Визуализация нектариев листьев и брактеальных хлопков с помощью цифровой микроскопии для повышения точности оценки и сохранения данных

Summary

Здесь мы иллюстрируем пошаговые процессы фенотипирования нектариев листьев и прицветников у хлопковых растений с помощью изображений, полученных цифровой микроскопией. Это эффективный метод оценки нектариев как листьев, так и прицветников хлопка, так как информация может быть собрана и сохранена в виде цифровых изображений.

Abstract

Нектары — это отдельные железы, производящие нектар, присутствующие у многих видов растений. Нектарии обладают разнообразной структурой и функциями. В хлопке традиционная оценка нектарного признака склонна к ошибкам, ненадёжна и имеет ограничения, поскольку фенотипы этого признака часто не видны невооружённым глазом. Экспрессия нектарных признаков контролируется генами Ne1 и/или Ne2. Кроме того, выражение признаков может зависеть от окружающей среды и стадий роста, что подчёркивает необходимость точных методов оценки. В частности, фенотипическое оценивание с помощью цифровых изображений приводит к более точному методу оценки нектариев. Этот метод преодолевает ограничения традиционного подсчёта оценок, создавая изображения высокого разрешения. Кроме того, способствует выявлению и дифференциации тонких различий экспрессии нектарных признаков, сохраняя эти цифровые изображения для будущей ссылки. Этот метод оценки фенотипирования, описанный здесь, легко адаптируется для оценки других признаков растений, таких как железы, волоски и цвет. Эти методы оценки можно адаптировать для других видов растений. В этой статье мы подробно объясняем пошаговую процедуру сбора образцов с поля или теплицы, вскрытия для их наблюдения с помощью цифровой микроскопии и сохранения этих изображений для дальнейшего анализа оценок. Для этого метода мы, например, будем использовать анализ образцов листьев и прицветников хлопковых растений, чтобы различать наличие нектариев (полностью развитых, редукционированных и рудиментарных) и их отсутствие.

Introduction

У растений есть специализированные железы, называемые нектариями, которые синтезируют и производят нектар у большинства покрытосеменных, некоторых папоротников и некоторых голосеменных 1,2,3,4. Нектары классифицируются на три типа: мезофилларные, трихоматические и эпителиальные типы, в зависимости от происхождения клеток, производящих^{нектар 5}. Нектары в хлопке — это модифицированные устьицы, состоящие из железистых трихом, известных как папиллы, и относятся к трихоматическому^{типу 5,6}. Большинство видов Gossypium содержат нектарии; однако количество нектариев, присутствующих в этом роде, варьируется от вида^{к виду 7}. Цветочные нектарии (FN) встречаются чаще, чем внецветочные нектарии (EFN) у^{растений 8}. Эти нектарии могут встречаться в любом месте на растении, кроме^{корней 1,2}. Например, Gossypium hirsutum демонстрирует как цветочные, так и внецветочные^{нектарии 9}. Домашние хлопковые растения демонстрируют три дополнительных цветочных и один цветочный^{нектарий 10}. Три дополнительных цветочных нектария — это лиственные, прицветочные и циркумбрактеальные^{нектарии 11}. Листовой нектарий вегетативен и обычно присутствует на листьях на нижней стороне средней жилки, тогда как нектарии прицветника и циркумбрактеа размножаются и развиваются у основания прицветника и поверхности абаксиальной чашки. Цветочный нектар связан с цветком, который развивается на адаксиальной (верхней) поверхности чашочки. Этот нектарный признак контролируется одним генным^{локусом 12}. Исследования, проведённые двумя независимыми исследовательскими группами, показали, что нектарный признак контролируется одним геном — Ne1 генома A или Ne2 генома D, который отображается на хромосомы 12 и 26, соответственно^12,13. Этот признак выражается только в двойном рецессивном состоянии, что означает, что только гомозиготное рецессивное состояние проявляет безнектарное признак.

Помимо этих генов, условия окружающей среды и стадии роста влияют на степень экспрессии. Поэтому нужен точный способ оценки этого признака. Текущее исследование сосредоточено на фенотипировании нектариев листьев и прицветников в хлопке. Растения с видимыми нектарными нектарами оцениваются как нектарные, а растения без этого признака —^{как безнектарные} 1,2,3,4. Основная цель этой статьи — представить точные методы оценки нектарного признака с использованием технологии цифровой микроскопии. Традиционное оценивание с помощью прямого визуального наблюдения не позволяет легко обнаружить различия в вариации экспрессии нектарного признака in situ невооружённым глазом. Эти тонкие различия в выражении нектарных признаков можно визуализировать с помощью цифровой микроскопии. Для иллюстрации — в нектаре листьев хлопка оценивание следует стандартной шкале от 1 до 4: 1 — отсутствие нектара, 2 — выступ на фенотипе вен, 3 — недоразвитые подушечки или гребни без нектара, а 4 — полностью сформированные/полные нектарии с прозрачными подушечками и^{гребнями 13}. Эта оценка фенотипа была получена с использованием цифровых изображений нектариев листьев [с использованием цифровых изображений абаксиальной (нижней) стороны средней жилки листа]. В целом отсутствие нектаров оценивается как 0, но для статистической значимости значение 0 нельзя использовать и заменять на 1. Поэтому диапазон оценок фенотипирования был изменён до 1-4 по сравнению со стандартизированной классификацией 0-4¹³. Рубрика оценки для цветов следует схожей схеме оценки: 1-4: 1 означает отсутствие нектаров, без выделенных желез без подушечек и гребней, 2 — затемненные железы, у которых нектарные отметки на подушечках и нет нектара, 3 — плохо образованные железы с слабыми или отсутствующими гребнями и/или подушечками, и 4 — полностью сформированные нектары с нектаром. Эта схема оценивания показывает 4 для нектарных фенотипов (гомозиготные/гетерозиготные доминанты для одного из генов), 3, 2 для дифференциальной экспрессии нектарных признаков, как у гетерозиготных, и 1 для безнектарных (гомозиготно рецессивные для обоих генов).

Аналогично, цветы собираются и препарируются, как описано в этой статье, для сбора цифровых изображений для оценки нектариев прицветников. Этот фенотип можно визуализировать с помощью микроскопа для точного подсчёта оценок, которые можно хранить в виде цифровых изображений. В хлопке нектарные свойства привлекают не только опылителей, но и вредителей, вызывающих потерю урожайности¹⁴. Для решения этой проблемы селекционеры выбрали растения без нектарных (без нектари) признаков в качестве альтернативы естественному контролю вредителей без использования химических пестицидов^9,15. Черта без нектариев изначально была заимствована из Gossypium tomentosum к Gossypium hirsutum (выращиваемый хлопок Апленд)⁸. Этот метод оценки особенно полезен для выявления безнектарной сегрегации признаков в популяциях, возникающих при скрещивании нектарных родителей с родителями без нектари. В результате этих скрещиваний разных родителей F₂ (Второе поколение сыновей) демонстрирует разные генотипы: гомозиготные нектарные, гетерозиготные нектарные и гомозиготные без нектари. Для экспрессии нектарных признаков требуется только один доминирующий ген, что соответствует соотношению сегрегации 15:1 (9:3:3:1). Следовательно, 1 из 16 выражает признак без нектариев в гомозиготном рецессивном состоянии с генотипом ne1ne1ne2ne2. Однако исследователи в программах разведения обнаружили больше безнектарных линий, чем ожидаемое соотношение 1 к 16. Это означает, что нектарный признак экспрессируется, когда гены экспрессируются как Ne1Ne1Ne2Ne2, Ne1ne1Ne2ne2, ne1ne1Ne2Ne2, ne1ne1Ne2ne2, Ne1ne1ne2ne2, and ne1ne1ne2Ne2. Разнообразная схема экспрессии нектарных признаков в таких популяциях гомозиготных нектарных (Ne1Ne1Ne2Ne2), гетерозиготный нектарий (Ne1ne1Ne2ne2), и гомозиготные без нектариев (ne1ne1ne2ne2) растения можно идеально оценить, обнаруживая изменения, визуализированные на цифровых изображениях^12,13. Поскольку гетерозиготные растения с пониженным нектаром могут не проявлять внешний вид нектарного признака и могут напоминать безнектарный признак без нектара, визуальное фенотипирование создает трудности для надёжного отбора этого признака. Эти проблемы усугубляются в поздний вегетационный период, когда нектары отсутствуют в некоторых сортах хлопка. Различия между гетерозиготными растениями и гомозиготными растениями без нектариев легко обнаружить с помощью цифровой визуализации: у гетерозиготных растений может быть небольшой или уменьшённый нектар, а гомозиготные — полностью отсутствует этот признак. Фенотипично наличие нектара классифицируется как нектарное (гомозиготное/гетерозиготное с как минимум одним доминантным геном), наличие мелких или рудиментарных нектариев — как гетерозиготные, а отсутствие нектариев — как гомозиготные растения без нектариев. Цифровая оценка изображений снизила неточную оценку гетерозиготных растений как растений без нектарива. Аналогично, средняя стадия цветения предпочтительна при максимальном выражении признаков. Поэтому на этом этапе были собраны образцы листьев и цветов для проведения экспериментов по оценке фенотипов с целью точного и надёжного определения нектарных признаков. Кроме того, визуализация нектарных признаков с помощью цифровой микроскопии предотвращает/снижает ложноположительные показатели популяций без нектарных признаков. Это фенотипическое оценивание нектарного признака также используется в картографических исследованиях для выявления ДНК-маркеров, связанных с безнектарным признаком, которые заводчики могут использовать для маркерно-ассистированного отбора (MAS) безнектарного признака¹³. Эту технику оценки можно распространить на другие виды растений, а также изучать другие признаки, такие как железы, волоски и цвет. В целом, цифровая оценка изображений не только решает проблему неточного определения нектарных признаков, предоставляя изображения высокого разрешения, но и выявляет тонкие изменения выражения и сохраняет цифровые изображения для будущего использования. Хлопок с безнектарным свойством может использоваться для биоконтроля вредителей, а также для ответов на исследовательские вопросы о том, как этот признак способствует полезным взаимодействиям насекомых.

Protocol

1. Отбор листьев в теплице/поле (рисунок 1)

1. Подготовьте образцы пакетов с zip-lock с образцовыми ID. Храните пробные пакеты при комнатной температуре до использования.
2. Поставьте холодильник в холодильник за день до начала сбора образцов. Положите пакет со льдом из морозильника на дно холодильника. Поставьте пластиковый лоток на пакет со льдом в холодильнике.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой цели можно использовать любой портативный кулер. Поместите ледяной пакет в холодильник, затем пластиковый лоток (это отделение предотвращает повреждения от замерзания, которое возникает при прямом контакте образца со льдом) перед транспортировкой холодильника на место сбора образцов.
3. Транспортируйте охлаждающие и подписанные пакеты zip-lock в теплицу или поле для сбора образцов. Планировали регулярные опрыскивания для полевых растений для сбора образцов без вредителей. Аналогично, для теплиц регулярно применялись графики опрыскивания и удобрений для здоровья растений.
4. Соберите молодую ткань листьев с отдельных теплиц или выращенных в полевых хлопковых растениях возрастом от 8 до 12 недель в маркированные образцовые пакеты.
   1. Выберите среднюю стадию цветения для выборки образца из-за наибольшего выражения нектарного признака на этой стадии. Выбирайте молодые листья из всех растений на этом этапе развития. Помимо генетического и экологического влияния, нектарный признак также зависит от стадии развития.
   2. Чтобы поддерживать постоянную стадию развития для сравнения различных генотипов в популяции_F2 , на одном этапе берите образцы листьев равномерно, чтобы ограничить сравнение до этой стадии. Используйте размер листья от 5 до 7 см в качестве ориентира, но молодые листья одинакового размера можно собрать из всех образцов. Старые листья демонстрируют экспрессию нектарных признаков, но в некоторых линиях этот признак не проявляется на поздних стадиях развития. Чтобы избежать этой вариации и повысить согласованность сбора данных, следуйте этим инструкциям при сборе образцов.
5. Соберите образец ткани листьев и положите его в соответствующий пакет. Соберите не менее 2 листьев на образец растения.
6. Для ткани листа выбирайте здоровые листья шириной 5–7 см по лопатке от верхней ветви растения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех образцов предпочтительнее молодые листья, присутствующие на верхних ветках. Такой тип сбора образцов не только ограничивает выборку конкретной стадией развития, но и снижает ошибки в фенотипизации, сохраняя тип образца постоянным. Другие параметры включают лёгкий доступ и здоровые листья. Согласованное сравнение данных будет проведено, когда несколько листьев растений будут собраны на одной стадии развития для выявления генотипических фенотипических различий в популяции.
7. Поместите каждый запечатанный пакет с тканями листьев в холодильник. Перенеси холодильник в лабораторию.
8. Переместите отдельные образцы в холодильник для поддержания температуры охлаждения 4 °C. Храните образцы в холодильнике до цифровой визуализации нектара. Листья можно хранить до 2 дней для цифровой съёмки, но предпочтительнее делать снимки в тот же день или на следующий день.
9. Для скрининга большого количества образцов листьев собирайте образцы партиями, чтобы завершить визуализацию в течение одного дня после сбора урожая. Собирайте образцы партиями по 10-20 человек или используйте несколько охладителей, чтобы предотвратить повреждение тканей или их складывание. При сборе образцов следует быть осторожны для качественных цифровых изображений.

2. Отбор проб цветов в теплице/поле (рисунок 1)

1. Следуйте шагам 1.1–1.6. Собирайте цветы с теплицы или хлопкового растения, выращенного в поле, возрастом от 8 до 12 недель. Соберите как минимум 2 цветка на каждый образец растения.
   1. Обычно собирайте цветы с верхних веток, когда растения находятся в средней стадии цветения. Нектарный признак проявляется наибольшее выражение на стадии среднего цветения.
2. Соберите здоровые цветы. Положите каждый запечатанный пакет с как минимум двумя цветами в холодильник. Перенеси холодильник в лабораторию.
3. Переместите отдельные образцы в холодильник для поддержания температуры охлаждения 4 °C. Храните образцы в холодильнике до цифровой визуализации нектариев прицветников.
   1. Обрабатывайте образцы в тот же день или на следующий день после сбора. Соберите образцы цветов, храните их при 4 °C и обрабатывайте нектарные прицветники в тот же день. Собирайте цветы, которые появляются позже на следующий день или позже в течение недели, и обработайте в тот же день для цифровой съёмки нектариев прицветников.

3. Начальная установка цифрового микроскопа (дополнительный рисунок 1)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для цифрового захвата и хранения изображений могут использоваться другие сопоставимые микроскопы.

1. Включите микроскоп (VHX 600) и выполните начальные шаги. Положите полусложенный белый лист формата A4, который соответствует размеру ступени микроскопа.
2. Регулируйте свет на платформе/сцене микроскопа с помощью маленьких световых ручок на контроллере консоли.
3. Переведите выключатель света (маленькую ручку на консоли) на максимум для максимального освещения и яркости (большая ручка на консоли) на среднюю высоту, повернув ручку на консоли на 3/4 пути.
4. Встроенное программное обеспечение VHX 600 показывает настройки объектива на экране компьютера. Отрегулируйте объектив на 10-кратное увеличение, выбрав опцию 10x на экране. Включите выключатель питания монитора на экране компьютера, и появится главное меню с опциями объектива и записи изображения.
5. Возьмите небольшое количество образцов (от 3 до 5) из холодильника в холодильник для цифровой съёмки. Поставьте холодильник с образцами рядом с микроскопом.
6. Держите разделочную доску и стерильное лезвие на столе рядом с микроскопом. Выберите один образец из холодильника и вынимите ткань образца для цифровой визуализации (рисунок 1).

4. Цифровая визуализация и оценка нектара листьев (рисунок 2)

1. Следуйте шагам 1 и 3. Откройте пакет с образцом с зип-локом и положите образец листа на разделочную доску. Отрежьте черешок листа стерильным лезвием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для безопасного использования лезвий носите перчатки и держите острые края лезвия наклонёнными от пальцев, а ткань — между пальцами во время разреза.
2. Перенесите ткань листа на заранее вырезанную белую пластину, размещённую на сцене. Переверните ткань листа в центре стадии микроскопа так, чтобы абаксиальная сторона была обращена вверх.
3. Сосредоточьтесь на средней жиле листа, аккуратно поворачивая крупные и тонкие настройки ручек микроскопа. Продолжайте корректировать, пока изображение не исчезнет размытия.
4. Поскольку нектар находится на нижнем конце средней жилки, держите его по центру там, где наблюдались средняя жилка и расходящиеся последующие жилки. Держите лист в центре и фокусируйте на сцене.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В домашнем хлопке наблюдается только один нектарий листьев, тогда как у диких видов три нектария — по одному на средней жилке и по одному на каждой боковой жилке с обеих сторон средней жилки (всего нектариев :3).
5. Отрегулировать грубые и тонкие настройки микроскопа для повышения чёткости цифрового изображения. Внесите все корректировки изображения, чтобы запечатлеть и сохранить нектарное изображение листа.
   1. Чтобы избежать отражения света на цифровом изображении, выключите все светильники и запишите изображение на экран компьютера. Выключите все светильники в комнате и используйте настольную лампу для обработки каждого образца. После выполнения всех шагов выключите лампу, оставьте включённым только свет микроскопа и запишите изображение.
6. Сохраняйте изображение, когда программа подскажет окно с несколькими вариантами сохранения. Сохраняйте изображение (помечая каждое изображение) с ID-номером образца. Оцените цифровое изображение нектара листьев на 1, 2, 3 и 4 на основе фенотипа нектара. Обновите таблицу оценок для каждого идентификатора образца.

5. Цифровая визуализация и оценка нектара прицветника (рисунок 3)

1. Следуйте шагам 2 и 3. Перенесите небольшое количество образцов цветов (2-3) для визуализации. Достаньте образец цветка из пакета с зип-замком.
2. Удалите прицветники с цветка щипцами или вручную. Положите цветок на чистую разделочную доску. Используйте стерильное лезвие, чтобы обрезать стебель цветка. Используйте стерильное лезвие, чтобы сделать прямой разрез вдоль края удалённых прицветников.
3. Положите ткань вверх ногами (с черешком вверх) на заранее вырезанный белый лист, разложенный на стадии микроскопа.
4. Используйте грубые и тонкие настройки для улучшения чёткости изображения, отображаемого на экране. Сделайте все настройки изображения и нажмите кнопку записи на контроллере консоли, чтобы запечатлеть изображение листа.
   1. Настройте изображение, установив маленькую ручку/выключатель света на максимум, а большую ручку/переключатель яркости — на средне-высокий (поворачивая ручку на 3/4^). Затем улучшите разрешение изображения, вращая крупные и тонкие настройки микроскопа. Держите эти корректировки постоянными и меняйте сэмплы до тех пор, пока изображения для всего набора не будут записаны. Чтобы избежать отражения света на цифровом изображении, выключите все светильники и запишите изображение на компьютер.
5. Затем программа предлагает окно с отображением всех расположений компьютера для сохранения изображения. Сохраните цифровое изображение в компьютере с ID-номером образца.
6. Оцените нектарные прицветники (дополнительный рисунок 2) по 1, 2, 3 и 4 на основе фенотипа, наблюдаемого на полученных цифровых изображениях. Обновите таблицу оценок с указанием идентификатора образца и соответствующего результата для будущего анализа

Results

Для этого исследования были отобраны хлопковые растения, выращиваемые в поле в течение 8–12 недель. Для каждого растения для каждого типа ткани было собрано как минимум две технические реплики. Здоровые молодые образцы листьев собираются с верхних веток длиной от 5 до 7 см. Здоровые образцы цветов собираются с раскрытых цветов или бутонов, которые раскроются в тот же день. Образцы листьев и цветов были собраны в поле с разных растений, а цифровые изображения для обоих типов тканей были получены в лаборатории с помощью микроскопа (см. рисунок 1). Все этапы были выполнены как описано выше — от сбора образца до визуализации (как объяснено на рисунках 2 и 3). Репрезентативные результаты как для нектаров листьев, так и для прицветников обычно показывают отсутствие нектара (1), наличие нектара с промежуточными фенотипами (2, 3) и полностью развитых нектариев, производящих нектар (4). Данные, полученные на рисунке 4, — это цифровые изображения, полученные с двух разных хлопковых заводов (нектарных и безнектарных). Результаты цифрового изображения абаксиальной поверхности листа (на нижней стороне средней жилки) показали два фенотипа с оценками 1 (без нектариев на средней жилке) и 4 (с полностью развитым нектаром с нектаром; Рисунок 4A,B). Аналогично, при анализе образцов цветов на предмет нектариев прицветников, были выявлены два фенотипа 1 (без нектара) и 4 (полностью сформированный нектар, производящий нектар; Рисунок 4C,D). В идеале, чтобы и листья, и цветы, собранные с одного и того же растения, должны следовать одинаковой узору, то есть безнектарный лист и цветок без нектария принадлежат одному растению, а нектарный лист и нектарный цветок — одному и тому же растению. Рисунок 5 выполнен путём сбора цифровых изображений нектариев листьев и прицветников нектарных растений в 10x, 20x и 40x для чёткого визуализации нектарных признаков. Кроме того, чтобы понять, как это оценивание даётся при сегрегации_F2 популяций нектарных и безнектарных хлопковых родителей, были собраны ткани листьев из одной из этих популяций и получены цифровые изображения для каждого образца нектара листа. Выбранные цифровые изображения листов, соответствующие стандартному формату оценок 1, 2, 3 и 4, выделены на рисунке 6¹³. Распространённый и легко определимый шаблон — отсутствие нектара и наличие нектара. Отсутствие нектара получает наименьшую оценку, а полностью развитый нектарий — наивысший балл 4. Диапазон оценок от 1 до 4, которые составляют 2, 3, недоразвит и меньше, чем обычные нектарии. Этот паттерн можно наблюдать у гомозиготных безнектариев, то есть 1 (отсутствует), гетерозиготного состояния, например, в 2 и 3 баллах (редуцированные нектари), и 4 (полностью развитых) нектаров. Кроме того, можно выращивать нектарные и безнектарные родительские линии вместе с популяциями для сравнения и понимания этих различий.

Рисунок 1: Обзор этапов визуализации нектариев листьев и прицветников, начиная от отбора проб до цифровой микроскопии. (A) Выберите хлопковые растения на стадии среднего цветения для сбора образцов листьев и цветов. (B) Собирать образцы листьев в поле для наблюдения нектарных признаков на листе. (C) Перевернуть лист так, чтобы абаксиальная сторона листа была обращена вверх, и наблюдать нектарный признак в выделенной области чёрного ящика. (D) Разместите лист на стадии микроскопа и оставьте фокус в выделенной области чёрного ящика для записи цифровых изображений нектара листа. (E) Собирать цветы на стадии цветения на поле (A). (F) Сделайте разрез, положив цветок на разделочную доску и вырезая по прямой линии в области белого ящика в направлении стрелки, разделяя основание цветка. (G) Разместить вырезанный участок на стадии микроскопа для цифровой визуализации нектариев прицветников. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Пошаговая процедура цифровой визуализации и оценки нектариев листьев в хлопке. 1. Соберите листовые материалы с поля в маркированные образцовые пакеты и поместите его в холодильник 2. Транспортируйте холодильник с образцами в лабораторию 3. Доставайте отдельные образцы из холодильника 4. Откройте индивидуальный пакет для образца и достаньте пятый лист. Обрежьте черешок листа вручную или используйте лезвие. 6. Поместите лист на заранее установленную стадию микроскопа так, чтобы абаксиальная (нижняя) сторона была обращена вверх 7. Настройте зум на 10x в программе VHX 600 на экране компьютера. Регулируйте грубые и тонкие настройки микроскопа для максимального разрешения изображения. 8. Посмотрите на экран компьютера на предмет корректировок изображения, наблюдаемого на экране компьютера (регулировать свет и яркость, регулируемые малыми и большими ручками, вращая эти ручки, используйте тонкие и грубые кнопки на микроскопе для лучшего разрешения изображения, а также выключайте другие источники света для удаления отражений и т.д.) в нектарии листьев 9. Сохраните цифровое изображение для подсчёта оценок. Тире вокруг нектария в листе подчёркивает область нектара листьев на изображениях 8 и 9. Наблюдайте нектарные листья под микроскопом при увеличении 10x (100 мкм). В домашнем хлопке наблюдается только один нектарий листьев (как показано на этом изображении). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Поэтапная процедура цифровой визуализации и оценки нектариев прицветника в хлопке . 1. Соберите образцы цветов с поля в маркированных пакетах и храните их в холодильнике 2. Выньте один образец из холодильника 3. Убери один цветок 4. Удалите прицветники вручную, отрезав их от цветка 5. Сделайте разрез стерильным лезвием, прорезая по краю прицветника по прямой линии (белая рамка показана на рисунке 1 перед цифровой съёмкой нектариев прицветников) 6. Переверните вырезанный участок 7. Разместите разрезанную часть с черешком вверх на стадии 8 стадии микроскопа. Регулируйте свет с помощью выключателей света и яркости на консоли, прикреплённой к микроскопу. Используйте крупные и тонкие настройки микроскопа для сбора изображений с хорошим разрешением. Все изображения наблюдаются под микроскопом при увеличении 10x (100 мкм). Собирайте цифровые изображения для оценки нектариев прицветников. Круги на цифровых изображениях нектара прицветника подчёркивают наличие нектара, а в домашнем хлопке есть 3 нектара прицветников. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Цифровые изображения нектара хлопковых листьев и нектара прицветников .(A) Лист с нектаром; (B) Лист без нектара; (C) Цветок показывает 3 нектара прицветников, и (D) цветок не содержит нектариев прицветников. Наблюдайте как листья, так и цветочные нектарии под микроскопом при увеличении в 10 раз (100 мкм). Круги в форме тире показывают наличие и отсутствие нектара в нектаре листьев и прицветников. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: Нектары листьев и прицветников были увеличены на 10x, 20x и 40x для чёткой идентификации нектаров на цифровых изображениях. (A) Собрать образцы листьев для наблюдения за нектарным признаком на средней жилке. (B) Наблюдайте за нектарием листьев на средней жилке под микроскопом при увеличении в 10 раз. (C) Наблюдайте за нектарием листьев на средней жилке под микроскопом при увеличении в 20 раз. (D) Наблюдайте нектарий листьев на средней жилке под микроскопом при увеличении в 40 раз. (E) Секция для цветков для нектариев прицветников. (F) Наблюдать нектарные прицветники под микроскопом при увеличении в 10 раз. (G) Наблюдать нектарные прицветники под микроскопом при увеличении в 20 раз. (H) Наблюдать нектарные прицветники под микроскопом при увеличении в 40 раз. Масштабные полосы на каждом изображении отражают увеличение, при котором были сделаны изображения нектара нектара листов или прицветника (показано здесь как 10x, 20x и 40x). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6: Стандартная схема оценки нектара листьев по схемам 1, 2, 3 и 4. (A) Образец листа без нектара, выделенный пунктирными кругами (Оценка 1 за отсутствие нектара). (B) Наблюдаемый нектарий мелких листьев демонстрирует закономерность одного из гетерозиготных условий (пунктирный круг нектара оценен как 2). (C) Нектарий листьев с баллом 3, ещё один узор гетерозиготы. (D) Полностью сформированные нектарии с результатом 4. Масштаб 10x — это увеличение, при котором были сделаны изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7: Нектарий листьев и нектариев прицветников без использования микроскопа. На рисунке показано, как нектарии выглядят с традиционной оценкой. Эта цифра была адаптирована из¹³. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 8: Возможные генотипы популяции На рисунке показаны генотипы популяций_F2 , возникающие в результате скрещивания различных родителей, нектарных и безнектарных. Эта таблица адаптирована из¹³. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Дополнительный рисунок 1: Цифровая установка микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Разное количество наблюдаемых нектариев прицветников. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Discussion

Нектары — это специализированные железистые трихомы, которые производят нектар в растениях для успешного перекрёстного опыления. В растениях присутствуют как вегетативные, так и репродуктивные нектарии. Род Gossypium (хлопок) насчитывает более 50 видов, большинство из которых содержат листовые^{нектары 16}. Однако этот признак хлопка привлекает вредителей, что приводит к дополнительным потерям^{урожайности 17}. Селекционеры отобрали естественно существующие черты без нектариев (отсутствие нектариев), впервые обнаруженные у G. tomentosum , чтобы решить эту проблему. По этой причине они внедрили этот безнектарный черт в культивируемый горный^{хлопок 17}. В конечном итоге несколько популяций были сформированы путём отбора нектарных и безнектарных линий в качестве родителей. Поскольку гомозиготные безнектарные и гетерозиготные безнектаринные популяции не показывают различий при наблюдении невооружённым глазом, необходим специальный инструмент для их различия. Таким образом, этот метод оценки с помощью цифровой микроскопии, в отличие от традиционного оценивания (как показано на рисунке 7), не только визуализирует восстановление нектаров, но и предотвращает неточную оценку гетерозиготных растений без нектариев как гомозиготных растений без нектариев.

Фенотипическая оценка с использованием цифровых изображений зависит от нескольких ключевых факторов, таких как конкретный момент сбора образца, выбор образца, использование стандартной шкалы оценки нектариев листьев и прицветников, возможный генотип и то, как данные оценки могут быть интерпретированы для последующих приложений. Во-первых, важно собирать листья и цветы в вегетационный период, когда секреция нектара наиболее высокий, обычно на средней стадии цветения в июле. Во-вторых, выбор листьев или цветов подходящего размера и стадии играет решающую роль в оценке фенотипа. Для листьев предпочитали верхние ветви с листолистками длиной 5–7 см для нанесения зубцов. Аналогично, для набора нектариев на прицветниках выбирались здоровые цветы с верхних ветвей. Выборка выборки на определённых стадиях развития поможет, даже при сравнении всех растений в популяции, исключая проявления признаков, зависящих от стадии развития (как показано на рисунке 8). Для проверки повторяемости оценки были созданы цифровые изображения как минимум для двух образцов на ткань на растение. Сбор нескольких реплик одного и того же растения способствует стабильному сбору данных.

Возможное ограничение метода — поддержание растений без вредителей до сбора образцов. Зоны заражения вредителями можно определить по участкам тканей или яиц, отложенных в тканях, или повреждениям нектарных зон с чёрными участками, где нет видимого нектара из-за их употребления тлей или другими насекомыми. Это было зафиксировано во время скрининга сотен образцов. В таких случаях снова собирали здоровые листья и цветы и анализировали для получения согласованных данных из этих образцов. Это можно решить, поддерживая регулярный график борьбы с вредителями и добавляя удобрения для получения здоровых растений. Выполнение всех описанных ключевых шагов поможет в устранении неполадок при оценке фенотипов.

Эта техника имеет несколько применений, например, картирование для выявления ДНК-маркеров, которые помогают заводчикам определять генотипы для отбора с помощью маркеров. Оценка фенотипа требует подтверждения с помощью ДНК-маркеров из-за влияния окружающей среды и стадии развития, а также генов, контролирующих этот признак. Таким образом, фенотипизация этого признака с помощью цифровой микроскопии станет отправной точкой для сузения большого количества растений из нескольких популяций до небольшого числа предполагаемых безнектарных линий. С помощью ДНК-маркеров эти линии дополнительно валидируются для применения в селекционных программах по развитию устойчивости к болезни, опосредованным без нектарных признаков, у недавно выведенных сортов. Этот метод также помогает исследователям понять роль нектарного признака в растениях и полезные взаимодействия насекомых.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Цифровой микроскоп	Keyence VHX	VHX 600	Можно использовать и другие микроскопы
Разделочная доска Farberware	Farberware	Модель No 78892-10	14''L x 11''W x 0,5''Th, можно использовать любую марку, этот продаётся по amazon.com
Маленький кулер Igloos Laguna на 9 QT	Иглу	Номер части 00043567	Можно использовать любой бренд или любой размер в зависимости от потребностей проекта
Пластиковые пакеты (400 штук), 3 x 4 дюйма	Бренд Aubeco	NA	4''L x 3''W x 0.01'H, можно использовать любую марку, предпочтительные пластиковые прозрачные цвета
Single  Лезвия Edge Razor Blades, упаковка 100 штук	Weupe	NA	Можно использовать любую марку, этот продаётся в amazon.com