Методическая статья

Секвенирование одноклеточной РНК для профилирования ганглионных и аганглионных сегментов толстой кишки у пациентов с болезнью Хиршпрунга

114 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69825

⸱

22 мая 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gastrointestinal Surgery, The Second Affiliated Hospital of Zunyi Medical University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает процесс секвенирования одноклеточной РНК для анализа инфильтрации иммунных клеток и специфичных для клеточных транскрипционных различий между ганглиоарными и аганглионарными сегментами толстой кишки при болезни Хиршпрунга.

Аннотация

Болезнь Хиршшпрунга (HSCR) — это врождённое заболевание кишечной моторики, характеризующееся отсутствием энтерических нейронов в дистальной части кишечника. По сравнению с секвенированием объёмной РНК, секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq) позволяет профилировать экспрессию генов на уровне отдельных клеток, разрешая клеточную гетерогенность, которая маскируется в анализах по усредненному популяции. Был создан стандартизированный рабочий процесс scRNA-seq для характеристики транскрипционного ландшафта ганглионных и аганглионных сегментов у пациентов с HSCR. Были собраны ткани толстой кишки, а также проведено окрашивание гематоксилином и эозином для выявления ганглионных и аганглионных областей. Ткани ферментативно и механически диссоциировались на одноклеточные суспензии, после чего проводилась фильтрация, оценка жизнеспособности и создание библиотек одноклеточных транскриптомов. Библиотеки, проходившие контроль качества, секвенировались, а сырые данные обрабатывались для количественной оценки клеток и фильтрации качества с целью удаления ячеек низкого качества и технических артефактов. После нормализации и уменьшения размерности клетки кластеризовались и аннотировались на основе установленных маркерных генов. Последующие анализы сравнивали состав типов клеток между ганглиоарными и аганглионными тканями и выявили дифференциально экспрессированные гены в ключевых подгруппах иммунных клеток. Результаты выявляют существенные различия в иммунной микросреде между ганглионными и аганглионными сегментами в HSCR.

Введение

Болезнь Хиршпрунга (HSCR) — одно из самых распространённых врождённых нарушений кишечной моторики, с частотой примерно 1 из 5 000 живорождённых в мире1. Заболевание возникает из-за неспособности клеток кишечного гребня кишечника (ENCC) мигрировать в дистальный кишечник на эмбриональной неделе 5–12, что приводит к отсутствию кишечных ганглиев в поражённыхсегментах 2. В результате аганглионный сегмент демонстрирует устойчивое спастическое сокращение и нарушенную перистальтику, что приводит к проксимальной кишечной дилатации. Клинически это проявляется как функциональная обструкция, вызывающая запор, вздутие живота и рвоту, и может быть опасно для жизни в тяжёлых случаях. Хирургическая резекция аганглионного сегмента остаётся основным методом лечения HSCR; однако значительная часть пациентов сталкивается с послеоперационными осложнениями, включая запоры, энтероколит и загрязнение кала, что значительно снижает качествожизни 3. Кроме того, после обширной резекции кишечника может возникнуть синдром короткого кишечника, что приводит к нарушению усвоения питательных веществ и усугублению клинических трудностей в лечении. Поэтому выявление основных механизмов HSCR и выявление новых терапевтических целей остаются критически актуальными клиническими потребностями.

В последние годы секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq) широко применяется для изучения молекулярных механизмов, связанных с заболеваниями. В отличие от традиционного секвенирования объёмной РНК, scRNA-seq позволяет анализировать экспрессию генов с разрешением одной клетки, что позволяет выявлять клеточную гетерогенность и редкие субпопуляции, скрытые в массовоманализе 4. В результате scRNA-seq стал мощным инструментом для анализа клеточной гетерогенности и межклеточной коммуникации, продвигая исследования в биологии имедицине 5. Этот подход выявил новые патогенные механизмы и терапевтические мишени при сложных заболеваниях, включая болезньАльцгеймера 6,ревматоидный артрит 7,рак лёгких 8 и диабет2 типа 9.

В этом исследовании scRNA-seq применялся для характеристики транскрипционного ландшафта иммунных клеток и паттернов инфильтрации в ганглионосных и аганглионных тканях толстой кишки у пациентов с HSCR. Рабочий процесс включал три основных этапа: подготовку и оценку качества суспензий отдельных клеток, создание 3′-одноклеточных библиотек РНК-секвенсий и дальнейший биоинформатический анализ. Образцы тканей сразу после резекции сохранялись в специализированном растворе для сохранения одной клетки и ферментативно диссоциированы в одноклеточные суспензии в течение 48 часов. Жизнеспособность клеток превышала 80%, а конечная концентрация клеток была скорректирована до 700–1 500 клеток/мкл до подготовки к библиотеке. Была сравнивана инфильтрация иммунных клеток между ганглионарными и аганглионными сегментами, а также выявлены субпопуляции иммунных клеток с выраженными транскрипционными различиями. Эти анализы выявляют иммунноклеточные изменения, связанные с патологией толстой кишки при HSCR.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Это исследование было одобрено Институциональным этическим комитетом аффилированной больницы Медицинского университета Цзуньи (одобрение No KYLL-2024-030). Исследование соответствует Хельсинкской декларации. Информированное согласие (устное и письменное) было получено от всех участников и их опекунов. В таблице 1 представлена информация о пациентах с HSCR.

Собирайте ткани колонки, включая ганглиоарные и аганглионные сегменты, у пациентов с HSCR, диагностированных и проходящих операцию в отделении детской хирургии Аффилированной больницы Медицинского университета Зуньи. Включите ганглиозные и аганглионные сегменты от двух мужчин с HSCR. Подробная клиническая информация приведена в Таблице 1. Все реагенты, химикаты, оборудование и программное обеспечение перечислены в Таблице материалов.

1. Окрашивание гематоксилином и эозином

  1. Сбор и фиксация тканей
    1. Зафиксировать образцы кишечной ткани в растворе фиксации параформальдегид с 4% не менее 24 часов.
      ВНИМАНИЕ: Параформальдегид токсичен и выделяет пары формальдегида. Выполняйте все процедуры в вытяжке с химическим дымом и используйте соответствующие средства индивидуальной защиты.
    2. Обрезать ткани примерно до 5 × 5 × 2мм 3 с помощью скальпеля. Положите салфетки в встроенные кассеты и смойте под проточной водопроводной водой в течение 24 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите края ткани и подготовьте блоки с хотя бы одной ровной поверхностью. Если они неровные, положите салфетку между фильтрующими бумагами после промывания.
  2. Градуированное обезвоживание этанола
    1. Погружайте ткани последовательно в растворы этанола: 70% этанола за ночь, 80% этанола 3 часа, 90% этанола 2 часа, 95% этанола I 2 часа, 95% этанола II 1 часа, 100% этанола I 1 час и 100% этанола II на 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разведите этанол (≥99,7%) сверхчистой водой до указанных концентраций.
      ВНИМАНИЕ: Проведите обработку этанола в вытяжной вытяжке с химическими парами.
    2. Снимите корзину для обезвоживания и тщательно сливайте воду между этапами.
  3. Расчистка
    1. Перенесите ткани в ксилол в течение 30 секунд для достижения прозрачности.
  4. Инфильтрация и внедрение парафина
    1. Расплавите парафин при 60 °C за день до расплавления. Подвергайте свежий воск трём циклам заморозки и оттаивания, чтобы удалить пузырьки. После третьего цикла фильтруйте расплавленный парафин через фильтрующую бумагу.
    2. Инфильтруйте ткани чистым парафиновым воском (Paraffin Wax I) в течение 1 часа.
    3. Инфильтруйте ткани в парафиновой смеси (Paraffin Wax II; чистый парафиновый воск: пчелиный воск = 8:1) в течение 2 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полностью расплавите пчелиный воск и фильтруйте перед использованием.
    4. Залейте парафин II в формы для встраивания. Положите блоки тканей вертикально и ровно, вставьте метки и дайте затвердеть.
  5. Секционирование
    1. Обрезайте парафиновые блоки, чтобы получить гладкие поверхности без разрезания ткани.
    2. Крепите блоки на микротом. Скорректируйте ориентацию и удалите избыток парафина. Нарезать серийные сечения толщиной 4 мкм. Плавающие секции на водяной бане при температуре 50 °C и переносите на стеклянные стеклянные стекла.
    3. Сушите слайды в духовке при температуре 60 °C, чтобы удалить остатки влаги.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сухие участки на 12–48 часов.
  6. Депарафинизация
    1. Проведите последовательную инкубацию: ксилол I (15 мин), ксилол II (15 мин), 100% этанол I (5 мин), 100% этанол II (5 мин), 90% этанол (5 мин), 80% этанол (5 мин), 70% этанол (5 мин) и дистиллированная вода (5 мин).
  7. Окрашивание гематоксилином
    1. Окрашивайте срезы гематоксилином в течение 50 секунд.
    2. Прополосните под проточной водопроводной водой в течение 10 минут.
  8. Эозиновое окрашивание
    1. Окрашивайте срезы эозином на 40 секунд.
  9. Обезвоживание
    1. Погружайте секции последовательно в 95% этанол I (30 с), 95% этанол II (30 с), 100% этанол I (30 с) и 100% этанол II (30 с).
  10. Расчистка
    1. Перенесите срезы в ксилол I на 10 минут и в ксилол II на 10 минут.
  11. Установка и наблюдение
    1. Добавьте монтажную среду. Накройте стеклянным накрытием и удалите воздушные пузырьки.
    2. Дайте крепленному материалу затвердеть. Изучайте секции под световым микроскопом.

2. Секвенирование одноклеточной РНК

  1. Подготовка суспензии с одной ячейкой
    1. Измельчить кишечные ткани на фрагменты размером ~1мм 3 с помощью ножниц.
    2. Инкубировать фрагменты ткани в модифицированной орлиной среде Дульбекко (DMEM), содержащие 1 мг/мл коллагеназу II и 0,1 мг/мл ДНКазу I при 37 °C в течение 30 минут с мягким перемешиванием на покачивающейся платформе (60 об/мин).
    3. Прекратите пищеварение, добавив равный объём холодного DMEM с 10% сывороткой плода (FBS).
    4. Фильтруйте подвеску через сито с элементами 70 мкм. Центрифуга при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C.
    5. Отбросьте супернатант и оставьте клеточную гранулу. Один раз промывайте фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS), содержащий 0,04% бычий сывороточный альбумин (BSA).
    6. Расщеплять сгустки клеток с помощью мягкой пипетки для получения одноклеточной суспензии.
    7. Фильтруйте подвеску через сито с элементами 40 мкм.
    8. Центрифуга при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C. Сбросьте супернатант и соберите гранулу.
    9. Ресуспензировать клетки в DMEM с 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина (P/S).
    10. Определите жизнеспособность и плотность клеток с помощью исключения трипана синего цвета. Используйте образцы с жизнеспособностью >80% и регулируйте концентрацию до 700–1 500 клеток/мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смешайте суспензию клеток с трипан-синим (1:1) и подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью гемоцитометра.
  2. Подготовка библиотеки
    1. Загружайте примерно 15 000 ячеек за запуск для подготовки библиотеки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В микрокаплях гелевых шариков в эмульсии (GEM) мРНК гибридизируется с поли(dT) олигонуклеотидами на гелевых шариках.
    2. Проведите обратную транскрипцию и амплифицируйте cДНК с помощью ПЦР (95 °C в течение 10 минут; 40 циклов при 95 °C 15 с, 60 °C за 35 с, 72 °C на 25 с; окончательное расширение при 72 °C в течение 25 с). Используйте амплифицированную cДНК для построения библиотеки 3′ scRNA-seq.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время синтеза cDNA добавляется перевес CCC, который сочетается с последовательностью олигонуклеотида с переключением шаблона (TSO).
    3. Разрушить эмульсии и восстановить кДНК из GEM.
  3. Контроль качества и секвенирование библиотеки
    1. Количественно оценить экспрессию генов и оценить распределение размера фрагментов.
    2. Выполните точную количественную оценку с помощью флуоресцентного qPCR-прибора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что концентрация библиотеки ≥10 нм.
    3. Библиотеки последовательностей с использованием инструмента секвенирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Структура чтения: Read 1 (26 bp), Read 2 (91 bp), индекс i7 (8 bp); Глубина цели ~50 000 чтений на ячейку.
  4. Data QC
    1. Выровняйте исходные чтения с референсной базой данных. Проведите подсчёт UMI и сгенерируйте матрицу по клетке.
    2. Импорт результатов в формате AnnData (Annotated Data) для дальнейшего анализа.
    3. Проведите фильтрацию качества на основе UMI, подсчёта генов и митохондриальных считываний.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите дублеты (Scrublet); Исключайте клетки с генами <200 или >5 000, total_counts >40 000, или mt_ratio >20%.
  5. Уменьшение размерности и аннотация
    1. Normalize Unique Molecular Identifier (UMI) составляет 10 000 на клетку.
    2. Идентифицировать высоковариабельные гены.
    3. Проведите анализ основных компонентов (PCA).
    4. Построим граф ближайших соседей k.
    5. Выполните встраивание UMAP.
    6. Кластерные ячейки с использованием алгоритма Лейдена в Scanpy (v1.9.3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте sc.pp.neighbors и sc.tl.leiden (разрешение = 0.5).
    7. Аннотируйте типы клеток с помощью инструмента, разработанного для автоматизированной высокоточной аннотации типов клеток в данных секвенирования одноклеточных РНК (scRNA-seq).
  6. Дифференциальный анализ
    1. Проведите дифференциальный анализ экспрессии генов в R (v4.2.2) с использованием Seurat (v4.3.0).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте функцию FindMarkers с тестом Wilcoxon rank-sum.
    2. Проведите анализ обогащения GO с помощью clusterProfiler (v4.8.1) с enrichGO.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Включает категории CC, MF и BP.
    3. Проведите анализ обогащения путей KEGG с помощью clusterProfiler (v4.8.1) с enrichKEGG10.

3. Утилизация отходов

  1. Собирайте отходы, содержащие параформальдегид и ксилол, отдельно.
  2. Нейтрализуйте кислотные растворы при необходимости или утилизируйте их как опасные отходы.
  3. Соблюдайте институциональные нормы по охране окружающей среды и безопасности (EHS).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Окрашивание гематоксилином и эозином (HE) (Рисунок 1) выявило явные гистологические различия между ганглионными и аганглионными сегментами. По сравнению с ганглионными сегментами, аганглионные сегменты демонстрировали усиленное слизистое отшелушивание, заметное уменьшение количества кубковых клеток и подслизистых нейронов, а также размытые границы между слизистым и мышечным слоями. В подгруппе срезов сохранение тканей было неоптимальным, с частичным отслоени...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Секвенирование одноклеточной РНК применялось для профилирования транскрипционных особенностей хирургически удаленных тканей толстой кишки (ганглиозных и аганглионных сегментов) у пациентов с болезньюХиршпрунга 4,5. Особое внимание уделялось стратегии диссоциации тканей, поскольку параметры диссоциации влияют на восстановление клеток, представление типа клеток и целостность РНК. Ферментативные условия пищеварения были оптимизирова...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Гуйчжоуским проектом науки и технологий (Гуйчжоу Научно-технологическое сотрудничество — Фонд — ZK — [2024] General 344) (к Х.Ф. Яну) и Контрактом на проект Zunyi (Научно-техническое сотрудничество) (Zunyi Science and Technology Cooperation HZ (2023) No (к Ю. Цюй).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Пчелиный воскSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.8012-89-3  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8012-89-3
Пчелиный воскSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.8012-89-3  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8012-89-3
Бычий сывороточный альбуминТермофишер30066575  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/30066575? SID=srch-srp-30066575
Бычий сывороточный альбуминТермофишер30066575  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/30066575? SID=srch-srp-30066575
CellTypistН/ДNAhttp://celltypist.org/tutorials/onlineguide
CellTypistН/ДNAhttp://celltypist.org/tutorials/onlineguide
Пакет профайлера кластераБиопроводникv4.8.1https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html
Пакет профайлера кластераБиопроводникv4.8.1https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html
Коллагеназа IIТермофишер17101015  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/17101015? SID=srch-srp-17101015
Коллагеназа IIТермофишер17101015  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/17101015? SID=srch-srp-17101015
Стекло на обложкеCITOTEST80340-0130  https://cn.citotest.com/pd40971476.html
Стекло на обложкеCITOTEST80340-0130  https://cn.citotest.com/pd40971476.html
Одноразовый клинок микротомаFeatherS-35  https://www.feather.co.jp/en/m_Products/pathology01.html
Одноразовый клинок микротомаFeatherS-35  https://www.feather.co.jp/en/m_Products/pathology01.html
DNase IТермофишер18047019  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/18047019? SID=srch-srp-18047019
DNase IТермофишер18047019  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/18047019? SID=srch-srp-18047019
Сушильная печьБОРУКDHG-9140A  http://www.shboruike.com/sys-pd/84.html
Сушильная печьБОРУКDHG-9140A  http://www.shboruike.com/sys-pd/84.html
Дульбекко s Модифицированный Eagle MediumТермофишер12491015  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/12491015
Дульбекко s Модифицированный Eagle MediumТермофишер12491015  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/12491015
Этиловый спиртSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.10009218  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10009218
Этиловый спиртSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.10009218  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10009218
Сыворотка плода крупного рогатого скотаТермофишерA5669801https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/A5669801
Сыворотка плода крупного рогатого скотаТермофишерA5669801https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/A5669801
Набор для окрашивания гематоксилина и эозинаBeyotimeC0105S  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& код=C0105S
Набор для окрашивания гематоксилина и эозинаBeyotimeC0105S  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& код=C0105S
Соляная кислотаSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.10011028  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10011028
Соляная кислотаSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.10011028  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10011028
Микроскопический слайдCITOTEST80302-3111  https://cn.citotest.com/pd530614548.html
Микроскопический слайдCITOTEST80302-3111  https://cn.citotest.com/pd530614548.html
Монтажная средаBeyotimeC0173-100 мл  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& code=C0173-100ml
Монтажная средаBeyotimeC0173-100 мл  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& code=C0173-100ml
Оптический микроскопNikonЗАТЕМНЕНИЕ SI  https://www.microscope.healthcare.nikon.com/ja_JP/products/upright-microscopes/eclipse-si
Оптический микроскопNikonЗАТЕМНЕНИЕ SI  https://www.microscope.healthcare.nikon.com/ja_JP/products/upright-microscopes/eclipse-si
Воск парафина Sinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.8002-74-2  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8002-74-2
Воск парафина Sinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.8002-74-2  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8002-74-2
Решение исправления параформальдегидовBeyotimeP0099-3L  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& код=P0099-3L
Решение исправления параформальдегидовBeyotimeP0099-3L  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code& код=P0099-3L
Penicillin– стрептомицинТермофишер15140122  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/15140122? SID=srch-srp-15140122
Penicillin– стрептомицинТермофишер15140122  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/15140122? SID=srch-srp-15140122
Фосфатно-буферный физиологический растворТермофишер10010023  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/10010023
Фосфатно-буферный физиологический растворТермофишер10010023  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/10010023
Качественная фильтрационная бумагаSolarbioYA0166https://www.solarbio.com
Качественная фильтрационная бумагаSolarbioYA0166https://www.solarbio.com
Программный пакет RR Foundation для статистических вычисленийv4.2.2https://www.r-project.org/
Программный пакет RR Foundation для статистических вычисленийv4.2.2https://www.r-project.org/
Ротационный микротомLeicaLeica RM2125 RTShttps://www.leicabiosystems.com/en-jp/histology-equipment/microtomes/histocore-biocut/
Ротационный микротомLeicaLeica RM2125 RTShttps://www.leicabiosystems.com/en-jp/histology-equipment/microtomes/histocore-biocut/
СкэнпиРазвитые сообществамиv1.9.3https://scanpy.readthedocs.io/en/latest/?utm_source=chatgpt.com
СкэнпиРазвитые сообществамиv1.9.3https://scanpy.readthedocs.io/en/latest/?utm_source=chatgpt.com
SeuratCRANv4.3.0https://cran.r-project.org/web/packages/Seurat/index.html
SeuratCRANv4.3.0https://cran.r-project.org/web/packages/Seurat/index.html
Сушитель тканейWuhan Junjie Electronics Co., LTDJT-12H  http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46166.html
Сушитель тканейWuhan Junjie Electronics Co., LTDJT-12H  http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46166.html
Машина для вложения тканейWuhan Junjie Electronics Co., LTDJB-L8  http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46064.html
Машина для вложения тканейWuhan Junjie Electronics Co., LTDJB-L8  http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46064.html
Трипан синий SolarbioC0040https://www.solarbio.com/haveRegion?id=48&all=0&key=%20Trypan%20Blue
Трипан синий SolarbioC0040https://www.solarbio.com/haveRegion?id=48&all=0&key=%20Trypan%20Blue
КсилолSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.10023418  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10023418
КсилолSinopharm Chemical Reagent CO., Ltd.10023418  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10023418

Ссылки

  1. Montalva, L., et al. Hirschsprung disease. Nat Rev Dis Primers. 9 (1), 54 (2023).
  2. Morera, C., Nurko, S. Hirschsprung's disease management. Aliment Pharmacol Ther. 60 Suppl 1, S66-S76 (2024).
  3. Kyrklund, K., et al. ERNICA guidelines for the management of rectosigmoid Hirschsprung's disease. Orphanet J Rare Dis. 15 (1), 164 (2020).
  4. Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: a brief overview. Clin Transl Med. 12 (3), e694 (2022).
  5. Cheng, C., Chen, W., Jin, H., Chen, X. A review of single-cell RNA-seq annotation, integration, and cell-cell communication. Cells. 12 (15), 1970 (2023).
  6. Mathys, H., et al. Single-cell multiregion dissection of Alzheimer's disease. Nature. 632 (8026), 858-868 (2024).
  7. Wu, X., et al. Single-cell sequencing of immune cells from anticitrullinated peptide antibody positive and negative rheumatoid arthritis. Nat Commun. 12 (1), 4977 (2021).
  8. Maynard, A., et al. Therapy-induced evolution of human lung cancer revealed by single-cell RNA sequencing. Cell. 182 (5), 1232-1251.e22 (2020).
  9. Lee, H., et al. Immunological link between periodontitis and type 2 diabetes deciphered by single-cell RNA analysis. Clin Transl Med. 13 (12), e1503 (2023).
  10. Kanehisa, M., Goto, S. KEGG: Kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 28 (1), 27-30 (2000).
  11. Su, K. Y., Watanabe, A., Yeh, C. H., Kelsoe, G., Kuraoka, M. Efficient culture of human naive and memory B cells for use as APCs. J Immunol. 197 (10), 4163-4176 (2016).
  12. Cancro, M. P., Tomayko, M. M. Memory B cells and plasma cells: the differentiative continuum of humoral immunity. Immunol Rev. 303 (1), 72-82 (2021).
  13. Weisel, N. M., et al. Surface phenotypes of naive and memory B cells in mouse and human tissues. Nat Immunol. 23 (1), 135-145 (2022).
  14. Phelps, A., et al. Production and use of antigen tetramers to study antigen-specific B cells. Nat Protoc. 19 (3), 727-751 (2024).
  15. Wu, X. Z., et al. Activated naive B cells promote development of malignant pleural effusion by differential regulation of Th1 and Th17 response. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 315 (3), L443-L455 (2018).
  16. Chien, C. H., Chiang, B. L. Regulatory T cells induced by B cells: a novel subpopulation of regulatory T cells. J Biomed Sci. 24 (1), 86 (2017).
  17. Tan, Z., et al. Comprehensive analysis of scRNA-seq and bulk RNA-seq reveals dynamic changes in the tumor immune microenvironment of bladder cancer and establishes a prognostic model. J Transl Med. 21 (1), 223 (2023).
  18. Ding, Q., et al. Integrated analysis of single-cell RNA-seq, bulk RNA-seq, Mendelian randomization, and eQTL reveals T cell-related nomogram model and subtype classification in rheumatoid arthritis. Front Immunol. 15, 1399856 (2024).
  19. Guo, S., et al. Integrated analysis of single-cell RNA-seq and bulk RNA-seq unravels T cell-related prognostic risk model and tumor immune microenvironment modulation in triple-negative breast cancer. Comput Biol Med. 161, 107066 (2023).
  20. Zhang, C., et al. Comprehensive analyses of brain cell communications based on multiple scRNA-seq and snRNA-seq datasets for revealing novel mechanisms in neurodegenerative diseases. CNS Neurosci Ther. 29 (10), 2775-2786 (2023).
  21. Zhang, Y., et al. Single-cell RNA sequencing in cancer research. J Exp Clin Cancer Res. 40 (1), 81 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи