Методическая статья

Биологическая стандартизация биофабрикации на основе человеческих ASC для воспроизводимых макромасштабных тканевых конструкций

DOI:

10.3791/69839

⸱

5 июня 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Eukaryotic Cell Biology (Labio), National Institute of Metrology, Quality and Technology (INMETRO), 2Post-graduation Program of Translational Biomedicine (Biotrans), UNIGRANRIO, 3Post-graduation Program in Biotechnology, National Institute of Metrology, Quality and Technology (INMETRO), 4Post-graduation Program in Science and Technology of Polymers, Laboratory of Catalysis for Polymerization, Recycling and Biodegradable Polymers (LCPRB), Institute of Macromolecules, Federal University of Rio de Janeiro, 5Post-graduation Program in Metrology and Technology, National Institute of Metrology, Quality and Technology (INMETRO), 6Campus of Duque de Caxias, Federal University of Rio de Janeiro

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании представлен воспроизводимый рабочий процесс биофабрикации с использованием сфероидов стволовых клеток, полученных из жира, и 3D-печатных каркасов GelMA. Он демонстрирует пространственный контроль, способность слияния и метрики контроля качества, что приводит к созданию трансплантируемых макротканевых конструкций с потенциальным применением в регенеративной медицине.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Отсутствие стандартизированных протоколов в лабораториях создаёт значительное препятствие для сопоставимости экспериментальных результатов и эффективного переноса технологий биопроизводства. Строгая биологическая стандартизация не только повышает воспроизводимость, но и способствует соответствию национальным и международным нормативным рамкам, которые необходимы для клинической трансляции стратегий тканевой инженерии. Это исследование вводит стандартизированный рабочий процесс биопроизводства, включающий монослойную культуру hADSC, формирование сфероидов, 3D-печать каркасов с желатиновым метакрилоилом (GelMA) и биосборку сфероидов. Метрики контроля качества были интегрированы для обеспечения воспроизводимости. 3D-печатный строительный корпус GelMA был спроектирован с двумя центральными порами, каждая из которых могла вместить сотни сфероидов. Точность печати подтверждалась сравниванием размеров строительных лесов с моделью CAD, с незначительными отклонениями. hADSC формировали однородные сфероиды в течение 24 часов в агарозных микроплесенях. При засеянии в поры каркасов сфероиды подвергались непрерывному слиянию в течение 72 часов, формируя макромасштабные конструкции, подтверждённые конфокальными изображениями. Конструкция строительных лесов и точность печати обеспечивали структурную поддержку, а однородность сфероидов обеспечивала предсказуемое формирование конструкции. Слияние сфероидов в порах каркасов дало тканевые конструкции, подходящие для трансплантации, с каркасом или без, что подчёркивает универсальность такого подхода к биосборке. Результаты подчёркивают ключевую роль биологической стандартизации в продвижении воспроизводимых методологий биофабрикации конструктов живых тканей, что имеет многообещающие последствия для будущих клинических применений в регенеративной медицине.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Биосборка и биопечать — это взаимодополняющие подходы к биофабрикации в тканевой инженерии, которые сосредоточены на создании сложных тканей и органов на макроуровне с использованием автоматизированных технологий 1,2,3,4.

Сфероиды были включены в биофабрикацию как строительные блоки, главным образом для подходов кбиосборке 5. Сфероиды считаются микротканями, которые воспроизводят взаимодействия между клетками и окружающей тканевой микросредой in vivo. Среди источников клеток, используемых для формирования сфероидов, выделяются стволовые клетки, полученные из жира (ADSC), своей простотой изоляции, долгосрочным поддержанием культуры и потенциалом дифференцировки 6,7,8.

Благодаря своей природной способности к образованию крупных агрегатов, сфероиды могут создавать более сложные тканевые конструкции при использовании методов биосборки. Эта организация, управляемая слиянием, повышает регенеративный и дифференциационный потенциал сфероидов стволовыхклеток 9,10.

Биосборка сфероидов может поддерживаться или даже управлятьсябиоматериалами 11, что делает эту стратегию подходящей для масштабируемой и автоматизированнойбиофабрикации 12,13.

Существующие стратегии биопроизводства можно широко классифицировать на методы сборки сфероидов без каркасов и системы биопечати сгидрогелем 2,5,14. Методы без каркасов опираются исключительно на спонтанное клеточное самособирание и межсфероидное слияние, используя внутренние взаимодействия между клетками. Однако, поскольку они происходят без внешнего архитектурного руководства или геометрической изоляции, эти подходы демонстрируют сниженный пространственный контроль и меньшую структурнуюпредсказуемость 5,15. В отличие от этого, подходы к инкапсуляции на основе гидрогеля встраивают клетки в объёмные матрицы для обеспечения структурной поддержки и заранее определённойархитектуры 16,17, что может частично ограничивать прямой контакт клетки на ранних стадиях слияния и влиять на динамику миграцииклеток 18. В этой системе печатные биоматериалы, такие как желатин, метакрилоил (GelMA), содержат мотивы клеточной адгезии и могут служить каркасами для облегчения биосборкисфероидов 19. Предполагается, что 3D-печатный каркас GelMA обеспечивает геометрическое удержание и пространственное наведение сфероидов, способствуя контролируемому формированию тканей через слияние в более крупные, структурно определённые конструкции. Этот подход направлен на улучшение пространственного контроля и воспроизводимости структуры при биосборке сфероидов путём сочетания организации с управляемым каркасом и слиянием сфероидов в рамках определённой архитектуры гидрогеля. Однако текущий рабочий процесс сосредоточен на стандартизации процессов и параметрах структурной биофабрикации и не затрагивает долгосрочное созревание тканей, функциональную дифференцировку или крупномасштабное автоматизированное производство.

Биологическая стандартизация необходима не только для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости, но и для сохранения функциональной целостности биофабрикированныхтканей 19,20. Следовательно, точный контроль инженерных, геометрических и структурных параметров имеет решающее значение, поскольку эти факторы напрямую влияют на биологические характеристики, включая функцию тканей исозревание 5,21. Представлен стандартизированный и воспроизводимый рабочий процесс биопроизводства, включающий следующие ключевые шаги: (1) культура монослоя ASC; (2) формирование сфероидов ASC; (3) 3D-печать строительных лесов GelMA; и (4) биосборка сфероидов (рисунок 1). В рамках этого рабочего процесса были установлены объективные метрики контроля качества, включая однородность и сферичность сфероидов, точность печати и целостность формы каркасов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка агарозных микроформ и изготовление 3D-печатных каркасов GelMA

  1. Производство 2% агарозной микроформы в растворе 0,9% хлорида натрия (NaCl) (см. рисунок 2A)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все химические отходы должны быть обработаны и утилизированы в соответствии с институциональными нормами химической безопасности и рекомендациями по опасным отходам.
    1. Приготовьте раствор NaCl с содержанием 0,9% в сверхчистой воде и автоклав на 30 минут при 121 °C. Сохраняйте в стерильных условиях до использования.
    2. Разведите 1 г стерильной ультрачистой агарозы в 50 мл раствора 0,9% NaCl. Гомогенизировать и деполимеризировать агарозу в микроволновке с интервалом в 10 секунд в течение 3–5 циклов, пока она полностью растворится.
    3. В биологическом защитном шкафу разместите коммерчески доступную силиконовую форму с 81 круглым углублением на стерильную марлю.
    4. Аккуратно нанесите 600 мкл агарозы в центр силиконовой формы и дайте ей отдохнуть 40 минут для полной полимеризации.
    5. Аккуратно изолируйте полностью полимеризированную агарозную микроформу и перенесите её в колодец с 12-луночной микротитровой пластиной.
    6. Отрегулируйте положение агарозной микроформы и закрепите её на дне колодца, заполнив 600 мкл агарозы.
    7. Предварительно инкубировать микроплесень, инкубировав с помощью Dulbecco Modified Eagle Medium Low Glucose (DMEM, 2 мл/скважина) в течение 15 минут. Повторите эту процедуру дважды, а в третьей инкубации замените на трёхмерную (3D) культурную среду, состоящую из DMEM с добавлением аскорбиновой кислоты (50 мкг/мл), человеческого сывороточного альбумина (1,25 мкг/мл), пенициллин-стрептомицина (PS, 1×, из 100× стандартного раствора) и добавки ITS (1×, из 100× стандартного раствора).
      ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-среда для культурирования отличается от монослойной среды расширения отсутствием сыворотки плода (FBS) и наличием определённых добавок, способствующих взаимодействию между клетками и поддержке внеклеточного матрикса, способствуя правильной самосборке и стабилизации сфероидов. Если образование плесени и клеточное покрытие проводятся в разные дни, процедура может быть приостановлена после второй инкубации DMEM, а формы следует хранить в стерильных условиях в увлажнённом инкубаторе при 37 °C до 5 дней. Третья инкубация с использованием 3D-среды для культуры должна проводиться только в день нанесения. Перед засевом ячеек полностью удалите среду как из колодца, так и из микроплесени.
  2. Подготовка гидрогеля желатин-метакрилоила (GelMA)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура должна проводиться в темноте, так как реагенты фоточувствительны. В этом исследовании использовались GelMA (гель-сила 300 г Блум, степень замещения 60%) и фотоинициатор лития фенил-2,4,6-триметилбензоилфосфинат (LAP). Для приготовления 10 мл раствора GelMA с 10% w/v с содержанием 0,5% с LAP:
    1. Растворите 50 мг порошка LAP в 1 мл DMEM, аккуратно смешивая пипеткой до получения прозрачного, однородного раствора.
    2. Переведите раствор LAP в центрифугную трубку с 9 мл DMEM и тщательно перемешайте.
    3. В биологическом защитном шкафу стерилизуйте полученный раствор фильтром через фильтр 0,22 мкм.
    4. Добавьте 1 г GelMA в раствор и гомогенизуйте с помощью магнитного перемешивания при 50 °C примерно в течение 3 часов, пока не получится прозрачный и однородный раствор. Поднимите флягу к свету, чтобы убедиться, что раствор свободен от видимых частиц и мутности.
    5. Погрузите полученный гидрогель в шприц объёмом 10 мл для последующего печати или, если не используете сразу, храните при температуре 2–8 °C, защищённый от света, до использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы GelMA и LAP использовались примерно через 24 часа после подготовки. Длительное хранение этого раствора не рекомендуется. Порошки GelMA и LAP следует хранить при 2–8 °C согласно инструкции производителя. Фотоинициатор LAP классифицируется как неопасный согласно стандартам, таким как ABNT NBR 14725 и Регламенту (EC) No 1272/2008. Однако производитель рекомендует использовать средства индивидуальной защиты для предотвращения раздражения дыхательных органов, кожи и глаз. Рекомендуется использование защитных очков, протестированных и одобренных в соответствии с соответствующими государственными стандартами, такими как NIOSH (Национальный институт охраны труда и здоровья — США) или EN 166 (ЕС), а также перчаток из нитриловой резины с минимальной толщиной 0,11 мм. Дыхательная защита необходима только при образовании пыли. Рекомендации производителя по защите дыхания с помощью фильтра основаны на таких стандартах, как DIN EN 143, DIN EN 14387 и других дополнительных стандартах, связанных с используемой системой дыхательной защиты. Производитель рекомендует использовать фильтр типа P1.
  3. Проектирование 3D-моделей, слайсинг и генерация файла G-code
    ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-модель строительных лесов была разработана с использованием онлайн-3D автоматизированного проектирования (CAD) Tinkercad. Для этого протокола был создан цилиндрический каркас диаметром 15 мм, толщиной дна 1 мм и двумя круглыми порами диаметром 5,50 мм и глубиной 2 мм.
    1. После завершения дизайна 3D-модели экспортируйте его в файл *.stl (Дополнительный файл 1).
    2. Откройте программное обеспечение Repetier-Host версии 2.3.2, которое будет использоваться для среза задуманной модели.
    3. Во вкладке «Слайсер» выберите желаемый вариант слайсера. В этом исследовании использовался CuraEngine .
    4. Настройте соответствующий профиль параметров. В этой работе скорость 10 мм/с; Высота слоя 0,2 мм; Узор заполнения: сетка; Диаметр сопла — 0,41 мм.
    5. Загрузите файл *.stl 3D-модели для печати.
    6. Во вкладке «Слайсер» выберите ранее созданную конфигурацию.
    7. Нажмите на «Slice with CuraEngine». Срезанная 3D-модель затем визуализируется в программном интерфейсе.
    8. Нажмите «Сохранить в файл», чтобы сохранить файл G-code в нужном месте.
  4. 3D-печать гидрогелевых каркасов с желатиновым метакрилоилом (GelMA) для биосборки сфероидов
    ПРИМЕЧАНИЕ: 3D-печать должна выполняться в стерильных условиях. Поэтому перед началом печати проверьте, что биологический защитный шкаф, в котором находится принтер, включён и работает ли воздушный поток правильно. Убедитесь, что высота защитного стекла шкафа соответствует высоте маркировки датчика оборудования.
    1. Снимите предохранительные замки с биопринтера.
    2. Снимите стеклянную пластину с печатного стола, освободив металлические зажимы.
    3. Прикрепите акриловую направляющую подходящей формы для закрепления культивной пластины на печатной платформе, используя металлические зажимы.
    4. Подключите принтер к источнику питания. Обратите внимание, что это оборудование поддерживает двойное напряжение (110/220 В).
    5. Подключите USB-кабель принтера к компьютеру.
    6. Нажмите кнопку включения/выключения , чтобы включить принтер.
    7. Откройте программное обеспечение Repetier-Host V2.3.2, которое будет использоваться для просмотра 3D-модели и печати.
    8. Нажмите опцию «Подключить» в программном интерфейсе.
    9. Используя программное ручное управление, выберите экструдер (1 или 2) и отправьте печатающую головку в домашнюю позицию (X = 0, Y = 0, Z = 0).
    10. Отрегулировать выбранный экструдер для правильной посадки шприца с помощью соответствующего инструмента ручного управления в Репетье.
    11. Аккуратно вставьте шприц в экструдер, уже загруженный гидрогелем и прикреплённый к экструзионному соплу (в этом исследовании мы использовали коническую полипропиленовую сопло внутреннего диаметра 0,41 мм).
    12. Поставьте культивационную пластину в акриловую направляющую, прикреплённую к печатному столу.
    13. Отрегулируйте домашнее положение Z (Z = 0) с помощью винта Z на левой стороне биопринтера. То есть установить желаемое расстояние между соплом экструзии и печатающей поверхностью. В идеале сопло должно слегка касаться субстрата, который в данном исследовании был культивационной пластиной.
    14. Верните печатающую головку в основное положение.
    15. Загрузите ранее сгенерированный файл G-кода.
    16. Используя соответствующий инструмент ручного управления в программном обеспечении, экструдируйте часть гидрогеля из шприца, чтобы обеспечить проход материала через сопло.
    17. Начинайте процесс печати.
    18. После печати выполните фотосшивку полученных каркасов с помощью системы ультрафиолетового освещения 3D-биопринтера, оснащённой двумя светодиодами с частотой 395–400 нм. Подвергните строительные леса ультрафиолетовому излучению на 5 минут (интенсивность света 20 мВт/см²).
    19. Используйте тот же деполимеризированный 2% агарозный раствор, что и для изготовления микроформ, чтобы крепить 3D-печатные каркасы к колодцам 12-луночной культивной пластины. Закрепление каркасов на дне колодцев необходимо для обеспечения большей устойчивости и предотвращения смещения во время посева сфероидов и в течение всего периода посева.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении шага 4.16 проверьте, образует ли гидрогель непрерывную филамент во время экструзии. Обычно желатиновый раствор загружают в шприц в жидком состоянии (примерно 37 °C). В течение нескольких минут при комнатной температуре (22–25 °C) этот биоматериал начинает приобретать гелеобразную консистенцию. Материал не должен капать во время экструзии, так как это негативно скажется на качестве печати. Непрерывное образование филамента во время экструзии указывает на то, что гидрогель достиг оптимальной консистенции для печати. Растворы GelMA и LAP, разбавленные в DMEM, имеют слегка оранжевый оттенок. После фотосшивания, вызванного ультрафиолетом, обычно наблюдается смена цвета, при этом материал становится беловатым или полупрозрачным, как показано на рисунке 3D,E. При работе с УФ-системой обязательны защитные очки для обеспечения достаточной защиты глаз от ультрафиолетового излучения.
  5. Анализ точности печати
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ точности 3D-печати каркасов GelMA учитывает следующие параметры: диаметр каркасов, диаметр пор и толщина каркасов. Для проведения измерений использовалось программное обеспечение ImageJ версии 1.54.
    1. Во-первых, сделайте снимки строительных лесов под стереомикроскопом. Используйте линейку или суппорт в качестве ориентира.
    2. Перед анализом изображений откалибруйте и установите шкалу в ImageJ для проведения измерений.
    3. Используйте инструмент для прохождения измерений.
    4. Поскольку форма каркасов и пор круглые, для статистического анализа используйте среднее арифметическое значение диаметров каркасов и пор.
    5. Для анализа точности печати сравните измерения, полученные ImageJ с напечатанных каркасов, со значениями, определёнными в 3D-модели, сгенерированной Tinkercad.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Измеренная толщина печатных строительных лесов сравнивается с суммой значений глубины пор и толщины дна, проецируемых в Tinkercad.
    6. Проведите статистический анализ полученных данных. В этом случае для сравнения измеренных значений каркасов с ожидаемыми значениями можно использовать тест Манна-Уитни U (непараметрический). Для оценки нормальности используется тест Шапиро-Уилка. Различия считаются статистически значимыми, если p < 0,05.

2. Подготовка hADSC и формирование сфероидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерчески доступные мезенхимальные стволовые клетки, полученные на основе жирового жира человека (hADSC), были культивированы в клеточно-специфической среде и проходили при слиянии 80–90% согласно рекомендациям производителя. Ячейки использовались до 7-го блока для этого протокола. Все биологические отходы должны быть должным образом деконтаминированы или стерилизованы перед утилизацией и обрабатываться в соответствии с институциональными рекомендациями по биобезопасности. Для последующего конфокального визуализации монослой следует маркировать флуоресцентным красителем перед формированием сфероидов и инкубировать по рекомендациям производителя. Формирование сфероидов может начаться через 30 минут после маркировки.

  1. Трипсинизация монослоя ASC
    1. В биологическом защитном шкафу откройте колбу и переместите её содержимое в контейнер для отходов.
    2. Промыйте монослой дважды 1× фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) и сбросьте раствор.
    3. Добавьте 0,125% раствора трипсина/EDTA, достаточного для покрытия монослоя. Закройте колбу и инкубуйте в увлажнённом инкубаторе при 37 °C до 5 минут.
    4. Инактивируйте трипсин/ЭДТА, добавив равный объём DMEM с 10% плодовой бычьей сывороткой (FBS).
    5. Собирайте суспензию клетки с помощью серологической пипетки или переносите в центрифугные трубки. Центрифуга при температуре 400 x г в течение 5 минут при комнатной температуре (20–25 °C).
    6. Аккуратно отбросьте супернатант.
    7. Суспензировать клеточную гранулу в DMEM и униформировать его. Пройдите аликвот для подсчёта клеток и оценки жизнеспособности.
  2. Сфероидная культура (см. рисунок 2B)
    1. Разделите соответствующее количество ячеек для каждой формы в центрифугную трубку объемом 15 мл. Для hADSC каждая агарозная форма с 81 углублением должна получать 1 × 106 клеток — в каждой микроколодке образуется один сфероид, давая 81 сфероид на микроформу.
    2. Добавьте 1× PBS и центрифугуйте при 500 г на 5 минут при комнатной температуре. Отбросьте супернатант и добавьте 1× PBS. Повторите этот шаг дважды.
    3. После третьей центрифугации аккуратно сбросьте супернатант и высушите отверстие трубки стерильной марлей, прежде чем вернуть его в вертикальное положение.
    4. Суспензировать клеточную гранулу в 120 мкл 3D-культурной среды для сфероидной культуры и гомогенизации. При необходимости отрегулировать объём подвески на 200 мкл с дополнительным 3D-культурным материалом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая форма с 81 резекцией имеет ёмкость 200 мкл.
    5. Аспирируйте 200 мкл и аккуратно закройте его в центре формы, избегая образования пузырей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап можно автоматизировать с помощью роботизированной системы пипетирования, как описановыше 22.
    6. Оставьте пластину в биологическом защитном шкафу на 5 минут, чтобы клетки могли осесть в резекции.
    7. Поставьте тарелку в увлажнённый инкубатор на 40 минут.
    8. После этого периода аккуратно добавьте 2 мл 3D Medium в каждую колодцу. Верните пластину в увлажнённый инкубатор при температуре 37 °C.
  3. Измерение сфероидов и статистический анализ
    1. Сделайте снимки сфероидов, расположенных вдоль двух диагоналей агарозной микроформы, образуя узор «X», используя инвертированный оптический микроскоп с цифровой камерой и объективом диаметром 10×. Используйте шкалу масштаба 100 мкм для калибровки масштаба изображения перед измерением диаметров.
    2. Чтобы определить большой и малый диаметры сфероидов, используйте инструмент «линейный» инструмент программы и выполните два перпендикулярных измерения для каждого сфотографированного сфероида с приблизительным углом 90° между ними.
    3. Вычислим средний диаметр каждого сфероида как арифметическое среднее двух ранее измеренных перпендикулярных диаметров. Вычислите сферичность как отношение от наибольшего к наименьшему диаметру каждого сфероида, при этом значения ближе к 1 указывают на большую однородность и более сферическую форму.
    4. Провести статистический анализ с использованием полученных значений диаметра и сферичности.

3. Засев сфероидов на каркасах GelMA для слияния и биосборки сфероидов

  1. После 24 часов формирования сфероидов собирайте их из агарозных микроформ с помощью пипетки с широкими наконечниками и переносите их в микротрубки объемом 2 мл.
  2. Когда сфероиды оседают на дне микротрубок, сбросьте супернатант.
  3. Суспензировать сфероиды в 50 мкл 3D-среды.
  4. Используя пипетку с широкими наконечниками, соберите сфероиды и аккуратно вставьте их в поры строительных лесов GelMA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В опорной поре GelMA диаметром около 5,50 мм и глубиной 2 мм дают примерно 480–640 сфероидов (соответствующих 6–8 агарозным микроформам, каждая из которых генерирует 81 сфероид диаметром от 200 до 400 мкм) в 50 мкл. Эта оценка была основана на объёме пор и среднем диаметре сфероида, при этом количественная оценка проводилась по количеству полных перенесённых микроформ, а не по индивидуальному подсчёту сфероидов, что обеспечивало практичную и воспроизводимую оценку плотности сфероидов внутри поры.
  5. После внесения сфероидов в опорный пор GelMA подождите 20–40 минут, чтобы сфероиды осели. Добавьте 1 мл 3D-среды в каждую яму.
  6. Через 24 часа добавьте 1 мл 3D-среды в каждую скважину.
  7. Мониторинг слияния сфероидов в порах каркасов GelMA с помощью фазово-контрастной микроскопии и стереомикроскопии. Получайте изображения каждые 24 часа — с 0-го дня (сразу после посева) до 3-го дня (72 часа).
  8. Зафиксировать биологическую конструкцию в 4% параформальдегиде через 72 часа для визуализации с помощью конфокальной микроскопии. Обращайтесь с параформальдегидом в сертифицированной вытяжной вытяжке с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты (лабораторный халат, перчатки и защита глаз) из-за его токсичных и раздражающих свойств, а также утилизировать отходы в соответствии с институциональными рекомендациями по химической безопасности. Для конфокального наблюдения клетки должны быть предварительно маркированы в монослое флуоресцентным красителем перед формированием сфероидов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если для анализа или применения in vivo требуется удаление конструкции из поры GelMA, аккуратно поднимите её с помощью прецизионного пинцета или биопсийного пунша соответствующего размера.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стволовые клетки человеческого жирового происхождения (hASC), культивируемые в монослое (рисунок 2C), были успешно индуцированы к образованию сфероидов в течение 24 часов после засея в агарозные микроформы (рисунок 2D). Полученные сфероиды продемонстрировали компактную и чётко очерченную морфологию. Морфометрический анализ показал средний диаметр 239,8 мкм ± 87,0 мкм за 24 часа (рисунок 2E) и значен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Результаты этого исследования подчёркивают успешную интеграцию метрик контроля качества в стандартизированный рабочий процесс биопроизводства для обеспечения воспроизводимости. Использование 3D-печатных каркасов на основе заранее установленных конструкций обеспечивает структурную поддержку для биосборкисфероидов 19,23. В качестве доказательства концепции был спроектирован сплошной каркас с двумя центральными пористыми участками, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не сообщают о конфликтах интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BioRender.com (https://BioRender.com/x1lxn0y) для иллюстраций на рисунках.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)Prepared in the laboratory-
593iCAN 3D Bioprinter, Model 593 iCan2X Printhead593iCAN--
AgaroseSigma-Aldrich16500-500-
Ascorbic Acid Sigma-Aldrich A4544-100MG-
Carl Zeiss Microscopy GmbH Primovert Zeiss-415510-1101-000
Celldiscover Zeiss-LSM 900 with Airyscan 2
CelltrackerInvitrogen C7025-
CentrifugeEppendorf -5702
Class II Biological Safety CabinetStreamline-Model SC2-4E3
CO2 incubator for cell cultureThermo Fisher Scientific-Series 8000 WJ 
Conical polypropylene nozzle 0.41 mm593iCAN--
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Low Glucose Sigma-Aldrich D2902-10L-
EDTASigma-Aldrich E9884-
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco 12657-029-
Gelatin methacryloyl gel strength 300 g Bloom, degree of substitution 60%Sigma-Aldrich900622Lot/Batch number: MKCS2673. Documentation for each batch, including the Safety Data Sheet (SDS) and the Certificate of Analysis (CoA), can be obtained from the manufacturer’s website.
GraphPad Prism 6.0 softwareGraphPad Inc--
Hot plate magnetic stirrerIKAZ671797Model C-MAG HS7
Human serum albumin 100 mg/mlFUJIFILM Irvine Scientific9988-
ITS (Insulin-transferrin-sodium selenite) supplement 100x Sigma-AldrichI3146-5ML-
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)Sigma-Aldrich900889
Luxoeo 4Z Stereozoom Microscope Labomed--
MicroTissues® 3D Petri Dish® micro-mold spheroidsSigma-AldrichZ764019-
Penicillin-streptomycin 100xSigma-Aldrich15140122-
Poietics™ human adipose derived stem cells (ADSC)Lonza PT-5006
Sodium Chloride (NaCl)Sigma-Aldrich71382-500G-
Trypsin/EDTAGibco 27250018-

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Spagnuolo, F. D., Kronemberger, G. S., Storey, K. J., Kelly, D. J. The maturation state and density of human cartilage microtissues influence their fusion and development into scaled-up grafts. Acta Biomater. 194, 109-121 (2025).
  2. Baptista, L. S., et al. Bioprinting using organ building blocks spheroids organoids and assembloids. Tissue Eng Part A. 30 (13–14), 377-386 (2024).
  3. Shojaei Barjuei, E., et al. Precision improvement of robotic bioprinting via vision-based tool path compensation. Sci Rep. 14 (1), 17764 (2024).
  4. Li, H., Zhou, H., Xu, C., Wei, Y., Tang, X. 3D bioprinting and scaffold-free strategies for fabrication of multicellular tissues or organoids. Int J Bioprinting. 9 (1), 135 (2023).
  5. Mironov, V. R., et al. Organ printing tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30 (11), 2164-2174 (2009).
  6. Côrtes, I., et al. Mimicking lipolytic adipogenic and secretory capacities of human subcutaneous adipose tissue using spheroids. Front Cell Dev Biol. 11, 1219218 (2023).
  7. Shi, Y., et al. Advances in culture of adipose-derived stromal stem cells. Front Endocrinol (Lausanne). 15, 1343255 (2024).
  8. Suchanecka, M., et al. Adipose-derived stem cells in regenerative medicine. Biomed Pharmacother. 186, 118036 (2025).
  9. Kim, E. M., et al. Fabrication of core shell spheroids for engineering vascularized tissues. Acta Biomater. 100, 158-172 (2019).
  10. Kronemberger, G. S., et al. Hypertrophic cartilage induction influences building block capacity of ASC spheroids. Artif Organs. 45 (11), 1208-1218 (2021).
  11. Caprio, N. D., Burdick, J. A. Engineered biomaterials guiding spheroid formation and function. Acta Biomater. 165, 4-18 (2023).
  12. Kopinski-Grünwald, O., et al. Scaffolded spheroids for cartilage tissue engineering. Acta Biomater. 174, 163-176 (2024).
  13. Mekhileri, N. V., et al. Automated 3D bioassembly of microtissues. Biofabrication. 10 (2), 024103 (2018).
  14. Groll, J., et al. Biofabrication reappraising the definition. Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).
  15. Jakab, K., et al. Tissue engineering by self-assembly of cells. Tissue Eng Part A. 14 (3), 413-421 (2008).
  16. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotechnol. 32 (8), 773-785 (2014).
  17. Ozbolat, I. T., Hospodiuk, M. Advances in extrusion-based bioprinting. Biomaterials. 76, 321-343 (2016).
  18. Zhuang, P., Chiang, Y. H., Fernanda, M. S., He, M. Spheroids as building blocks in tumor microenvironment models. Int J Bioprinting. 7 (3), 444 (2021).
  19. Levato, R., et al. From shape to function in bioprinting. Adv Mater. 32 (12), 1906423 (2020).
  20. Moroni, L., et al. Biofabrication terminology and technology. Trends Biotechnol. 36 (4), 384-402 (2018).
  21. Sun, W., et al. The 2022 biofabrication roadmap. Biofabrication. 15 (1), 012001 (2023).
  22. Kronemberger, G. S., et al. Automated production of ASC spheroids for bioprinting. J Vis Exp. (181), e63430 (2022).
  23. Daly, A. C., Prendergast, M. E., Hughes, A. J., Burdick, J. A. Bioprinting for the biologist. Cell. 184 (1), 18-32 (2021).
  24. Arguchinskaya, N. V., et al. Properties and printability of GelMA hydrogels. Int J Mol Sci. 24 (3), 2121 (2023).
  25. Compaired, P. M., García-Gareta, E., Pérez, M. &. #. 1. 9. 3. ;. Workflow for bioprinting optimization. Int J Bioprinting. 11 (3), 397-415 (2025).
  26. Gaglio, C. G., et al. GelMA synthesis and comparison for bioprinting. Front Bioeng Biotechnol. 12, 1383010 (2024).
  27. Gillespie, G. J., et al. Influence of printing parameters and cell density on bioink outcomes. Tissue Eng Part A. 26 (23–24), 1349-1358 (2020).
  28. Maggiotto, F., et al. Perfusable vascularized cancer niche via 3D bioprinting. Front Bioeng Biotechnol. 13, 1484738 (2025).
  29. Shie, M. Y., et al. Effects of GelMA concentration on properties and fibroblast behavior. Polymers (Basel). 12 (9), 1930 (2020).
  30. Chimene, D., Lennox, K. K., Kaunas, R. R., Gaharwar, A. K. Advanced bioinks for 3D printing. Adv Mater. 32 (12), 1902026 (2020).
  31. Pepelanova, I., Kruppa, K., Scheper, T., Lavrentieva, A. GelMA hydrogels for tissue engineering. Polymers (Basel). 10 (11), 1134 (2018).
  32. Heinrich, M. A., et al. 3D bioprinting from bench to translation. Adv Mater. 31 (23), 1805510 (2019).
  33. Kronemberger, G. S., Chattahy, K., Spagnuolo, F. D., Karam, A. S., Kelly, D. J. Bioassembly of fibrocartilage microtissues for meniscal grafts. Adv Healthcare Mater. 14 (32), e02208 (2025).
  34. Matai, I., Kaur, G., Seyedsalehi, A., McClinton, A., Laurencin, C. T. Progress in 3D bioprinting for regenerative engineering. Biomaterials. 226, 119536 (2020).
  35. Decarli, M. C., et al. Bioprinting stem cell spheroids for cartilage engineering. Adv Healthcare Mater. 12 (7), 2203021 (2023).
  36. Zhang, Z., Liu, Y., Tao, X., Du, P., Enkhbat, M., et al. Engineering cell microenvironments with spheroids and hydrogels. Polymers (Basel). 15 (9), 1925 (2023).
  37. Zuliani, C. C., da Cunha, J. B., Correa, R. F., Pinto, J. u. n. i. o. r. . E. A., d’Ávila, M. A., et al. Injectable hydrogel for delivery of MSC spheroids in cartilage regeneration. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 53 (1), 453-467 (2025).
  38. Unagolla, J. M., Jayasuriya, A. C. Hydrogel-based 3D bioprinting review. Appl Mater Today. 17, 100479 (2019).
  39. Kim, M. H., Singh, Y. P., Celik, N., Yeo, M., Rizk, E., et al. High-throughput bioprinting of spheroids. Nat Commun. 15 (1), 10083 (2024).
  40. Daly, A. C., Davidson, M. D., Burdick, J. A. Spheroid fusion within self-healing hydrogels. Nat Commun. 12 (1), 753 (2021).
  41. Prabhakaran, V., Melchels, F. P. W., Murray, L. M., Paxton, J. Z. Engineering bone tissues via spheroid fusion. Front Endocrinol (Lausanne). 14, 1308604 (2023).
  42. Gabriella, , et al. Probing multicellular tissue fusion of cocultured spheroids. Adv Sci (Weinh). 8 (21), e2103320 (2021).
  43. Kim, S., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering multicellular spheroids. Adv Healthcare Mater. 9 (12), 2000608 (2020).
  44. Zhang, J., Yun, S., Du, Y., Zannettino, A., Zhang, H. Hydrogel-based preparation of cell aggregates. Appl Mater Today. 20, 100747 (2020).
  45. Khajehmohammadi, M., Azizi Tafti, R., Nikukar, H. Effect of porosity on bioprinted scaffolds. J Biomed Mater Res A. 111 (2), 245-260 (2023).
  46. Kim, M., et al. Enhanced nutrient transport in engineered cartilage constructs. Acta Biomater. 58, 1-11 (2017).
  47. Chariyev-Prinz, F., et al. MSC response to hydrostatic pressure in chondrogenesis supportive environments. J Biomech. 154, 111590 (2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GelMA3D

Похожие статьи