Методическая статья

Протокол для извлечения суспензии с одной клеточной суспензией роговицы мыши

DOI:

10.3791/69844

⸱

3 апреля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, 2School of Clinical Medicine, Guizhou Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол получения высококачественных одноклеточных суспензий из целых роговиц мышей посредством последовательного расщепления с помощью коллагеназы А и трипсина. Этот метод даёт жизнеспособные одиночные клетки с высокой целостностью РНК, что делает их совместимыми с последующим применением, такими как секвенирование одноклеточной РНК и потоковый цитометрy.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Будучи самым внешним слоем глазного яблока, роговица играет ключевую роль в поддержании гомеостаза глазной поверхности и зрения. Недавние достижения в секвенировании одноклеточной РНК (scRNA-seq) позволили проводить высокоразрешающий анализ гетерогенности клеток роговицы, однако подготовка высококачественных одноклеточных суспензий из ткани роговицы остаётся сложной из-за её плотной и сложной структуры. В этом исследовании мы разрабатываем надёжный протокол для получения суспензий из целых роговиц мышей. Процедура включает измельчение роговицы на мелкие фрагменты, затем последовательное ферментативное расщепление с использованием коллагеназы А и трипсина. Полученная суспензия клеток оценивалась на качество с помощью нескольких метрик: для оценки жизнеспособности и подсчета клеток использовалось окрашивание трипановым синим; иммунофлуоресцентное окрашивание для Панцитокератина и Кератокана позволило выявить и количественно определить основные типы клеток роговицы; а целостность РНК проверялась с помощью биоанализатора. Этот протокол стабильно даёт препараты для отдельных клеток с высоким количеством клеток, отличной жизнеспособностью (≥ 94,6%) и высокой долей отдельных клеток (96,3%), что соответствует требованиям, совместимым с требовательными последующим приложениями, включая scRNA-seq.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Роговица, расположенная в самом внешнем слое глазного яблока, необходима для своей барьерной и преломляющей функций благодаря высокоорганизованной архитектуре, состоящей из пяти отдельных слоёв: эпителия, слоя Боумана, стромы, мембраны Дескемета иэндотелия 1. Эпителий роговицы — это некератинизированная стратифицированная плоская структура, которая обеспечивает физический барьер от внешних патогенов и обладает устойчивыми антимикробными и регенеративными свойствами. Строма, состоящая из точно выровненных коллагенных фибрилл, сохраняет прозрачность роговицы и равномерный показательпреломления 2. Эндотелий, моноцеллюлярный слой, регулирует перенос жидкости между стромой и водной жидкостью, тем самым сохраняя гидратизацию роговицы и питательныевещества 3. Тем не менее, эта сложная структурная и клеточная сложность исторически ставила серьёзные вызовы для изучения биологических функций роговицы и лежащих в основемеханизмов 4.

Для изучения межклеточных взаимодействий и определения клеточно-специфических маркеров широко применяются методы, такие как сортировка потоковойцитометрии 5 и секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq)6 . Однако основным техническим препятствием, общим для обоих подходов, является подготовка высококачественных одноэлементных подвесок. Параметры, включая общий урожай клеток, долю отдельных клеток и жизнеспособность клетки, критически важны для надёжности последующих приложений, направленных на характеристику функции роговицы и экспрессии поверхностных маркеров7. Несмотря на свою важность, до сих пор не хватает стандартизированных и эффективных протоколов для генерации суспензий на основе целых роговиц мышей.

Разработано несколько методов получения суспензий в одноклеточной суспензии из ткани роговицы. Последовательное ферментативное расщепление с использованием коллагеназы A, трипсина или TrypLE применяется для выделения отдельных клеток как из рогавицы человека, так и умыши 8. Повторная трипсинизация также применялась для диссоциации роговицы⁷. Кроме того, коммерческие наборы для диссоциации нескольких тканей, такие как Miltenyi Biotec, успешно применялись для получения одноклеточных суспензийроговицы 9. В нашем предыдущем сравнительном исследовании различных методов пваривания роговицы мы показали, что последовательное лечение коллагеназой и трипсином является оптимальным подходом. Этот метод стабильно обеспечивает высокое количество клеток, отличную жизнеспособность (≥94,6%), высокий процент отдельных клеток (96,3%) и хорошо сохранённую целостностьРНК 10.

В этом протоколе мы предлагаем подробную, пошаговую процедуру получения высококачественных одноклеточных суспензий из целых роговиц мышей, используя оптимизированную ферментативную стратегию пищеварения, основанную на нашем опыте и предыдущих результатах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Самки мышей C57BL/6 (B6) возрастом 6-8 недель были предоставлены Центром экспериментальных животных Медицинского университета Гуйчжоу. Животных содержали в режиме 12 часов света и 12 часов темноты с доступом к еде и воде на свободу . Все процедуры были утверждены Комитетом по этике экспериментальных животных Медицинского университета Гуйчжоу (Одобрение No 2305185) и проведены в соответствии с Заявлением ARVO о применении животных в офтальмологических и зрительных исследованиях.

1. Подготовка

  1. Подготовка хирургических инструментов: очистите две пары офтальмологических ножниц, две пары офтальмологических щипцов, одну пару тканевых щипцов и одну центрифугную трубку объемом 2 мл, дважды промывая двойным дистиллированным водой (DDW). Стерилизуйте инструменты и трубку с помощью парового автоклава. Сушите все продукты на ночь в обычной духовке при 65 °C.
  2. Подготовка раствора
    1. Дополнительный гормональный эпителиальный средой (SHEM): Подготовьте SHEM с добавлением среды DMEM/F12 со следующими компонентами: 5% (v/v) сыворотки плода (FBS), 0,5% (v/v) диметилсульфоксид (DMSO), эпидермальный фактор роста мышей 10 нг/мл, трансферрин 5,5 мкг/мл, 0,5 мкг/мл гидрокортизона, 1% (v/v) пенициллин-стрептомицина (100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина).
      ПРИМЕЧАНИЕ: SHEM используется для поддержания жизнеспособности клетки во время обработки. Его можно заменить альтернативными средствами, такими как базальный DMEM или фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS), содержащий не менее 10% (v/v) FBS.
    2. Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS)
      1. Растворите 22,4 г порошка PBS в 2 литрах двойной дистиллированной воды (DDW) под перемешиванием с помощью магнитной мешатки, чтобы получить 1× PBS.
      2. Автоклавуйте PBS-решение за день до этого и дайте ему остыть.
      3. В стерильных условиях перенесите 47,5 мл стерильной 1× PBS в центрифугную трубку на 50 мл и добавьте 2,5 мл 1% (v/v) пенициллин-стрептомицина.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Формула 1× PBS (2 L) содержит 137 мМ NaCl, 8 мМ Na, 2HPO 4, и 2 мМ2PO4, pH 7,2.
    3. Растворы коллагеназы А
      1. Стандартный раствор: растворить 1 г порошка коллагеназы А в 40 мл DDW. Стерилизуйте фильтр через фильтр 0,2 мкм и храните при -20 °C.
      2. Рабочий раствор: разведите 1 мл стандартного раствора коллагеназы A в 4 мл стерильного DDW для получения конечной концентрации 5 мг/мл.
    4. Раствор трипсина: Разморозить коммерчески доступный в продаже 0,25% (с раствором трипсина/EDTA) (с содержанием 0,91 мМ EDTA) на льду перед использованием.
    5. Раствор Trypan Blue (0,4%): растворить 0,4 г Trypan Blue в 100 мл DDW. Фильтруйте с помощью фильтрующей бумаги и храните при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор Trypan Blue с 0,4% используется для оценки общего количества клеток, доли отдельных клеток и жизнеспособности. Его могут заменить коммерческими наборами для окрашивания живых/мертвых или автоматизированными системами подсчёта клеток.

2. Подготовка роговицы мышей

  1. Простерилизуйте микроскоп и рабочую зону, протирая 75% этанолом, затем подвергните область воздействию ультрафиолетового излучения внутри биологического защитного шкафа на 30 минут.
  2. В стерильных условиях приготовьте следующее: одну чашку Петри диаметром 60 мм с 5 мл среды SHEM, три чашки Петри по 60 мм каждая с 5 мл 1× PBS с добавлением 5% пенициллин-стрептомицина (P-S), три чашки Петри по 60 мм, каждая с 5 мл обычной 1× PBS, и одна стерильная трубка центрифугы объемом 2 мл
  3. Усыпить мышь с помощью асфиксииCO2 , затем вывиха шейки матки.
  4. Тщательно промывайте головку мыши и закрытые веки, трижды погружаясь в PBS с 5% P-S перед проведением энуклеации.
  5. С помощью офтальмологических ножниц сделайте разрез вдоль заднего полюса каждого глазного яблока и аккуратно поместите изолированные глаза в чашку Петри с ледяной средой SHEM (рисунок 1A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для максимизации жизнеспособности клетки все растворы должны быть предварительно охлаждены до 4 °C, а все этапы вскрытия должны выполняться на льду.
  6. Немедленно перенесите чашку Петри с глазами в биологический защитный шкаф. Промывайте глаза три раза за 1× PBS с 5% P-S, инкубировать по 5 минут за одно мытье.
  7. Под расщепляющим микроскопом аккуратно разделяйте ткани роговицы: с помощью офтальмологических ножниц и щипцов сделайте разрез от заднего полюса к лимбу роговицы. Аккуратно отдельте роговицу от склеры и конъюнктивы вдоль лимбальной границы. Полностью удалите линзу и радужку с помощью двух пар щипцов (рисунок 1B).
  8. Используя офтальмологические щипцы, перенесите ткань роговицы в чашку Петри с 1× PBS и промыйте три раза (по 5 минут каждый), чтобы удалить остатки нероговицы тканей и антибиотиков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: радужка часто плотно прилипает к роговице. Убедитесь, что её аккуратно и полностью удаляют щипцами, чтобы избежать загрязнения, оставив только прозрачную ткань роговицы.
  9. С помощью офтальмологических щипцов перенесите очищенную ткань роговицы в центрифугную трубку объемом 2 мл и добавьте 1 мл рабочего раствора коллагеназы А (5 мг/мл).
  10. С помощью офтальмологических ножниц измельчите ткань роговицы на фрагменты примерно 0,5 мм × 0,5 мм непосредственно внутри трубки.
  11. Инкубировать трубку с фрагментами роговицы и раствором коллагеназы A в инкубаторе клеточной культуры при 37 °C в течение 1 часа (рисунок 2A-C).
  12. Во время пищеварения коллагеназы А следите за состоянием тканей каждые 10 минут. Прекратить пищеварение, когда крупные фрагменты ткани не остаются, переходя к центрифугированию. Центрифугуйте образец при температуре 300 г в течение 5 минут при комнатной температуре с помощью центрифуга. Аккуратно аспирируйте супернатант.
  13. Суспензировать гранулу в 200 мкл раствора 0,25% трипсина/ЭДТА.
  14. Инкубировать трубку в инкубаторе для культуры клеток при 37 °C в течение 10 минут, чтобы переварить оставшиеся фрагменты ткани.

3. Выделение отдельных клеток роговицы

  1. Аккуратно тритурируйте смесь (ткань и раствор трипсина/ЭДТА) многократно используя пипетку P1000 с широким наконечником, чтобы расщепить ткань в одноклеточную суспензию.
  2. Центрифугуйте суспензию ячейки при 300 x g на 5 минут и сбросьте супернатант. Ресуспензировать клеточную гранулу в 1 мл PBS, содержащей 0,04% бычий сывороточный альбумин (BSA), чтобы получить суспензию из одной клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для клеток, предназначенных для секвенирования или потоковой цитометрии, реуспензия в безсывороточном PBS. Для клеток, которые будут культивироваться, используйте 1x PBS с добавлением 0,04% BSA.
  3. Фильтруйте суспензию ячейки через предварительно увлажнённое сито 40 мкм в новую трубку центрифугы на 50 мл для удаления комков и мусора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно увлажните ситечко с помощью PBS, чтобы минимизировать потерю клеток. При необходимости фильтрованные клетки могут быть вновь центрифугированы и вновь суспензированы в нужном объёме для концентрации.

4. Подсчёт клеток

  1. Смешайте 9 мкл суспензии ячейки с 1 мкл раствора 0,4% Trypan Blue и аккуратно перемешайте.
  2. Медленно загружайте смесь в камеру гемоцитометра через назначенный нагрузочный канал. Подсчитайте ячейки методом четырёх квадрантов для определения общего количества ячеек, жизнеспособности и доли отдельных ячеек. Выполните как минимум две технические реплики.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Качество суспензий из одной клетки оценивалось на основе общего выхода клеток, доли отдельных клеток и жизнеспособности клеток. Суспензия была окрашена Trypan Blue и проанализирована с помощью фазово-контрастной микроскопии по нескольким полям (см. рисунок 3). Из четырёх глаз мыши (восемь роговиц) было получено всего 1,05 × 105 клеток со средней жизнеспособностью клетки 94,6% и соотношением к одной клеточке более 96,3%. Эти результаты подтверждают...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внедрение секвенирования одноклеточных РНК значительно увеличило использование геномных, транскриптомных, эпигенетических и протеомных технологий в глазныхисследованиях 9,10,11,12. В результате подготовка высококачественных суспензий для отдельных клеток становится всё более важной, так как позволяет обнаруживать вариации сигнализации между отдельными клетками ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликтов интересов, которые нужно раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотят выразить благодарность и уважение всем животным, которые внесли вклад в их клетки в этом исследовании. Это исследование было частично поддержано Гуйчжоускими провинциальными научно-техническими проектами (QKHJC-ZK[2024]ZD043 [к S.O.]); Фуцзянский провинциальный научный фонд выдающихся молодых учёных (2023J06053 [S.O.]); Фонду естественных наук Китая (No82101084 [для S.O.]; Провинциальной фундаментальной исследовательской программы (естественные науки) Гуйчжоу (QKHJC-ZK[2025]MS-473) [для S.O.]; Фонд Медицинского исследовательского союза по высокому качественному развитию здравоохранения провинции Гуйчжоу (2024GZYKYJJKM0043) [для S.O.].

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Alexa Fluor 594 — ослиный антикроличий препаратAbcamAB150064
АнтикератинAbcamab230175
АнтипанцитокератинТермо Фишер СайентификAE1/AE3, Alexa FluorTM 488
Автоклавный стерилизаторАнь ШэньLDZH-100KBS
Бычий сывороточный альбумин VSolarbioA8020
Фильтр ячейкиNEST25836940 μ m
Центробежная машинаEppendorf AG22331 Гамбург
Коллагеназа AРош10103578001
Конфокальный микроскоп  ОберкохенZeiss LSM 880
Счётная пластинаМАРИЕНФЕЛЬДM407859
Центробежная трубкаNEST6206112 мл, 50 мл
ПерекрытиеМАРИЕНФЕЛЬДM407859
DAPISolarbioC0065
Дисецирующий микроскопКарл ЦЕЙССVISU150
DMEM/F12  СМИGibco11320033
DMSOSolarbioD8371
Плод   крупный рогатый рогатый скот; сывороткаGibco16140071
ГидрокортизонSolarbioIH0100
ЕГОGibco23337619
Эпидермальный фактор роста мышиИнвитрогенPMG8041
офтальмологическое хирургическое отделение и bbsp; щипцыДюмо0208-5-PO
Офтальмологические хирургические ножницыFST15021-15
ДуховкаAISITEDH6000 II
Пенициллин и СтрептомицинGibco15070063100 мл
Чашка ПетриNEST70520160 мм
Фосфатный буферный физиологический растворSolarbioP1010
Термостатический инкубаторТермо Фишер Сайентифик3111
Triton-X 100SolarbioT8200
Trypan Blue SolarbioT8070
Trypsin/EDTA GibcoR001100
Ультрачистящий столЮ ЦиVS-840-2
4% параформальдегидSolarbioP1110

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eghrari, A. O., Riazuddin, S. A., Gottsch, J. D. Overview of the cornea:structure, function, and development. Prog Mol Biol Transl Sci. 134, 7-23 (2015).
  2. Delmonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. J Cataract Refract Surg. 37 (3), 588-598 (2011).
  3. Zhang, X., et al. Dry eye management:targeting the ocular surface microenvironment. Int J Mol Sci. 18 (7), 1398(2017).
  4. Dou, S., et al. Molecular identity of human limbal heterogeneity involved in corneal homeostasis and privilege. Ocul Surf. 21, 206-220 (2021).
  5. Adan, A., et al. Flow cytometry:basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. 37 (2), 163-176 (2017).
  6. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).
  7. Altshuler, A., et al. Discrete limbal epithelial stem cell populations mediate corneal homeostasis and wound healing. Cell Stem Cell. 28 (7), 1248-1261.e8 (2021).
  8. Kaplan, N., et al. Single-cell RNA transcriptome helps define the limbal/corneal epithelial stem/early transit amplifying cells and how autophagy affects this population. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (10), 3570-3583 (2019).
  9. Collin, J., et al. A single cell atlas of human cornea that defines its development, limbal progenitor cells and their interactions with the immune cells. Ocul Surf. 21, 279-298 (2021).
  10. Liu, X., et al. Optimization of method for achieving a single-cell suspension from mouse corneas. Exp Eye Res. 233, 109544(2023).
  11. Espana, E. M., Birk, D. E. Composition, structure and function of the corneal stroma. Exp Eye Res. 198, 108137(2020).
  12. Topouzi, H., et al. Methods for the isolation and 3D culture of dermal papilla cells from human hair follicles. Exp Dermatol. 26 (6), 491-496 (2017).
  13. Zhang, T., et al. The effect of amniotic membrane de-epithelialization method on its biological properties and ability to promote limbal epithelial cell culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (4), 3072-3081 (2013).
  14. Hewett, P. W. Isolation and culture of human endothelial cells from micro- and macro-vessels. Methods Mol Biol. 1430, 61-76 (2016).
  15. Chen, W., et al. Existence of small slow-cycling Langerhans cells in the limbal basal epithelium that express ABCG2. Exp Eye Res. 84 (4), 626-634 (2007).
  16. Song, Z., Tsai, C. H., Mei, H. Comparison of different methods to isolate mouse limbal epithelial cells. Exp Eye Res. 212, 108767(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи