$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Экспериментальный рабочий процесс оценки эффективности микробных инокулянтов в повышении устойчивости к водному стрессу у салата Ромейн (Lactuca sativa L. var. Paspartu) изложен на рисунке 1. Протокол интегрировал непрерывный мониторинг точных режимов орошения с периодическим сбором физиологических и тепловых данных. Использовались два различных микробных продукта: (I) микробный консорциум — сложный консорциум из 67 штамм, включающий PGPR, актиномицеты и полезные грибы, предназначенный для физиологического буфера через колонизацию корней и секрецию экзополисахаридов (EPS); и (II) Trichoderma harzianum — инокулянт одного штама Trichoderma harzianum , направленный на индуцирование системной устойчивости и изменение корневой архитектуры. Используемые реагенты, оборудование и программное обеспечение перечислены в Таблице материалов.
1. Микробная инокуляция
Для обоих микробных обработок был реализован стандартизированный режим инокуляции, состоящий из шести применений, пропитанных почвой, направленных на ризосферу с использованием высокоточных микропипеток для моделирования дозировок в полевых условиях. Первая фаза проходила на этапе высадки через 5 и 15 дней после посева (DAS). На 30 DAS саженцы были пересажены в более крупные полости, при этом вторая фаза прививок проводилась через 1 день после пересадки (DAT), за которой следовали последовательные применения на 7, 15 и 20 DAT.
Для микробного консорциума дозировки корректировались в соответствии с фенологией растений: первые два применения применялись при 500 г/га (3 мл/растение), затем при пересадке была высококонцентрационная доза 2 кг/га, а завершились тремя поддерживающими дозами по 300 г/га. Аналогично, T. harzianum применялся при 1 л/га на первых двух этапах, 3 л/га при пересадке и 1 л/га для последних трёх применений. Этот поэтапный подход был разработан для обеспечения устойчивой колонизации корней и сохранения роли микробной популяции как физиологического буфера на протяжении критических периодов роста и индукции стресса.
2. Подготовка сельскохозяйственных культур
Сертифицированные семена салата Ромэн (Lactuca sativa L. var. Paspartu) проращивались в полистироловых лотках с 311 полистиролами (11 мл на полость) с использованием профессионального субстрата на основе торфяного мха на глубине 1 см. Прорастание проводилось в контролируемой биоклиматической камере с температурным диапазоном от 15 °C до 22 °C и относительной влажностью 60–70%. Достигнув 90% прорастания (примерно через 3–5 дней после посева), саженцы пересаживались в большие лотки с ёмкостью 55 мл для свободного развития корней (см. рисунок 2 и рисунок 3). Исследование было организовано по полностью рандомизированному дизайну (CRD), с 9 экспериментальными единицами (лотками) и 20 саженцами в каждом лотке. Эта система была структурирована с учётом 3 × 3 факториальных режимов (3 микробных обработки × 3 режима орошения). Подробные физико-химические свойства субстрата и специфическое программирование биоклиматических камер14приведены на рисунке 3, Дополнительной таблице 1, Дополнительной таблице 2 и Дополнительной таблице 3.
Экспериментальные лотки распределялись с использованием полностью рандомизированной схемы внутри биоклиматической камеры для устранения эффектов краёв и обеспечения равномерной экспозиции. Камера была запрограммирована на имитирование динамических полевых условий, используя режим высокой температуры для воспроизведения теплового напряжения в открытом поле. На вегетативной стадии параметры окружающей среды поддерживались в переменном диапазоне относительной влажности, а 9-часовой фотопериод обеспечивался высокоинтенсивным светодиодным освещением (установленным выше 50% максимальной ёмкости для обеспечения достаточного фотосинтетически активного излучения)15. После этапа создания экологическая программа была скорректирована с учётом усиливающихся потребностей по очистке водных дефицитов, как показано на поэтапных атмосферныхпереходах 15 (рисунок 4 и рисунок 5). Конкретные суточные и ночные значения температуры, влажности и интенсивности освещения подробно описаны в Дополнительной таблице 1 и Дополнительной таблице 2 для упрощения основного протокола.
Стратегия оплодотворения была разработана с учётом специфических фенологических потребностей ромейнского салата, поддерживая сбалансированный поток питательных веществ на протяжении всего вегетативного цикла. На стадии рассады (12–24 DAS) питательные вещества поступали путем целенаправленного применения нитрата калия (KNO 3), монокалия фосфата (KH2PO4) и кальциевой селитры (Ca(NO 3)2). Для улучшения раннего установления в течение первых 24дней вводили коммерческий биостимулятор.
С 26 DAS и до финальной оценки в 76 DAS программа оплодотворения перешла в режим поддержания, при котором биостимулятор исключался для выделения специфических эффектов микробных инокулянтов. Все применения были откалиброваны для поддержания оптимальной электрической проводимости (EC) и pH внутри ризосферы. Полный хронологический график концентраций минералов и специфическихдозировочных объёмов 16изложен в дополнительной таблице 3.
3. Лечение микроорганизмами
Для оценки эффективности биологических вмешательств против гидрического стресса были разработаны три различных метода лечения: (I) микробный консорциум — консорциум с высоким разнообразием микробов, включающий 67 полезных штаммов, включая ростоспособствующие росту растений ризобактерии (PGPR), актиномицеты и грибы; (II) T. harzianum — специализированная формула Trichoderma harzianum из одного штамма (Trichoderma harzianum); и (III) невакцинированный Контроль. Эти методы были выбраны на основе их потенциала для индуцированной системной толерантности (IST), главным образом с помощью таких механизмов, как изменение архитектуры корня, производство ACC-деаминаза и секреция экзополисахаридов (EPS).
Вакцинация проходила поэтапно и стратегически подходило. Первоначальное применение (3 мл на растение) проводилось с помощью высокоточной микропипетки непосредственно в ризосферу на второй стадии истинного листа для обеспечения ранней колонизации корней. Последующие применения были откалиброваны на полевые эквиваленты (имитируя плотность 75 000 растений/га). Для T. harzianum применялась концентрация 2 л/га, а микробный консорциум — 1 кг/га. Эти составы растворялись в орошенной воде и применялись каждые 15 дней для поддержания стабильной микробной популяции в качестве физиологического буфера на протяжении всего вегетативногоцикла 17.
4. Различные методы орошения
Для оценки физиологической и агрономической пластичности L. sativa при различных гидрических условиях были реализованы три режима орошения, основанные на замене испарения культур (ETc). Объемное содержание воды калибровалось с полевой ёмкостью подложки (FC) для обеспечения точной индукции напряжений. Режимы были определены следующим образом: (I) Контрольный/Хорошо насыщенный водой (CC-100% ETc), при котором полностью восстанавливалось испарение; (II) умеренный дефицит воды (75% ETc), предназначенный для индуцирования промежуточного гидравлического ограничения; и (III) Серьёзный дефицит воды (50% ETc), направленный на создание критического водного стресса. Орошение проводилось ежедневно после захвата тепловых изображений с помощью градуированных пипеток для точного замены объёма воды, потерянного в результате испарения18.
5. Запись данных и изображений
Для оценки теплового распределения станций и состояния воды ежедневно с понедельника по пятницу на протяжении всего экспериментального периода делались инфракрасные тепловые изображения. Все фотозаписи проводились с 12:00 до 14:00 для стандартизации измерений в период максимальной транспирации и солнечной интенсивности. Крайне важно делать эти снимки непосредственно перед ежедневными процедурами, чтобы зафиксировать накопленный водный стресс, который испытывают растения за предыдущий 24-часовой цикл. Для захвата изображений инфракрасная тепловизорная камера подключалась к мобильному устройству и поддерживала перпендикулярную ориентацию относительно задней части растений салата на постоянном расстоянии 60–70 см. Программное обеспечение было настроено с многоцветной термопалитрой, в которой температурные градиенты представлены от самого низкого к наибольшему: начиная с фиолетового (самый холодный), переходя от королевского синего, бирюзового цвета, зелёного (середина), жёлтого, оранжевого и, наконец, красного (самый горячий). В программном интерфейсе конкретная область лотка, содержащая крону растений, выбиралась вручную для сбора тепловых данных. Эта цветовая шкала служит физиологическим индикатором: хорошо гидратированные растения демонстрируют более прохладную температуру кроны (фиолетового/синего) из-за активной транспирации, тогда как обезвоженные растения демонстрируют более высокую температуру кроны (оранжево-красные) из-за закрытия устьица и снижения испарительного охлаждения. Впоследствии эти изображения высокого разрешения были обработаны с использованием трёхточечной функции измерения по определённым интересующимся областям (ROI) для получения точных значений температуры кроны (Tc) при расчёте Индекса водного стресса в посеве (CWSI).
Если CWSI — это:
0, тогда урожай не подвергается водному стрессу
1 — тогда урожай испытывает сильный водный стресс
Где:
Tc — это температура кроны посевов, измеряемая с помощью инфракрасной съёмки. Tw — это температура кроны в условиях вне водного стресса. Td — это температура кроны при максимальном водном стрессе19.
Показатели роста, развития и физиологического состояния растений, такие как высота, количество листьев и температура листьев, оцениваемые с помощью инфракрасной термографии, показаны в дополнительной таблице 4 вместе с переменными исследования и концептуальными и операционными определениями, использованными в эксперименте. Сочетание этих переменных позволило провести всестороннюю оценку влияния экспериментальных обработок на физиологическую эффективность и развитие каждого растения.
6. Анализ данных
Физиологические и морфологические данные анализировались с использованием одностороннего ANOVA для каждого режима орошения, чтобы определить эффект различных микробных обработок. Все статистические процедуры выполнялись с помощью программного обеспечения. Перед проведением инференциального анализа были проверены фундаментальные требования к параметрической статистике для обеспечения надёжности результатов. Нормальность остатков была подтверждена с помощью теста Андерсона-Дарлинга (p > 0,100), что указывало на нормальность. Кроме того, однородность дисперсий была подтверждена с помощью теста Левена (p = 0,989), что подтвердило высокую гомоскедастичность между группами. Поскольку оба предположения были выполнены, для выявления значимых различий (p < 0,05) между средними показателями использовался пост-хок тест Tukey HSD (Honestly Significant Difference). Отдельное растение было определено как экспериментальная единица для всех статистических оценок.
