробный протокол LCM для экстракции РНК из срезов печени мышей, фиксированных параформальдегидом (PFA), с оптимальной температурой резки (OCT), встроенных в соединение. Протокол подробно описывает идентификацию и сбор микромасштабных образцов (примерно 1000 клеток) с помощью рабочего процесса, включающего фиксацию тканей, обезвоживание сахарозы, встраивание ОКТ, криосекцию, окрашивание гематоксилином и лазерный захват целевых гистологических областей. С помощью этого метода была получена РНК высокой чистоты (A260/A 280: 1.9-2.1). Число целостности РНК (RIN) составляло 6,7 ± 0,9, что отражает ожидаемую фрагментацию, связанную с фиксацией PFA. Однако количественное ПЦР для β-актина показало значения КТ 17-19, а секвенирование РНК, выполненное с использованием оптимизированной для фрагментации подготовки библиотек, дало высококачественные чтения, при этом >90% основ соответствовали пороговым значениям Q20 и Q30, что подтверждает пригодность РНК для чувствительного анализа в последующих процессах. Таким образом, этот протокол позволяет проводить пространственно-разрешённый, целенаправленный анализ экспрессии генов, предоставляя РНК определённой чистоты и целостности из определённых гистологических областей ткани печени, фиксированной с PFA.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Точное получение пространственно разрешённых профилей экспрессии генов крайне важно для понимания гетерогенности тканей при здоровье и заболеваниях. Секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq) обеспечивает высокое клеточное разрешение 1,2, но теряет нативный пространственный контекст и может изменять транскрипционные профили во время диссоциациитканей 3,4. Для типов клеток, не имеющих публично идентифицированных специфических маркеров, получение чистых популяций с использованием сортировки на основе иммунофлуоресценции или иммуномагнитной изоляции остаётсясложным 5,6. Технологии пространственной транскриптомики, такие как Visium и GeoMx, позволяют in situ собирать высокопроизводительные данные экспрессии генов, но их пространственное разрешение ограничено на уровне одной клеткиили субклеток 7,8. Напротив, пространственная транскриптомика на основе визуализации может достигать нанометрового разрешения, но имеет ограниченную пропускную способность обнаружениягенов 9. Это подчёркивает устойчивый пробел в гипотезах, основанном на анализе конкретных морфологических областей.

Микродиссекция с лазерным захватом (LCM) позволяет осуществлять микроскопический отбор и выделение определённых клеток из срезов тканей или живых клеточных культур на основе наблюдаемого фенотипа. Этот подход сохраняет клеточную структуру и пространственнуюинформацию 10. Этот метод широко применялся в исследованиях заболеваний печени для последующих анализов. Например, LCM применялся для сбора желчных эпителиальных клеток из биопсий печени с целью выяснения их иммунорегуляторной роли при первичном желчномхолангите 11. Кроме того, он использовался для выделения γ-глутамилтрансферазы (GGT)-положительных тканей из экспериментальных моделей с целью подтверждения экспрессии генов Ggt1 , специфичной длясайта. Однако эти исследования в основном были сосредоточены на свежих замороженных тканях, которые часто не имеют клинических аннотаций или долгосрочного наблюдения13. В отличие от этого, химически фиксированные ткани дают преимущества для гистопатологическойдиагностики 14. Хотя секвенирование РНК на основе LCM (RNA-Seq) успешно применялось к крупномасштабным формалино-фиксированным и парафин-вложённым (FFPE) образцампечени 15. Однако отсутствует надёжный протокол профилирования экспрессии генов на основе LCM, специально предназначенный для микромасштабных образцов из тканей печени с фиксированной параформальдегидной (PFA) и оптимальной температурой резки (OCT), встроенных в соединения.

Для решения этой неудовлетворённой потребности был оптимизирован комплексный протокол с использованием криосекций, закреплённых PFA, встроенных в OCT. Этот протокол учитывает ограничения рабочих процессов FFPE (например, длительное использование и агрессивные химикаты) для чувствительных приложенийLCM-РНК 16. В отличие от этого, процесс фиксации и вложения образцов с фиксированным PFA и OCT относительно прост и гибкий, что позволяет быстро подготовить высококачественные срезы, сохраняющие целостность РНК и морфологию тканей. Кроме того, этот протокол выполняется с помощью ультрафиолетовой (УФ) лазерной системы LCM. По сравнению с инфракрасными системами, UV-LCM обеспечивает более тонкую резку и обеспечивает прямой, бесконтактный сбор образцов, минимизируя загрязнение и делая его подходящим для точной изоляции микромасштабных областей из сложных тканевых архитектур17,18. Таким образом, операционная ценность этого протокола заключается в его способности проводить морфологически сохраняющий захват микромасштабных областей (~1 000 клеток) из PFA-фиксированных срезов печени. Она даёт РНК, подходящую для целевого анализа экспрессии генов, что позволяет напрямую корреляцию между гистопатологическими признаками и локальными транскриптомическими профилями.

Здесь мы описываем протокол лазерного захвата микродиссекции ткани микромасштаба (~1 000 клеток) из срезов печени мышей с фиксированным PFA, встроенных в OCT, за которым следует экстракция РНК и последующий анализ с помощью количественного обратного транскрипционного ПЦР и секвенирования РНК. Эти процедуры могут быть завершены в течение пяти дней.

Чтобы помочь читателям оценить применимость этого протокола, ниже приведены основные объёмы и ограничения. Этот протокол специально оптимизирован для гипотеза-ориентированного морфологического отбора определённых гистологических областей из тканей, фиксированных PFA, вложенных в OCT, с основным применением в печени мышей. Он подходит для исследователей, которым необходимо сопоставить пространственно разрешённые транскриптомические данные с точными гистопатологическими особенностями, сохранившимися в фиксированных образцах. Этот рабочий процесс особенно ценен при работе с архивированными или клинически аннотированными фиксированными тканями, где свежезамороженные образцы недоступны. Однако этот протокол не идеален для исследований, требующих высокоцелостной, нефрагментированной РНК (например, число целостности РНК (RIN) > 8), поскольку врождённая фрагментация химической фиксации ограничивает его использование в приложениях, зависящих от полноразмерных транскриптов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры по обращению и уходу за животными выполнялись в соответствии с этическими нормами и одобрены Комитетом по этике животных Южного медицинского университета. Описанный метод использовал взрослых самцов мышей C57BL/ 6J и поддерживался на диете с высоким содержанием жира, сахара и дефицита холина для моделирования метаболически ассоциированного стеатогепатита (MASH). Перед изъятием печеночных тканей животных усыпляли путем обезглавливания.

1. Подготовка образца, фиксированного с PFA

  1. Зафиксируйте свежие образцы печеночных тканей (отдельные доли толщиной 5 мм или меньше) в 30 мл холодного 4% PFA (свежеприготовленных) при 4 °C в течение 24 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: рекомендуется перфузировать печень раствором с фосфат-буфером физиологическим раствором (PBS, 1×, обычно состоящим из 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na₂HPO₄ и 1,8 мМ KH₂PO₄, pH 7,4) в концентрации 1× в течение 5 минут, затем фиксация перфузией с 4% PFA в течение 5 минут. В качестве альтернативы ткань может быть фиксирована в 10% растворе формалина.
    ВНИМАНИЕ: фиксатив PFA токсичен. Все отходы PFA должны собираться в специально предназначенный, правильно маркированный контейнер с химическими отходами в соответствии с институциональными и местными нормативами.
  2. Промыйте фиксированные образцы тканей 3× раза в течение 5 минут раствором 1× PBS без РНаз.
  3. Поместите фиксированную ткань печени в 50 мл трубку, заполненную 50 мл сахарозы 30% (свежеприготовленной в стерильной 1× PBS). Поддерживайте образцы при 4 °C в течение 10-12 часов.
  4. Удалите образцы тканей из раствора сахарозы. Обрезайте образцы для получения удобных в обращении блоков (примерно 5 мм × 3 мм × 5 мм), затем вставьте образцы в криомолд (7 мм × 7 мм × 5 мм), содержащее соединение OCT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости корректируйте ориентацию тканей щипцем.
  5. Добавьте сверху смесь ОКТ, чтобы полностью покрыть образцы тканей, затем немедленно положите блок ткани, встроенный в ОКТ, на жидкий азот или сухой лёд, чтобы быстро заморозить соединение ОКТ и получить твёрдый блок. Это быстрое замораживание необходимо для получения высококачественных криосеций.
    ВНИМАНИЕ: Используйте перчатки, защищающие руки при работе с криогенными материалами.
  6. Разместите блоки, встроенные в OCT, при -80 °C до криосекции.

2. Криосекция для микродиссекции лазерного захвата

  1. Подвергайте мембранные препараты полиэтиленнафталата (PEN) воздействию ультрафиолетового излучения на 30 минут, затем покрывайте стекли 0,1 мг/мл поли-L-лизина, после чего сушите на воздухе. Затем герметизируйте края затвора мембраны PEN нейтральным монтажным материалом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ультрафиолетовое облучение и обработка поли-L-лизином для стекло мембраны PEN могут улучшить прицепление образцов тканей к мембранным слайдам PEN. Герметизация периметра нейтральным монтажным материалом предотвращает проникновение воды или образование пузырьков под мембраной, что критически важно для поддержания эффективности LCM.
    ВНИМАНИЕ: Защитите кожу и глаза от ультрафиолетового излучения. Наденьте защитные очки для защиты от ультрафиолета или защитный экран (рассчитанный на защиту от ультрафиолета), а также лабораторный халат, нитриловые перчатки и длинные рукава для закрытия открытой кожи.
  2. Протрите все доступные поверхности криостата и все инструменты средством для дезактивации РНазой и очистите щётку 75% этанолом.
    ВНИМАНИЕ: Утилизируйте использованные этаноловые салфетки и растворы в соответствии с местными институциональными протоколами по охране окружающей среды и безопасности.
  3. Позвольте прибору достигать и стабилизироваться при −20 °C.
  4. Возьмите образцы печени при температуре -80 °C и поместите их в криостат минимум на 15 минут.
  5. Нанесите тонкий слой (2-3 мм) соединения OCT на поверхность стадии образца. Поставьте стадию образца на полку быстрого замораживания (или в камеру криостата), чтобы предварительно затвердеть слой ОКТ.
  6. Нанесите небольшое количество ОКТ на предварительно затвердевший слой ОКТ на стадии образца. Возьмите уравновешенный блок ткани (из шага 2.4) и сразу разместите блок горизонтально на этом ОКТ, удержите его на месте 10-15 секунд для частичного заморозки и склеяния. После закрепления установите стадию образца (с прикреплённым тканевым блоком) к голове криостата.
  7. Аккуратно вставьте лезвие между зажимными пластинами и задними пластинами с одной стороны криостата, а затем зажмите рычаг зажима.
  8. Отрегулируйте толщину криостата на 10 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Регулируйте толщину срезов по мере необходимости для ткани, но сохраняйте толщину от 5 до 15 мкм19.
  9. Разрезать и закрепить секции непосредственно на предварительно обработанные мембранные стекли PEN внутри камеры криостата, поддерживаемую при -20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый слайд мембраны PEN может вместить 6-8 срезов тканей. Рекомендуется завершить весь процесс секционирования в течение 1 часа. Ограничение времени секционирования минимизирует воздействие тканей на окружающие условия, тем самым снижая риски деградации РНК, обезвоживания тканей и морфологических артефактов, которые критически важны для сохранения качества РНК и гистологической целостности для ЛКМ и дальнейшего анализа.

3. Окрашивание гематоксилином для микродиссекции с лазерным захватом

  1. Разморозьте стекли при комнатной температуре (RT) за 20 минут перед использованием.
  2. Помой стекли без РНазы 1× PBS (3 раза, по 10 с каждая).
  3. Погружайте тканевые стекли в фильтрованный раствор гематоксилина Майера (состоящий из 1,0 г/л гематоксилина, 0,2 г/л йодата натрия, 50 г/л додекагидрата сульфата алюминия, 50 г/л хлоралгидрата и 1,0 г/л лимонной кислоты) в течение 5-10 секунд.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пропустите рабочий раствор гематоксилина через фильтрующую мембрану шприца диаметром 0,22 мкм перед окрашиванием.
  4. Промыйте стекли водой без РНазы (3 раза, по 10 с каждая), чтобы удалить остаточный раствор гематоксилина.
  5. Оценивайте качество окрашивания под микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимально окрашенные ядра должны выглядеть чётко сине-фиолетовыми на чистом фоне. Недостаточное окрашивание приводит к слабым появлению ядер, а чрезмерное окрашивание затмевает клеточные детали. Только слайды, соответствующие этим оптимальным критериям окрашивания, должны перейти к следующему этапу.
  6. Промокните стекли до высыхания впитывающей бумагой, а затем полностью высушите на воздухе (10-15 минут).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что стекли полностью высохли перед переходом к LCM. Затем поместите затворы в 50-мл центрифугные трубки и временно храните их на льду до проведения ЛКМ.

4. Микродиссекция с лазерным захватом

ПРИМЕЧАНИЕ: Длительность эксперимента с LCM для каждого слайда должна поддерживаться от 30 минут до 1 часа. Рекомендуется завершить весь эксперимент LCM в течение 4 часов. Этот предел устанавливается для минимизации деградации РНК при RT и предотвращения испарения буфера в крышке пробирки, что крайне важно для эффективного извлечения образцов. На практике целевая урожайность примерно в 1000 клеток из морфологически определённых областей может быть надёжно собрана за 4 часа.

  1. Протрите поверхности лабораторного стола с помощью агента для дезактивации RNase.
  2. Включите контроллер и дайте микроскопу завершить процесс инициализации.
  3. Поверните ключ по часовой стрелке с положения Off в положение On , чтобы запустить лазерную систему.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лазерная система требует примерно 10 минут на прогрев.
  4. Включите компьютер и откройте программное обеспечение LCM, затем дождитесь завершения процесса инициализации.
  5. Вставьте стерильную ПЦР-трубку (сборную трубку) объемом 0,2 мл в устройство для сбора.
  6. Добавьте 10 мкл буфера пищеварения протеиназы K (см. Таблицу материалов) в крышку ПЦР-трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объём буфера пищеварения протеиназы K будет доведён до 150 мкл на следующем этапе (см. шаг 5.4.1) в рамках полной процедуры лизиса.
  7. Загрузите устройство для сбора образцов в держатель для образцов микроскопа.
  8. В окне Change Collector Device сначала выберите кнопку Move to Reference Point. Далее отрегулируйте фокус камеры, чтобы обеспечить чёткий обзор точки отсчёта. При необходимости используйте стрелки в окне, чтобы центрировать точку отсчёта в поле зрения.
  9. Загрузите срез ткани в держатель образца, убедитесь, что она ориентирована лицевой стороной вниз, а этикетка расположена справа.
  10. Выберите объективную линзу × 10, определите и очертите интересующие области с специфическими патологическими признаками, такими как микровезикулярный стеатоз (характеризующийся гепатоцитами с многочисленными мелкими, прозрачными цитоплазматическими вакуолями и центрально расположенными ядрами). Затем перейдите в меню Laser и нажмите кнопку Calibrate . Подтвердите сообщение на экране, выбрав «Да », и приступите к калибровке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: объектив 10× объектива не предназначен исключительно для микродиссекции; Другие линзы увеличения (например, 20×) могут быть выбраны на основе чёткости образца и желаемого разрешения.
  11. В панели управления лазером установите параметры резки так: мощность лазера = 50, апертура (диаметр лазерного луча) = 5 и скорость = 9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вышеуказанные значения параметров служат эталоном для системы UV-LCM с образцами тканей, используемыми в этом протоколе. Пользователям других систем UV-LCM стоит рассмотреть эти системы как отправную точку и, вероятно, потребуется эмпирически корректировать настройки. Оптимальные настройки могут варьироваться в зависимости от типа ткани, толщины сечения и других систем LCM.
  12. Нарисуйте круг вокруг целевой области с помощью графической панели инструментов. Выберите одну форму, нажмите кнопку Start Cut для выполнения LCM, а затем разместите устройство для сбора разрезанной ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Успешное отделение обозначается разделением выбранной области, часто с видимым зазором или движением фрагментов. Для согласованности собирайте из заранее определённого количества областей схожего размера на выборку. Если целевая область не отсоединяется автоматически, нажмите кнопку «Переместить и вырезать », чтобы вручную разрезать образец мышью. Для более точной оценки количества ячеек программное обеспечение LCM может автоматически фиксировать общую площадь разреза. Это значение можно разделить на среднюю площадь сечения целевой ячейки, чтобы приблизить общее количество захваченных ячеек.
    ВНИМАНИЕ: Во время процесса LCM не смотрите прямо на лазерный луч, чтобы избежать воздействия лазерного излучения.
  13. По желанию запечатлейте изображение до и после места рассечения, выбрав команду Сохранить изображение как в меню Файл . В диалоговом окне выберите местоположение, имя файла и сохраните в предпочтительном формате (например, .tif).
  14. После сбора нужного количества ячеек нажмите кнопку «Выгрузить », чтобы убрать коллектор со сцены. Перед запечатыванием ПЦР-пробирки проверьте, что буферный объём протеиназы K в крышке остаётся на уровне 10 мкл; восполнить буфер, если испарение происходило во время LCM (см. шаг 4.6).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление 10 мкл буфера обеспечивает полное увлажнение поверхности крышки, что облегчает эффективную переноску микрорасчленённой тканевой гранулы во время центрифугирования в шаге 4.16.
  15. Тщательно закрутите трубы для сбора труб.
  16. Кратко прокрутите пробирки и храните пробирки при -80 °C до экстракции РНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите шаги с 4.5 по 4.16 для следующего образца. Протокол можно приостановить до экстракции РНК.

5. Полная экстракция РНК микродиссектируемых образцов

  1. Протрите поверхности лабораторного стола с помощью агента для дезактивации RNase.
  2. Перенесите образцы LCM из морозильника при температуре -80 °C в ледяную ванну. При желании объединяйте разные партии одних и тех же взятых образцов.
  3. Инкубировать микродиссектирующие пробирки вверх ногами при 42 °C в течение 30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта инверсия гарантирует, что вся ткань, оставшаяся на крышке после кратковременной центрифугирования (шаг 4.16), попадает в буфер пищеварения. Это обеспечивает максимальный перенос образца в буфер до регулировки объёма и высокоскоростной центрифугирования в шаге 5.4.1.
  4. Изолировать полную РНК из образцов LCM с помощью стандартного набора для экстракции РНК, оптимизированного для фиксированных тканей (см. Таблицу материалов).
    1. Отрегулировать объём в каждой пробирке до окончательных 150 мкл с помощью буфера пищеварения протеиназы K (см. таблицу материалов). Прокрутите пробирки при 11 000 × г ( 1 минута), затем перенесите образцы в стерильную трубку объёмом 1,5 мл.
    2. Добавьте 10 мкл протеиназы K (20 мг/мл) в пробирку, затем аккуратно перемешайте образцы с помощью повторного пипетирования. Это приводит к итоговому объёму 160 мкл и конечной концентрации протеиназы K примерно 1,25 мг/мл в реакции пищеварения на образец.
    3. Проведите двухэтапную инкубацию образцов: сначала при 56 °C в течение 15 минут, затем 15 минут при 80 °C. Во время каждой инкубации кратковременно вводите трубки в вихрь каждые 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимального рабочего процесса используйте две предварительно подогретые водяные бани. Если используется одна ванна, сделайте паузу после инкубации при 56 °C: удержите образцы на RT, пока ванна нагревается до 80 °C, затем продолжайте.
    4. Поместите образцы на льд на 3 минуты, затем центрифугайте при 20 000 × г ( 15 минут).
    5. Аспирируйте очищенный супернатант в новую трубку объёмом 1,5 мл, стараясь избежать попадания гранул.
    6. Добавьте в каждый образец 16 мкл буфера инкубации DNase и 10 мкл фермента DNase I (2,73 единицы/мкл, см. таблицу материалов). Затем тщательно перемешайте содержимое, аккуратно перевернув трубки. Это приводит к итоговому объёму 186 мкл и конечной концентрации ДНКазы I примерно 0,15 единиц/мкл в реакции пищеварения на образец.
    7. Сделайте быстрый поворот, чтобы собрать остаточную жидкость со стенок трубки.
    8. Инкубировать пробирки на RT в течение 15 минут.
    9. Переложите 320 мкл буфера с высоким содержанием соли (см. Таблицу материалов) на каждый образец и тщательно перемешайте образцы. Это приводит к итоговому объёму 506 мкл на образец.
    10. Передайте 720 мкл абсолютного этанола в каждую пробирку, смешайте образцы с помощью пипетки (без центрифуга) и приступите немедленно. Это приводит к итоговому объёму 1 226 мкл на образец.
      ВНИМАНИЕ: Абсолютный этанол очень воспламеняющийся. Собирайте отходы этанола в специально отведённом контейнере для негалогенированных органических растворителей для правильной утилизации.
    11. Переведите 700 мкл образцовой смеси в колонку очистки (помещённую в сборную трубку объёмом 2 мл, см. таблицу материалов). Аккуратно закройте крышку и центрифугуйте при 8 000 × г ( 15 с).
    12. Отбросьте поток из сборной трубки. Оставьте колонку очистки.
    13. Повторяйте шаги 5.4.11–5.4.12.
    14. Добавьте 500 мкл буфера на основе этанола (см. Таблицу материалов) в каждую пробирку. Аккуратно закройте крышки и центрифугуйте при температуре 8 000 × г ( 15 с). Затем отбросьте проток из трубки для сбора трубки.
    15. Повторите шаг 5.4.14 полностью, с единственной модификацией — увеличением времени центрифугации до 2 минут при 8 000 × g.
    16. Перенесите каждую колонку очистки в новую трубку объёмом 2,0 мл. Центрифугуйте при 14 000 × г ( 5 минут) с открытой крышкой, затем выбросьте трубку и остаточную жидкость.
    17. Перенесите каждую колонку очистки в новую трубку объёмом 1,5 мл. Пипетка — 16 мкл воды без РНазы на мембрану, закрыть крышку и центрифугировать при 14 000 × г (5 мин) для облегчения элюции всей РНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все образцы элюированных РНК храните на льду для шагов 5.5 и 5.6, чтобы предотвратить их разрушение.
  5. Количественно определить образцы РНК и проверить чистоту (соотношение A260/A 280 ) с помощью спектрофотометрии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измерение концентрации и чистоты (соотношение260/A 280 ) на этом этапе, вместе с оценкой целостности в шаге 5.6, служит окончательной количественной точкой для успешного восстановления РНК. Ожидается чёткая РНК-элюат.
  6. Проведите электрофорез агарозного геля с концентрацией геля 1% и определите число целостности РНК (RIN) с помощью биоанализатора для оценки качества РНК.
  7. Храните образцы РНК при -80 °C до проведения qRT-PCR или RNA-Seq.

6. Анализ РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: qRT-PCR описан в шагах 6.1 и 6.2, а RNA-Seq — в шаге 6.3.

  1. Подготовьте смесь обратной транскрипционной реакции и добавьте 50 нг общей РНК за каждую реакцию на льду. Проводите реакцию обратной транскрипции с использованием термического циклера согласно предоставленным инструкциям (см. Таблицу материалов).
  2. На льду подготовьте количественную мастер-смесь ПЦР для β актина согласно инструкциям производителя (см. Таблицу материалов для последовательностей грунтовок). Проведите амплификацию ПЦР в реальном времени на количественной ПЦР-системе с использованием рекомендованного производителем протокола циклирования с 10 нг кДНК на реакцию.
  3. Используя комплект с низкой входной цепочкой (см. Таблицу материалов), создайте библиотеки РНК-Seq из 50 нг общей РНК. Определите размер и концентрацию библиотеки с помощью биоанализаторной системы (см. Таблицу материалов), а затем выполните парное секвенирование на высокопроизводительной платформе (см. Таблицу материалов).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспериментальный рабочий процесс, включающий фиксацию ПФА, обезвоживание сахарозы на 30%, вложение и криосекцию ОКТ, окрашивание гематоксилином, идентификацию и точный сбор целевой области (~1 000 клеток) с помощью ЛКМ, лизис клеток, выделение РНК, метрики контроля качества РНК и два ключевых аналитических применения, изложен на рисунке 1. Гематоксилин-окрашенный срез печени на стекле PEN показан под микроскопом до (рисунок 2A)...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сила ЛКМ заключается в его точном, непосредственном захвате отдельных клеток или областей тканей, что облегчает изучение определённых областей в гетерогенной ткани. Однако низкий выход образцов, трудоёмкий процесс, высокая стоимость и необходимость специализированного оборудования ограничивают широкое применение этого метода влабораториях 23. В этом исследовании был разработан протокол LCM-РНК для преодоления ключевых исторических ограничений. Этот проток...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была частично поддержана грантами от Национального фонда естественных наук Китая (82070589), Гуандунского фонда естественных наук (2022A1515010218) и проекта Гуанчжоуского плана науки и технологий (206077078001) профессору Янь Вану. Мы благодарны Биомедицинскому исследовательскому центру Южного медицинского университета за техническую поддержку и доступ к системе микродиссекции лазерного захвата.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<Сильный>Материал
0,2 мл тонкостенные трубкиAxygenPCR-02-CТрубки для сбора LCM
Центрифугная трубка объемом 1,5 млAxygen339653
4% параформальдегидLeageneDF0135
Центрифугная трубка объемом 50 млThermoFisher Scientific339653
DEPC (диэтилпирокарбонат)SigmaD-5758
Набор пищеварения DNase IЦягэн73504Компонент комплекта RNeasy FFPE включает раствор DNase I и буфер для усилителя DNase
Этанол (100%)Термо Фишер СайентификBP2818Очищено для молекулярной биологии
Буфер для промывки на основе этанолаЦягэн73504Buffer RPE (компонент комплекта RNeasy FFPE)
Буфер для мытья с высоким содержанием солиЦягэн73504Буферный эритроцит (компонент комплекта RNeasy FFPE)
Низкопрофильные микротомные лопастиLeica Biosystems819
Майер' гематоксилин sLeageneDH0001
Соединение ОКТСакура4583
Стекло с мембранным покрытием PENLeica11505188
Фосфатный буферный физиологический растворLeageneCC0010Без ДНКаз/РНазы
Поли-L-лизинМаклинP875131S
Буфер пищеварения протеиназы KЦягэн73504Buffer PKD (компонент комплекта RNeasy FFPE)
Колонна очисткиЦягэн73504Спин-колонка RNeasy MinElute (компонент комплекта RNeasy FFPE)
Количественный мастер-микс ПЦРTakara BioRR820ATB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)
Набор для обратной транскрипцииЦягэн205411Набор для обратной транскрипции QuantiNova
Набор для экстракции РНКЦягэн73504Комплект RNeasy FFPE
Набор для секвенирования РНК (с низким входом, застрял)Takara Bio634412SMARTer stranded total RNA-seq kit — пико-вводный млекопитающий v2
Агент для дезактивации РНазойSolarbioSR0040Уборка
СахарозаМаклинS818049
<Сильный>Животные и рацион
Мышь: C57BL/6JЦентр лабораторных животных провинции Гуандун03
<сильная>Особенная диета и специальная диета Питьевая вода< крепкая>
Диета с высоким содержанием жиров и дефицитом холина (базовая диета)TROPHIC Animal Feed High-Tech Co., Ltd.TP36310MМакроэлементы: белок, 14 ккал%; углеводы — 26 ккал; жир, 60 ккал%)
Питьевая вода с добавлением сахараМаклинN/A (подготовлено внутри компании)Смесь D-глюкозы (Macklin, Cat# F87500) и D-фруктозы (Macklin, Cat# S818049) была добавлена в автоклавную питьевую воду при конечной концентрации 42 г/л с соотношением глюкозы к фруктозе 55:45 (ш/ч)
<сильные>Мышиные праймеры
β-actin (Вперед: AGAGGGAAATCGTGCGTGAC )Секвенирование BGIПерсонализацияОчищенные ВЭЖХ
β-actin (Реверс: CAATAGTGATGACCTGGCCGT)Секвенирование BGIПерсонализацияОчищенные ВЭЖХ
<Сильно>Снаряжение
Микротом криостатаLeica BiosystemsCM3050 S
Биоанализаторная системаAgilentG2939BA
Высокопроизводительная платформа секвенированияIllumina; Inc.Система NovaSeq 6000
Система микродиссекции лазерного захватаLeica MicrosystemsLeica LMD6500
Количественная система ПЦРПрикладные биосистемыСистема ПЦР в реальном времени QuantStudio 5
СпектрофотометрThermoFisher ScientificNP80NanoDrop
Термальный циклерBioRadT100
<Сильный>Софт
Adobe Illustrator CC 2019 (версия 23.0.2)Adobehttps://www.adobe.com/products/illustrator.html
GraphPad Prism (версия 8.3.0)Программное обеспечение GraphPadhttps://www.graphpad.com

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
  2. Halpern, K. B., et al. Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver. Nature. 543 (7647), 352-356 (2017).
  3. Aizarani, N., et al. A human liver cell atlas reveals heterogeneity and epithelial progenitors. Nature. 572 (7768), 199-204 (2019).
  4. Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  5. Baron, C. S., et al. Cell Type Purification by Single-Cell Transcriptome-Trained Sorting. Cell. 179 (2), 527-542.e19 (2019).
  6. Gross, A., et al. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 16 (8), 16897-16919 (2015).
  7. Dries, R., et al. Advances in spatial transcriptomic data analysis. Genome Res. 31 (10), 1706-1718 (2021).
  8. Chen, A., et al. Spatiotemporal transcriptomic atlas of mouse organogenesis using DNA nanoball-patterned arrays. Cell. 185 (10), 1777-1792.e21 (2022).
  9. Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), 78-82 (2016).
  10. Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nat Protoc. 1 (2), 586-603 (2006).
  11. Baba, N., et al. Gene expression profiling in biliary epithelial cells of primary biliary cirrhosis using laser capture microdissection and cDNA microarray. Transl Res. 148 (3), 103-113 (2006).
  12. Mena, J. E. T., et al. Laser capture microdissection after γ-glutamyl transferase histochemistry: An optimization for gene expression analysis. Anal Biochem. 447, 126-132 (2014).
  13. Liu, Y., et al. Next-generation RNA Sequencing of Archival Formalin-fixed Paraffin-embedded Urothelial Bladder Cancer. Eur Urol. 66 (6), 982-986 (2014).
  14. Ludyga, N., et al. Nucleic acids from long-term preserved FFPE tissues are suitable for downstream analyses. Virchows Arch. 460 (2), 131-140 (2012).
  15. Mägel, L., Bartels, S., Lehmann, U. Next-Generation Sequencing Analysis of Laser-Microdissected Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded (FFPE) Tissue Specimens. Methods Mol Biol. 1723, 111-118 (2018).
  16. Von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. Determinants of RNA Quality from FFPE Samples. PLoS One. 2 (12), e1261(2007).
  17. Böhm, M., Wieland, I., Schütze, K., Rübben, H. Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue. Am J Pathol. 151 (1), 63-67 (1997).
  18. Schütze, K., et al. Cut out or poke in--the key to the world of single genes: laser micromanipulation as a valuable tool on the look-out for the origin of disease. Genet Anal. 14 (1), 1-8 (1997).
  19. Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histol Histopathol. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  20. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), e2565(2010).
  21. Ge, S. J., Gan, W. Q., Karlinsey, K., Zhou, B. Y., Pachter, J. S. Immuno-laser capture microdissection of perfusion-fixed mouse brain tissue coupled to RNA-seq. J Neurosci Methods. 423, 110548(2025).
  22. Takahashi, K., Beltran, W. A., Sudharsan, R. An optimized workflow for transcriptomic analysis from archival paraformaldehyde-fixed retinal tissues collected by laser capture microdissection. Exp Eye Res. 246, 109989(2024).
  23. Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Methods Mol Biol. 1723, 1-17 (2018).
  24. Kim, S. O., Kim, J., Okajima, T., Cho, N. J. Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy. Nano Converg. 4 (1), (2017).
  25. Erickson, H. S., et al. Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples. Nat Protoc. 4 (6), 902-922 (2009).
  26. Pan, D. Y., et al. Laser Capture Microdissection-Based RNA Microsequencing Reveals Optic Nerve Crush-Related Early mRNA Alterations in Retinal Ganglion Cell Layer. Transl Vis Sci Technol. 9 (11), 30(2020).
  27. Civita, P., et al. Laser Capture Microdissection and RNA-Seq Analysis: High Sensitivity Approaches to Explain Histopathological Heterogeneity in Human Glioblastoma FFPE Archived Tissues. Front Oncol. 9, 482(2019).
  28. Phan, H. V., et al. High-throughput RNA sequencing of paraformaldehyde-fixed single cells. Nat Commun. 12 (1), 5636(2021).
  29. Thomsen, E. R., et al. Fixed single-cell transcriptomic characterization of human radial glial diversity. Nat Methods. 13 (1), 87-93 (2016).
  30. Lin, X. J., et al. A comparative analysis of RNA sequencing methods with ribosome RNA depletion for degraded and low-input total RNA from formalin-fixed and paraffin-embedded samples. Bmc Genomics. 20 (1), 831(2019).
  31. Luzzi, V., Mahadevappa, M., Raja, R., Warrington, J. A., Watson, M. A. Accurate and reproducible gene expression profiles from laser capture microdissection, transcript amplification, and high density oligonucleotide microarray analysis. J Mol Diagn. 5 (1), 9-14 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Laser Capture MicrodissectionParaformaldehyde Fixed TissueMouse Liver TissueRNA ExtractionCryosectioningHematoxylin StainingOCT EmbeddingRNA SequencingHepatocyte ProfilingReal Time PCR

Похожие статьи