Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Микроскопия локализации мембранных белков с использованием одномолекулярной метки

1.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69853

⸱

20 марта 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Illinois Chicago, 2University of Illinois Cancer Center, 3Department of Biomedical Engineering, University of Illinois Chicago, 4Department of Biochemistry and Molecular Genetics, College of Medicine, University of Illinois Chicago

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает маркировку одного антитела (SAL) для разрешения наномасштабной пространственной организации белков плазматической мембраны. Используя кумулятивные взаимодействия антитела и эпитопов на уровне одной молекулы, мембранный SAL (mSAL) картирует локальное распределение эпитопов, одновременно фиксируя поведение связывания антител в родной клеточной среде.

Аннотация

Плазматическая мембрана определяет форму клетки и служит интерфейсом, управляющим межклеточной коммуникацией. Мембранные белки составляют основной класс терапевтических мишеней; Поэтому суперразрешение клеточной мембраны через её составляющие белки имеет большие перспективы для развития клеточной биологии и терапии антител. В этом отношении микроскопия локализации одной молекулы (SMLM) позволяет наномасштабно визуализировать структуры белков на биологических структурах. Несмотря на свою важность, применение SMLM к белкам плазматических мембран создаёт уникальные задачи. В этом протоколе мы представляем эффективный подход с использованием таймлапс-метки одиночных антител (SAL), называемого мембранным SAL (mSAL). Мы предоставляем подробные пошаговые инструкции, включая оптимизацию концентрации антител, плотности мощности лазера, длительности интервалов без освещения, реконструкцию изображений и анализ кластеров на основе плотности для определения распределения белков мембран в наномасштабе и морфологии мембраны. Мы используем белок тетраспанина CD81 в качестве модельного мембранного белка для демонстрации способности mSAL как на адгерентных, так и на суспензионных клетках млекопитающих. Помимо суперразрешения клеточной мембраны и распределения мембранных белков, наша техника позволяет исследовать фармакодинамику терапевтических антител, взаимодействующих с мембранными мишеньями в естественной мембранной среде.

Введение

Плазматическая мембрана содержит разнообразные белки, регулирующие подвижность клеток, адгезию, сенсорность и межклеточные коммуникации. Понимание наномасштабного распределения белков плазматических мембран важно, поскольку функция белка часто определяется не только уровнем экспрессии, но и их пространственной организацией намембране 1,2. Примечательно, что многие терапевтические антитела нацелены на мембранныебелки 3,4, что делает наномасштабные исследования необходимыми для понимания того, как взаимодействия антител влияют на организацию локального мембранного белка. Однако точное картирование распределения белков в мембранах, профилирование их численности в одной молекуле и мониторинг динамических взаимодействий с партнёрами по связыванию в реальном времени остаются сложными.

Широко используемые методы одномолекулярной микроскопии локализации (SMLM), такие как прямая стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия (dSTORM)5,6 и накопление точек на основе ДНК для визуализации в наномасштабной топографии (DNA-PAINT)7, используют иммунофлуоресцентное (IF) окрашивание для маркировки образцов. Они достигают латерального разрешения ~ 10 нм и предоставили обширные данные о наномасштабной организации терапевтических мембранных мишеней, включая рецептор эпидермального фактора роста человека 2 (HER2)8,9, CD2010, рецепторыТ-клеток 11,12,13, программированный лиганд смерти 114, рецепторы В-клеток 15,16,17 иCD19 17,18. Например, исследования dSTORM с использованием терапевтического моноклонального антитела Трастузумаб для прямого обнаружения HER2, ключевого рецептора, причастного к раку молочной железы, выявили различительные стадии кластеризации у пациентов с положительнымHER2 8, а различные терапевтические антитела могли модулировать кластеризацию HER29. ДНК-PAINT в сочетании с микроскопией светового листа на решётке позволило прояснить олигомерные состояния и профили взаимодействия CD20 в B-клетках с терапевтическими моноклональными антителами ритуксимаб, офатумумаб и обинутузумаб10. Хотя традиционный SMLM даёт ценные знания о наномасштабной организации, его полный потенциал ограничен традиционными методами IF-окрашивания. Качество изображения SMLM зависит от IF-окрашивания, которое, в свою очередь, зависит от специфичности и аффинности маркирующего антитела. Традиционный SMLM использует антитела с высокой аффинностью, которые обычно обеспечивают лучшее IF окрашивание и качество изображения. Однако большинство терапевтических антител взаимодействуют с рецепторами на мембране живых клеток с умеренной аффинностью, чтобы минимизировать побочные эффекты внецели 19. Например, биспецифические Т-клеточные активаторы (TCE) демонстрируют более низкую аффинность к CD3, что предотвращает внутреннюю интернализациюTCR 20,21,22. Такие взаимодействия невозможно точно зафиксировать традиционными методами ИФ.

Ранее мы разработали стратегию, напрямую использующую взаимодействие одномолекулярных антител и эпитоп, называемую меткой одного антитела (SAL). SAL обеспечивает высокоплотное картирование взаимодействий антитела и эпитопов при сохранении нативного равновесиясвязывания 23. Хотя ранее мы уже сообщали о протоколе для внутриклеточных цитоскелетных и митохондриальныхбелков 24, SAL на мембранных белках не был доказан. В этом протоколе мы предлагаем пошаговый рабочий процесс применения SAL к мембранным белкам, продемонстрированный меткой тетраспанина CD81, зарегистрированного терапевтического кандидата 25,26,27,28, как в суспензированных, так и в адгерентных клетках. Используя флуоресцентно маркированные антитела против CD81 для прямого исследования пространственного распределения CD81 на клетках U2OS и Jurkat T, мы демонстрируем применение SAL-наномасштабных исследований мембранных белков. Мы назвали эту стратегию мембранной SAL (mSAL). Наконец, мы описываем стратегию, основанную на кластеризации, чтобы снизить количество изолированных обнаружений одной молекулы вне клетки.

По сути, SAL использует таймлапсную одномолекулярную маркировку для захвата индивидуальных взаимодействий антитела и эпитопа, а последующая одноизлучающая деконволюция даёт изображение с суперразрешением на основе SMLM. Корректируя концентрацию антител и выбирая соответствующий интервал без освещения (NII) между последовательными кадрами изображения, SAL сопоставляет частоту антитела с частотой обнаружения одной молекулы, что позволяет локализовать одну молекулу. SAL требует более длительных NII из-за медленной кинетики связывания антител, которые продлевают длительность получения изображения (~3–17 ч). SAL лучше всего подходит для приложений, требующих точного нанокартирования эпитопов и оценки динамики взаимодействия между антителами и эпитопами. Несмотря на низкую пропускную способность, SAL даёт уникальное понимание организации эпитопов и взаимодействия с антителами в близких физиологических условиях, что делает его особенно ценным для характеристики терапевтических антител in situ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол использует устоявшиеся линии Jurkat E6.1 и U2OS и не включает первичные человеческие или живые животные материалы.

1. Посев/посадка и фиксация клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка образца следует стандартным протоколам окрашивания по иммунофлуоресценции (IF), оптимизированным для сохранения субклеточной организации белков плазматической мембраны между различными типами клеток. Если существует установленный протокол иммунокрашивания для интересующего объекта, пользователи могут следовать этому протоколу до этапа блокировки образца 1.2.14. Маркировка одиночных антител (SAL) основана на накопленном обнаружении флуоресцентно маркированных антител при их связывании с антигеном на уровне одной молекулы. Флуоресцентно меченные антитела, разбавленные в буфере визуализации, добавляются к образцам на стадии микроскопа, а флуоресцентная маркировка происходит динамически по мере процесса получения изображения. На этапе подготовки образца флуоресцентная маркировка не проводится.

  1. Подготовьте клеечные элементы, такие как линия клеток U2OS, как описано в ранее опубликованномпротоколе 24.
  2. Ячейковы суспензии
    1. Поддерживайте Т-клетки Jurkat при плотности 1 x 105 –1 x 106 клеток/мл в 10 мл полной среды RPMI (RPMI 1640 с добавлением 10% (v/v) сыворотки плода бычьего скота, 100 U/mL пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с добавлением 5%CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: рекомендуемые 10 мл полного материала применяются к колбам T25; Пользователям следует масштабировать объём соответственно при использовании различных сосудов для культур.
    2. Подготовьте стеклянную поверхность, добавив 200 мкл раствора 0,01% поли-L-лизина (PLL) в колодцы, предназначенные для использования в 8-камерном крышном стекле. Инкубировать на ночь при 4 °C или 2 часа при 37 °C.
    3. Подсчитайте клетки из культуры с помощью гемоцитометра, затем перенесите 3,5 x 104 клеток в микроцентрифугную трубку объемом 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество клеток, возможно, потребуется скорректировать для хорошего распределения отдельных клеток. Диапазон посева от 30 000 до 60 000 Т-клеток Jurkat достигает идеальной плотности, при которой отдельные клетки чётко разделены друг от друга, не слишком редко распределённые. Количество клеток, возможно, потребуется скорректировать для нового типа клеток.
    4. Центрифугуйте при 300 г в течение 3 минут, чтобы получить клеточную гранулу. Сбросьте супернатант и снова суспензуйте клеточную гранулу в 200 мкл предварительно нагретого (37 °C) 1x физиологического раствора Dulbecco's Phosphate Buffered (DPBS). Полученная клеточная гранула будет видна в виде небольшого белого отложения внизу трубки микроцентрифуги.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Утилизировать биологические опасные отходы в соответствии с руководящими принципами учреждения и всеми применимыми местными, штатными и федеральными нормативами.
    5. Аспирировать раствор PLL из подготовленного камерного крышного стекла (шаг 1.2.2). Если инкубация PLL проходит ночью при 4 °C, предварительно нагрейте крышное стекло с 8 камерами до 37 °C перед аспирированием раствора.
    6. Добавьте подвеску ячейки из шага 1.2.4. на скважину камеры с покрытием PLL. Инкубировать в увлажнённом инкубаторе при 37 °C с добавлением 5%CO2 в течение 30 минут, чтобы клетки могли прикрепиться к поверхности. Тщательно перемешайте суспензию ячейки перед покрытием и пипеткой вверх и вниз, чтобы разрушить сгустки клеток и обеспечить равномерное распределение по колодцу.
    7. Проверьте прикрепление клетки к стеклянной поверхности с помощью светового микроскопа. При увеличении в 10 раз фокусируйте микроскоп на нижней части стекла крышки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожное постукивание по стеклу в камере во время наблюдения под микроскопом может помочь оценить, прикрепились ли клетки к поверхности или всё ещё плавают.
    8. Подготовьте 200 мкл фиксационного буфера (4% параформальдегид и 0,1% глутаральдегид в DPBS) и предварительно прогрейте до 37 °C в водяной бане.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предоставленный фиксационный буфер оптимизирован для CD81 и обычно подходит для сохранения мембранных белков. Для новых мембранных белковых мишень буферный состав может потребовать корректировки для достижения оптимального сохранения. Пользователям рекомендуется обращаться к литературе для поиска условий фиксации, адаптированных под новые цели.
      ВНИМАНИЕ: Параформальдегид токсичен и канцерогенен. Глутаральдегид токсичен и коррозийный. При обращении с этим реактивом используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ). В случае контакта с кожей немедленно тщательно промой поражённое место с мылом и водой. Утилизировать реагент в соответствии с руководящими принципами учреждения пользователя и всеми применимыми местными, штатными и федеральными нормативами.
    9. Аспирировать DPBS из каждой ямки образца (начиная с шага 1.2.6) с помощью микропипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно выполнять все этапы обмена раствором медленно, чтобы избежать вымещения клеток из стекла крышки. Утилизировать биологически опасные отходы в соответствии с руководящими принципами учреждения пользователя и всеми применимыми местными, штатными и федеральными нормативами.
    10. Добавьте 200 мкл предварительно подогретого буфера фиксации при температуре 37 °C в угол колодца и инкубуйте при комнатной температуре в течение 15 минут.
      ВНИМАНИЕ: Параформальдегид токсичен и канцерогенен. Глутаральдегид токсичен и коррозийный. При обращении с этими реагентами используйте соответствующие средства индивидуальной защиты. В случае контакта с кожей немедленно тщательно промой поражённое место с мылом и водой. Утилизировать реагент в соответствии с руководящими принципами учреждения пользователя и всеми применимыми местными, штатными и федеральными нормативами.
    11. Промывайте фиксированные элементы три раза с 500 мкл DPBS. Пропускайте этот шаг, если переходите к шагу 1.2.12.
    12. Опционально: Медленно удалите раствор фиксации и добавьте 200 мкл свежеприготовленного борогидрида натрия 0,1% в DPBS, затем инкубируете при комнатной температуре в течение 7 минут. Пропустите этот шаг и перейдите к шагу 1.2.14, если не используете восстановление борогидрида натрия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Восстановление с помощью борогидрида натрия помогает затушить автофлуоресценцию, образующуюся глутаральдегидом, и нейтрализует нереагированные альдегиды. Высвобождение водорода в результате реакции борогидрида натрия с водным раствором проявляется в виде выделения пузырьков. Если выделение водорода не наблюдается, используйте свежеприготовленный раствор борогидрида натрия.
      ВНИМАНИЕ: боргидрид натрия токсичен и коррозийный. При обращении с этим реагентом надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты. В случае контакта с кожей немедленно тщательно промой поражённое место с мылом и водой. Утилизировать реагент в соответствии с руководящими принципами учреждения пользователя и всеми применимыми местными, штатными и федеральными нормативами.
    13. Аспирируйте раствор борогидрида натрия из каждой скважины, затем трижды промывайте с помощью 500 мкл DPBS.
    14. Подготовьте 200 мкл блокирующего буфера и добавьте его в колодцу. Инкубировать при комнатной температуре 30 минут. Не используйте реагент для проницаемости (например, TritonX-100, сапонин), так как он может удалять мембранные белки. Протокол мембранного SAL (mSAL), представленный здесь для CD81, не включал блокирующий этап.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для mSAL с новыми мишенями рекомендуется блокирующий буфер, содержащий 5% (w/v) бычьей сывороточной сыворотки альбумина (BSA) в DPBS. При использовании вторичных антител соответствующая сыворотка используется для блокировки. Например, 10% (v/v) козья сыворотка в DPBS при использовании вторичного антитела к козье-хозяину. Если существует установленный рецепт блокирующего буфера и протокол для целевой цели, пользователи могут следовать этому протоколу. Блокирующий буфер, по желанию, может быть дополнен антителами контроля изотипа или антителами, полученными из сыворотки, чтобы уменьшить внецелевые связыванияантител 23,24. Включайте реагент проницаемости в блокирующий буфер только если антитело нацелено на внутриклеточный эпитоп мембранного белка.
    15. Для mSAL с первичными антителами, конъюгированными красителями, сразу переходите к шагу 1.2.20.
    16. Приготовьте 150 мкл раствора для окрашивания первичных антител (антитела в нужной концентрации, разбавленные в блокирующем буфере). Пропустите этот шаг для mSAL с первичными антителами, конъюгированными красителями.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для окрашивания первичных антител обратитесь к техническому листу поставщика для рекомендуемых состояний. Если информация о концентрации не предоставлена, начните с 4 мкг/мл (27 нМ) для полноразмерногоIgG 23,24.
    17. Замените блокирующий буфер на первичный раствор антител. Инкубировать при комнатной температуре в течение 2 часов или при 4 °C ночью в влажной камере. Пропустите этот шаг для mSAL с первичными антителами, конъюгированными красителями.
    18. Промой образец дважды с помощью 400 мкл DPBS. Добавьте 200 мкл блокирующего буфера в скважину.
    19. Опционально: заменить блокирующий буфер на 200 мкл постфиксационного буфера (4% параформальдегида) и инкубировать 10 минут при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Постфиксация помогает сохранить блокировку образца для SAL23,24. Однако этот шаг следует опустить, если он снижает доступность эпитопа. Чтобы оценить влияние постфиксации на распознавание эпитопов антителами, проведите стандартное иммунофлуоресцентное окрашивание с постфиксацией и без неё, а также сравните качество окрашивания.
    20. По желанию: промыть образец дважды с помощью DPBS.
    21. Добавьте 200 мкл DPBS в каждую скважину и накройте камеру прозрачной пленкой, чтобы предотвратить испарение. Образцы можно хранить при 4 °C до 1 месяца. Если вы выполняете mSAL сразу после шага 1.2.14 или 1.2.19 без постфиксации, оставите образец в блокирующем буфере и переходите сразу к шагу 2.2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Содержание образца в DPBS с добавлением азида натрия с концентрацией 5 мМ предотвратит рост бактерий во время хранения.
      ВНИМАНИЕ: Азид натрия крайне токсичен и может быть смертельно опасным при проглатывании. При обращении с этим реагентом надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты. В случае контакта с кожей немедленно тщательно промой поражённое место с мылом и водой. Утилизировать реагент в соответствии с руководящими принципами учреждения пользователя и всеми применимыми местными, штатными и федеральными нормативами.

2. Получение изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура визуализации как для адгерентных, так и для подвесных клеток схожа и проводится с использованием микроскопии с полной внутренней флуоресценцией (TIRF). Однако условия визуализации должны быть оптимизированы для каждого типа клеток.

  1. Дайте хранящимся образцам (при 4 °C) достичь комнатной температуры перед съёмкой, чтобы предотвратить конденсация стекла. Пропустите этот шаг, если переходите сразу к визуализации после подготовки образца.
  2. Включите систему микроскопа: микроскоп, sCMOS-камеру, лазерный блок и компьютер с программным обеспечением для получения изображений. Дайте системе микроскопа стабилизироваться на 5-10 минут после включения, чтобы компоненты системы достигли рабочих температур и минимизировали тепловой дрейф.
    ПРИМЕЧАНИЕ: mSAL можно выполнять с помощью любой установки микроскопа TIRF и соответствующего программного обеспечения. Включите систему согласно инструкциям прибора.
  3. Нанесите иммерсионное масло на объектив TIRF (например, 100x/1.49) и закрепите стекло крышки камеры на ступень микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если объектив оснащён корректирующим воротником, убедитесь, что он настроен на правильную толщину стекла крышки при температуре 23 °C. Корпусное стекло, использованное в этом исследовании, имело толщину 0,13–0,17 мм.
  4. Если он оснащён, включите Perfect Focus System (PFS), затем аккуратно поднимите объектив к стеклу крышки и приведите образец в фокус.
  5. Подготовьте золотые коллоиды в качестве фидуциальных маркеров (разбавление 1:2 в сверхчистой воде). Соникизуйте золотые коллоиды перед разбавлянием в течение 3 минут, чтобы рассеять агрегаты.
  6. Аккуратно аспирируйте буфер хранения (DPBS или блокирующий буфер) из проба и добавьте 200 мкл золотого коллоидного раствора в образец. Инкубировать 1 минуту и удалить раствор.
  7. Используйте яркое освещение, чтобы убедиться, что достаточно золотых коллоидов отложено до аспирации раствора. Идеальная плотность состоит из 5–10 золотых коллоидов в указанной области интереса (ROI).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, флуоресцентные микросферы (см. Таблицу материалов) могут использоваться при разбавлении 1:1 000 в DPBS.
  8. Промыйте 1 раз с 500 мкл сверхчистой воды, чтобы удалить излишки золотых коллоидов, затем добавьте 200 мкл DPBS.
  9. В программном обеспечении для визуализации создайте оптическую конфигурацию флуорофора (зонда антитела), включая соответствующую дихроическую точку, длину волны возбуждения лазера, плотность мощности, время интеграции камеры, фильтр излучения и бинирование пикселей камеры (если применимо). Рекомендуется размер пикселя 150-160 нм для достижения оптимального разрешения.
  10. Создайте оптическую конфигурацию для фотоотбеливания. Рекомендуется мощность лазера 380 Вт/см² и выше с временем интеграции камеры 1 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фотоотбеливание во время приобретения помогает минимизировать перекрытие между отдельными событиями связывания флуоресцентных антител. Собранный свет можно направлять через эмиссионный фильтр с несовпадающей длиной волны, чтобы избежать насыщения камеры.
  11. Отрегулируйте угол лазера для установления освещения TIRF. Используя яркое освещение, определите ячейку для mSAL. Убедитесь, что внутри ROI видно не менее 5 золотых коллоидов для коррекции смещения ступеней при реконструкции изображения. Подтвердите автофлуоресценцию золотых коллоидов при плотности мощности лазера для визуализации.
  12. Установите параметры изображения: интервал неосвещения (NII), количество кадров и частоту фотоотбеливания (при необходимости) в программном обеспечении для получения изображений. Для mSAL CD81 на T-клетках U2OS и Jurkat с антителами к CD81 оптимальными настройками были NII 5 с, 2000 общих кадров и фотоотбеливающий этап каждые 5-й кадр.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры должны быть оптимизированы для каждого интересующего белка, используемого антитела к mSAL и типа клетки. См. шаг 3 для получения дополнительной информации об оптимизации. Оптимальное количество кадров может варьироваться как между антителом-мишенью, так и типом клетки. Для новых целевых систем рекомендуется отправной точке захвата 2 000–3 000 кадров. NII увеличивают длительность получения изображений. Например, приобретение mSAL на 3 000 кадров с NII 20 с приводит к ~17 часам времени приобретения.
  13. Подготовьте буфер визуализации, разбавляя антитело CD81 до концентрации 1 мкг/мл в 200 мкл 5% BSA (w/v) в DPBS. Для mSAL CD81 конечная концентрация антител составляла 0,5 нМ для Т-клеток Jurkat и 2 нМ для клеток U2OS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация антител зависит от количества локального субстрата и аффинности антитела. Критически важно оптимизировать концентрацию антител для каждого белкового мишени, каждого антитела, используемого для визуализации, и каждого типа клеток. Обратитесь к шагу 3.1 для получения дополнительной информации об оптимизации.
  14. Добавьте подготовленный буфер для визуализации в скважину и начинайте получение.

3. Оптимизация параметров изображения

ПРИМЕЧАНИЕ: параметры mSAL визуализации зависят от экспрессии белка, его локальной организации и выбора антител для визуализации. Цель оптимизации параметров визуализации — определить концентрацию антител и NII, вызывающие пространственно разрешённые события с одной молекулой при сохранении достаточной высокой плотности для максимизации выборки эпитопа.

  1. Концентрация антител
    1. Разведите антитела до 0,5 нМ для клеток Jurkat и 2 нМ для клеток U2OS в 200 мкл 5% (w/v) BSA в DPBS и добавьте раствор антитела в колодец. Для оптимального маркировки одноантитела используйте концентрацию антител на уровне или рядом с его равновесной диссоциационной константой (Kd); если Kd неизвестна, рекомендуется начинать с 1 нм.
    2. Используйте функцию live-view в программном обеспечении визуализации, настроенной на mSAL, для мониторинга связывания антител.
    3. Отрегулировать угол TIRF и параметры изображения, чтобы достичь отношения сигнал/шум (SNR) ≥ 3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: оптимальный угол TIRF улучшает SNR, ограничивая размытую флуоресценцию от диффундирующего антител в буфере визуализации. В начале можно использовать плотность мощности лазера 100-200 Вт/см² и время интеграции камеры 50 мс. Если SNR низкий, постепенно увеличивайте мощность лазера и/или время интеграции камеры и следите за изменениями SNR до достижения оптимального значения.
    4. Настройте параметры изображения в программном обеспечении для получения не менее 10-кадрового захвата с NII 5 с (см. шаг 2.12).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется 5-секундный NII в качестве отправной точки. Необходимо провести NII-сканирование для определения оптимального NII для новой системы антитела-таргет (шаг 3.2).
    5. Начинайте приобретение. Оценить разрежённость локализаций одной молекулы записанного фильма.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные шаги по получению плотности локализации описаны в предыдущей публикации24. Плотность локализации одной молекулы от 0,02 до 0,15 событий/мкм² оказалась оптимальной для mSAL.
    6. Если сразу после добавления буфера для визуализации наблюдается несколько перекрывающихся событий связывания антител или локализации одной молекулы накапливаются со временем по мере прохождения записи, прекращайте получение. Уменьшите концентрацию антител в два раза и повторите получение на новом образце. Повторяйте процесс снижения концентрации антител в 2 раза и переоценку количества событий на единицу площади до достижения желаемой плотности событий локализации одной молекулы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перекрывающиеся события проявляются как несколько крупных пунктов, которые становятся ярче или крупнее при связывании нового антитела в пределах дифракционного предела первого антитела.
    7. Если плотность событий невелика, увеличьте концентрацию антител в буфере визуализации в 2 раза и повторите получение на новом образце. Повторяйте процесс увеличения концентрации антител в 2 раза и переоценки количества событий связывания на единицу площади до достижения желаемой плотности локализации в одной молекулы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать свежий образец для каждого эксперимента по оптимизации концентрации, чтобы избежать возможных помех со стороны предварительно связанных антител при последующих оценках плотности локализации.
  2. Оптимизация NII
    1. Настройте параметры изображения в программном обеспечении для получения 50-кадрового захвата (см. шаг 2.12). Установите NII на 0 (без задержки).
    2. Подготовьте буфер визуализации к оптимальной концентрации антител с шага 3.1 и добавьте его в образцовую яму. Начинайте приобретение.
    3. Повторите шаги 3.2.1-3.2.2, корректируя NII на 1, 3, 5, 10 или 20 секунд. Выполняйте каждое получение на новом образце.
    4. Оценить плотность и разрежённость локализаций одной молекулы записанного фильма (см. шаги 3.1.5–3.1.7). Минимальный NII с оптимальной плотностью событий одной молекулы определяется как оптимальный NII.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрацию антител может потребовать дополнительной оптимизации для достижения оптимальной плотности локализации одной молекулы для соответствующего NII. См. шаг 3.1. Предыдущие отчёты показывают, что более длинные NII (10-20 с) были более избирательны к событиям связывания с высокой плотностью, но продление NII сверх 20 с не дало дополнительногоулучшения 23,24. Если пространственно перекрывающиеся события связывания пространственно происходят в ходе получения изображения, введите фотоотбеливание с интервалами, достаточно для удаления флуоресценции от связанных антител. Например, если к пятому кадру появляются перекрывающиеся события, применяйте фотоотбеливание каждые пятый кадр. Появление пространственно перекрывающихся событий описано в ПРИМЕЧАНИИ к шагу 3.1.6.

4. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: реконструкция изображения mSAL используется с помощью бесплатного программного обеспечения NIH Fiji29 с плагиномThunderSTORM 30 . В этом протоколе использовались версии Fiji v1.54r и ThunderSTORM версии 1.3. Детальный анализ изображений был описан в предыдущем протоколе 24. В этом разделе мы описываем рабочий процесс анализа, используемый специально для mSAL. Анализ, представленный в этом протоколе, использовал камеру Prime95B sCMOS (серийный номер A18B203004) с фотоэлектронами на A/D 0,98 и базовым уровнем камеры 100. Размер пикселя изображения установлен на 147 нм.

  1. Задайте параметры для реконструкции в окне анализа забега. Параметры, используемые для реконструкции изображений CD81 mSAL, описаны ниже. Функция предварительного просмотра следует использовать для оценки обнаруженных событий связывания одной молекулы в выбранной системе перед полным анализом.
    Фильтрация изображений:
    Фильтр: Вейвлет-фильтр (B-шлиц)
    Порядок B-шлиц: 2
    Шкала B-Spline: 4
    Приблизительная локализация молекул:
    Метод: Локальный максимум
    Порог максимальной интенсивности: std (Wave.F1)
    Связность: 8 районов
    Субпиксельная локализация молекул:
    Метод: PSF: интегрированный гауссов
    Радиус посадки [px]: 2
    Метод подгонки: максимальная вероятность
    Начальная сигма [px]: 0,75
    Многоэмиттерный анализ фитинга: не выбран
    Визуализация результатов:
    Метод: нормализованный гауссов
    Увеличение: 7.3
    Частота обновлений [кадров]: 50
    Латеральная неопределённость: 20
    ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры предварительной фильтрации используются для улучшения обнаружения одного эмиттера на фоне. Они служат отправными точками, но должны быть оптимизированы для каждого набора данных. Параметры приблизительной локализации и метода обнаружения используются для событий связывания одной молекулы. Использование максимальных локальных интенсивностей с 8-окрестной связностью показывает надежнуюпроизводительность 31. Был выбран интегрированный метод Гаусса с максимальной правдоподобной подгонкой, так как он широко используется и обеспечивает надёжное приближение функции точечного распространения (PSF) в приложениях с одной молекулярнойвизуализацией 32,33,34,35. Метод визуализации, используемый в этом протоколе, — нормализованный гауссовый. Пользователи могут выбрать метод визуализации, который лучше всего соответствует их данным. Увеличение было установлено так, чтобы дать реконструированный размер пикселя 20 нм, что соответствует ожидаемой точности локализации, достижимой с помощью маркировки на основе антител, где ошибка связи составляет порядка ~10 нм. Коэффициент увеличения 7,3 был рассчитан путём деления размера пикселя, ограниченного дифракцией, на желаемый реконструированный размер пикселя (147 нм / 20 нм = 7,3). Частота обновления определяет, как часто восстановленное изображение обновляется во время обработки, но не влияет на итоговый результат. Латеральная неопределённость устанавливается на 20 (но не принудительно), чтобы реконструкция учитывала рассчитанные неопределенности локализации. Для получения дополнительной информации о доступных опциях обратитесь к руководству пользователяThunderSTORM 30 или нажмите на вопросительный знак рядом с полем ввода.
  2. Начните анализ ThunderSTORM с начальной сигмы 1,6 пикселя и подходящим радиусом 3. Уточняйте параметры по мере необходимости. Многоизлучательная подгонка не использовалась, так как плотность событий сохранялась не перекрывающейся на изображениях с ограничением дифракции.
  3. Нажмите OK , чтобы запустить реконструкцию. После завершения окно результатов откроется автоматически.
  4. Используйте функцию Plot гистограммы , чтобы найти пиковую сигму. Преобразите это значение (нм) в пиксели, разделив на размер пикселя исходных данных, затем повторите анализ ThunderSTORM, используя новое значение начальной сигмы и радиуса подгонки, установленного на целое число, близкое к 3x начальнойсигме 30.
  5. Определите коррекцию дрейфа с помощью выбранного фидуциальногомаркера 24.
  6. Выполните реконструкцию изображения по всему углу зрения и примените рассчитанную коррекцию дрейфа.
  7. Для постобработки изображения нажмите на вкладку «Фильтр » в окне результатов. Применяйте фильтры для удаления плохо локализованных событий. В показанных результатах для CD81 были удалены события с сигмой более 200 нм и неопределённостью более 20 нм. Используйте функцию гистограммы графика для анализа распределения сигмы и определения подходящего порога.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Локализации на одной молекуле с большими сигма-значениями обычно возникают из-за тусклых флуорофоров с низким количеством фотонов или излучителей, которые перекрываются. Локализации с неопределённостью более 20 нм также были удалены, так как неопределённость, превышающая итоговый размер пикселя, указывает на низкую точность локализации. Для получения дополнительных рекомендаций по параметрам фильтрации обратитесь к руководству пользователяThunderSTORM 30.
  8. Сохраните таблицу результатов с данными локализации отдельных молекул для дальнейших анализов, выбрав Экспорт. Экспортированный файл будет в .csv формате и в этом протоколе называться mSAL.csv. Сохраняйте полученное нормализованное гауссовское изображение.

5. Кластерный анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Во время эпитопного зонда антитела взаимодействуют со своими целями (специфическими взаимодействиями), а также с внетаренными молекулами (неспецифическими взаимодействиями). Поскольку mSAL зависит от кумулятивного обнаружения отдельных событий связывания между антителом и антигеном, некоторые неспецифические взаимодействия неизбежно способствуют формированию реконструированного изображения. Взаимодействия антитела и эпитопа демонстрируют характерные кинетические отпечатки, которые, в принципе, могут различать специфическое от неспецифическое связывание, при этом специфические и неспецифические события различаются по локальной плотности взаимодействия, а не по одномолекулярному временипребывания 36. Здесь описывается пространственная кластеризация приложений на основе плотности с анализом шума (DBSCAN)37 для удаления событий низкой плотности, сохраняя события высокой плотности, которые с большей вероятностью отражают специфическое связывание антител. Кроме того, кластеризация на основе плотности может дать количественное представление о наномасштабной пространственной организации белков, особенно тех, которые естественно организуются в кластеры, например, CD81 в микродомены, обогащённые тетраспанином,38, 39, 40, 41, 42. Предоставленный анализ DBSCAN был проведён с использованием MATLAB 2025a. Пользователям без доступа к MATLAB рекомендуется проводить аналогичные анализы DBSCAN с помощью открытых альтернатив, таких как Python илиR 43, 44, 45. Код, используемый в этом протоколе, можно получить из: https://github.com/nrams12/DBSCAN_SAL_Clusterer/tree/main.

  1. Запуск кода
    1. Скачайте файл MATLAB с ссылки на GitHub выше.
    2. Запустите MATLAB и откройте код. На строках 37 и 38 установите минимальное количество точек (minPTS) и эпсилон для параметров кластеризации. Использовались следующие параметры:
      Т-клетки Юрката:
      minPTS: 7
      Эпсилон: 60
      Ячейки U2OS:
      minPTS: 7
      Эпсилон: 80
      ПРИМЕЧАНИЕ: См. шаг 5.2 для получения дополнительной информации об оптимизации этих параметров.
    3. Укажите путь файла в программном обеспечении MATLAB на папку, содержащую восстановленный mSAL.csv файл.
    4. Запустите код, нажав Run. Код подскажет пользователю выбрать файл. Выберите файл mSAL.csv и нажмите «Открыть».
    5. Кластерные данные автоматически сохраняются в папке с названием MATLAB Data в пути файла, указанном в коде. Откройте этот файл в ThunderSTORM, нажав на Plugins > ThunderSTORM > Import/Export > Import results.
    6. Сохранить полученное изображение микроскопии локализации одной молекулы.
  2. Оптимизация входных данных кластеризации
    ПРИМЕЧАНИЕ: Два входных параметра алгоритма DBSCAN — это minPTS и epsilon. Epsilon определяет радиус вокруг точки для установления её окрестности, а minPTS указывает минимальное количество точек внутри этой окрестности, необходимое для формирования плотной области. Точки, удовлетворяющие этому требованию плотности, классифицируются как основные точки, а их окрестности рекурсивно добавляются в кластер. Точки, не соответствующие требованию плотности, но находящиеся в окрестности основной точки, обозначены как пограничные точки, тогда как все остальные точки считаются точками шума.
    1. Проведите анализ, используя описанные выше входные данные (шаг 5.1.2) в качестве отправной точки. Выберите значение minPTS, которое превышает количество локализаций шума, но меньше количества локализаций на ячейке. После выбора minPTS отрегулируйте эпсилон так, чтобы это количество локализаций можно было фиксировать в радиусе окрестностей для представительных внутриклеточных областей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: minPTS и эпсилон могут регулироваться независимо друг от друга. Практический подход к выбору этих параметров — сначала изучить график рассеяния шумовых точек за пределами ячейки и сравнить их с количеством локализаций, наблюдаемых в аналогичных по размере участках ячейки.
    2. Оцените окно с пометкой Рисунок 2 , изображающее сгруппированные данные. Если данные сохраняют кластеры на клетке, содержащие ожидаемый фенотип с минимизированными локализациями вне клетки, входные данные для кластеризации достаточны.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кластерные данные должны сохранять структуру данных, полученных с помощью mSAL. Если кластеры кажутся небольшими, локализованными только в очень высокоплотных областях исходных данных, и исключают значительное количество связывающих событий, коррелирующих с ожидаемым фенотипом, параметры кластеризации могут быть слишком ограничительными. Если неспецифическое связывание вне клетки недостаточно редуцировано при больших кластерах, параметры кластеризации могут быть слишком инклюзивными.
    3. Если параметры кластеризации слишком ограничительны, уменьшайте minPTS и увеличивайте эпсилон, чтобы включить больше точек в кластерные данные. Если параметры кластеризации слишком инклюзивны, увеличьте minPTS и уменьшите эпсилон.
    4. После настройки minPTS и Epsilon запустите код. Повторяйте шаги 5.2.2-5.2.3, пока не будет достигнуто оптимального кластерирования.

6. Валидация связывания антител с целью

ПРИМЕЧАНИЕ: Для мембранных белков без чётко определённой морфологии проверка точности разрешённых структур может быть сложной. Для подтверждения специфичности антител пользователи могут экспрессировать флуоресцентное белоковое слияние (FP) целевой белка. В качестве первоначальной проверки можно провести традиционное иммунофлуоресцентное окрашивание клеток, экспрессирующих FP-слияние. Для более точной валидации при оценке новых антител mSAL можно провести на клетках, экспрессирующих FP, чтобы подтвердить, что локализованные события связывания соответствуют флуоресцентно помеченной цели. Здесь приводится протокол трансфекции клеток U2OS с помощью CD81-mStayGold, позволяющий подтвердить, что локализации CD81 mSAL соответствуют FP-маркированному CD81 на поверхности клетки. Пользователи могут заменить любой подходящий флуоресцентный белок, если его излучение не пересекается с флуоресцентным каналом проверяемого антитела.

  1. Засеять клетки U2OS в затвор с 8 ячелинами и вырасти до ~70% совпадения. Поддерживать клетки в 200 мкл полноценной среды роста (DMEM с добавлением 10% (v/v) сыворотки плода бычьего скота, 100 мкл/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина).
  2. Комбинировать 100 нг конструкции ДНК, кодирующего белок, с флуоресцентным репортером с 5 мкл Липофектамина 2000. Вихрь 30 секунд и инкубация 30 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовался CD81, слитый с mStayGold. Стандартные методы молекулярного клонирования применялись для получения плазмид ДНК, хотя они не описаны в этом протоколе. Соотношение ДНК: Липофэктамин, предоставлено, оптимизировано для клеток, посеянных в 8-камерных стеклах, и может потребовать корректировки в соответствии с инструкциями производителя для других форматов образцов.
  3. Добавьте 5 мкл раствора ДНК/липофектамина в клетки. Инкубировать камерный затвор в течение 4 часов при 37 °C, дополняя 5%CO2 во влажной среде.
  4. Замените среду на предварительно нагретые полноценные материалы. Инкубировать > 8 часов при 37 °C с добавлением 5%CO2 во влажной среде для обнаружения уровня экспрессии белка.
  5. Оценивайте уровень экспрессии флуоресценции на клетках с помощью флуоресцентного микроскопа или имиджера. Рекомендуется эффективность трансфекции ≥ 30%. Если уровень экспрессии флуоресценции неоптимален, оптимизируйте соотношение ДНК: липофектамин в соответствии с рекомендациями производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Временно экспрессирующие клетки следует использовать для валидации антител в течение 24-48 часов после трансфекции.
  6. Чтобы исправить ячеек, пожалуйста, следуйте шагам 1.2.8-1.2.13.
  7. Фиксированные образцы храните в 200 мкл DPBS с 5 мМ натриевым азидом до готовности к визуализации. Образцы можно хранить при 4 °C до 1 месяца.
    ВНИМАНИЕ: Азид натрия крайне токсичен и может быть смертельно опасным при проглатывании. При обращении с этим реагентом надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты. В случае контакта с кожей немедленно тщательно промой поражённое место с мылом и водой. Утилизировать реагент в соответствии с руководящими принципами учреждения пользователя и всеми применимыми местными, штатными и федеральными нормативами.
  8. Следуйте шагам 2.1-2.12, чтобы настроить микроскоп и установить образец. Определите клетку, экспрессирующую интересующий белок, с помощью флуоресцентного сигнала.
  9. Для справки сделайте изображение ячейки с помощью TIRF. Если используется флуоресцентный белок в том же канале визуализации, что и антитело mSAL, проводите фотоотбеливание флуоресцентного белка. Для фотоотбеливания белка используйте максимальную мощность лазера в течение > 10 минут, пока сигнал не исчезнет.
  10. Добавьте подготовленный буфер для визуализации в скважину и начинайте съёмку. Анализ следует завершить, как описано ранее (шаг 4).
  11. Откройте как реконструированное, так и TIRF-изображение флуоресцентного белка, полученного до получения mSAL. Оценить расположение связывания антител к mSAL, сравнивая внешний вид и локализацию экспрессируемого белка, показанных на дифракционно-ограниченном изображении TIRF, с изображением mSAL.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Технология mSAL, описанная в этом протоколе, позволяет визуализировать отдельные события связывания антител с соответствующими белковыми мишеньями плазматической мембраны, создавая суперразрешённую карту распределения белков мембраны. Здесь используется CD81 в качестве репрезентативного примера, хотя этот подход легко адаптируется к другим мембранным белкам.

Иммобилизация Т-клеток Jurkat с достаточным расстоянием между клетками обеспечивает доступ к мембранном...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Организация белков плазматической мембраны играет жизненно важную роль в регулировании функции клетки. Традиционные методы флуоресцентной микроскопии ограничены пределом дифракции света, что скрывает их наномасштабную организацию. SMLM преодолевает это ограничение, достигая пространственного разрешения 10-20нм 47, что позволяет характеризуть свои наномасштабныесборки 10, 48, 49...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Все авторы заявляют, что у них нет конфликтов интересов, которые нужно раскрывать.

Благодарности

Исследования, представленные в этой публикации, были поддержаны Национальным институтом общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под номером R35GM146786 и Колледжем гуманитарных наук и гуманитарных наук Университета Иллинойса в Чикаго. Содержание лежит исключительно на авторах и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
антитела против CD81 Alexa Fluor 488Термо Фишер СайентификMA5-44132Антитела для визуализации
Настольная центрифугаЭппендорф5424
Бычий сывороточный альбуминMilliporeSigmaA7906-100G
Камерное крышное стекло, 8-колодецCellvisC8-1-N
Медиа DMEMТермо Фишер Сайентифик11960069
Физиологический раствор с буфером фосфатов DulbeccoТермо Фишер Сайентифик14190-144
Сыворотка плода крупного рогатого скотаMilliporeSigmaF0926-500ML
Глутаральдегид, 10 %Науки об электронной микроскопии16120
Золотые коллоиды, 100 нмТед Пелла15711 и минус; 20Фидуциальный маркер
Погружное масло и bbsp;Лаборатории Каржиль16245
Инвертированный микроскоп и bbsp; оснащённый модулем TIRFNikon InstrumentsEclipse Ti2-EМикроскоп
Ячейковая линия Jurkat E6.1MilliporeSigma88042803-1VLПодвесные ячейки
Лазерный запуск, 6 строкОксиусL6CC-CS8-1511Возбуждающий лазер
Липофектамин 2000Термо Фишер Сайентифик11668019Трансфекционный реагент
Микроцентрифугная трубка, 1,5 мл VWR89000-028
Программное обеспечение для микроскопической визуализацииNikon InstrumentsПередовые исследования NIS-ElementsПрограммное обеспечение для обработки изображений
Цель: 100x/1.49 CFI APO TIRF Nikon InstrumentsMRD01991Объектив микроскопа
Параформальдегид, 16 %Науки об электронной микроскопии15710
Пенициллин-стрептомицинТермо Фишер Сайентифик15140-122Антибиотики
Раствор поли-L-лизина, 0,01% MilliporeSigmaP4707-50ML
Камера prime 95B sCMOSРешения Teledyne Vision01-PRIME-95B-R-M-16-CКамера
Медиа RPMI 1640Термо Фишер Сайентифик11875-093Среда для подвесных ячеек
Натрий-азидТермо Фишер Сайентифик19038-1000
Боргидрид натрияMilliporeSigma213462-25G
Фляжки для культуры T25Термо Фишер Сайентифик169900
Микросферы TetraSpeckФидуциальный маркер
Контейнер для культуры тканей, 100 mm Корнинг353003
Ячеточная линия U2OSATCCHTB-96Адгерентные ячейки

Ссылки

  1. Zulueta Diaz, Y., de las, M., Arnspang, E. C. Super-resolution microscopy to study membrane nanodomains and transport mechanisms in the plasma membrane. Front Mol Biosci. 11, 1455153(2024).
  2. Levental, I., Lyman, E. Regulation of membrane protein structure and function by their paralipidomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (2), 107(2022).
  3. Stephens, A. D., Wilkinson, T. Discovery of Therapeutic Antibodies Targeting Complex Multi-Spanning Membrane Proteins. Biodrugs. 38 (6), 769(2024).
  4. Chan, A. C., Martyn, G. D., Carter, P. J. Fifty years of monoclonals: the past, present and future of antibody therapeutics. Nat Rev Immunol. 25, 745-765 (2025).
  5. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  6. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  7. Jungmann, R., et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).
  8. Tobin, S. J., et al. Single molecule localization microscopy coupled with touch preparation for the quantification of trastuzumab-bound HER2. Sci Rep. 8 (1), 15154(2018).
  9. Wakefield, D. L., et al. Using quantitative single molecule localization microscopy to optimize multivalent HER2-targeting ligands. Front Med. 10, 1064242(2023).
  10. Ghosh, A., et al. Decoding the molecular interplay of CD20 and therapeutic antibodies with fast volumetric nanoscopy. Science. 387 (6730), eadq4510(2025).
  11. Lillemeier, B. F., et al. TCR and Lat are expressed on separate protein islands on T cell membranes and concatenate during activation. Nat Immunol. 11 (1), 90-96 (2010).
  12. Hu, Y. S., Cang, H., Lillemeier, B. F. Superresolution imaging reveals nanometer- and micrometer-scale spatial distributions of T-cell receptors in lymph nodes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (26), 7201-7206 (2016).
  13. Rossboth, B., et al. TCRs are randomly distributed on the plasma membrane of resting antigen-experienced T cells. Nat Immunol. 19 (8), 821-827 (2018).
  14. Civita, S., et al. Nanoscale engagement of programmed death ligand 1 (PD-L1) in membrane lipid raft domains of cancer cells. FEBS J. 292 (22), 5979-5997 (2025).
  15. Lee, J., Sengupta, P., Brzostowski, J., Lippincott-Schwartz, J., Pierce, S. K. The nanoscale spatial organization of B-cell receptors on immunoglobulin M- and G-expressing human B-cells. Mol Biol Cell. 28 (4), 511(2017).
  16. Ferapontov, A., et al. Antigen footprint governs activation of the B cell receptor. Nat Commun. 14 (1), 976(2023).
  17. Mattila, P. K., et al. The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling. Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).
  18. Nerreter, T., et al. Super-resolution microscopy reveals ultra-low CD19 expression on myeloma cells that triggers elimination by CD19 CAR-T. Nat Commun. 10 (1), 3137(2019).
  19. Slaga, D., et al. Avidity-based binding to HER2 results in selective killing of HER2-overexpressing cells by anti-HER2/CD3. Sci Transl Med. 10 (463), eaat5775(2018).
  20. Haber, L., et al. Generation of T-cell-redirecting bispecific antibodies with differentiated profiles of cytokine release and biodistribution by CD3 affinity tuning. Sci Rep. 11 (1), 14397(2021).
  21. Abdelmotaleb, O., Schneider, A., Gassner, C., Märsch, S., Klein, C. The impact of CD3 affinity-attenuation on T cell engaging bispecific antibodies: is it really that simple. Expert Opin Drug Discov. 20 (8), 943-949 (2025).
  22. Dang, K., et al. Attenuating CD3 affinity in a PSMAxCD3 bispecific antibody enables killing of prostate tumor cells with reduced cytokine release. J Immunother Cancer. 9 (6), e002488(2021).
  23. Gunasekara, H., et al. Superresolution Imaging with Single-Antibody Labeling. Bioconjugate Chem. 34 (5), 825-833 (2023).
  24. Perera, T., Gunasekara, H., Hu, Y. S. Single-Molecule Localization Microscopy Using Time-Lapse Imaging of Single-Antibody Labeling. Curr Protoc. 3 (10), e908(2023).
  25. Küppers, R. CD81 as target for B cell lymphomas. J Exp Med. 216 (7), 1469-1470 (2019).
  26. Vences-Catalán, F., et al. CD81 is a novel immunotherapeutic target for B cell lymphoma. J Exp Med. 216 (7), 1497-1508 (2019).
  27. Vences-Catalán, F., et al. Targeting the tetraspanin CD81 reduces cancer invasion and metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (24), e2018961118(2021).
  28. Bailly, C., Thuru, X. Targeting of Tetraspanin CD81 with Monoclonal Antibodies and Small Molecules to Combat Cancers and Viral Diseases. Cancers. 15 (7), 2186(2023).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  31. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. Image analysis for single-molecule localization microscopy. In: Super-Resolution Imaging in Biomedicine. , 79-94 (2016).
  32. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  33. Stallinga, S., Rieger, B. Accuracy of the Gaussian point spread function model in 2D localization microscopy. Opt Express. 18 (24), 24461-24476 (2010).
  34. Huang, F., Schwartz, S. L., Byars, J. M., Lidke, K. A. Simultaneous multiple-emitter fitting for single molecule super-resolution imaging. Biomed Opt Express. 2 (5), 1377-1393 (2011).
  35. Smith, C. S., Joseph, N., Rieger, B., Lidke, K. A. Fast, single-molecule localization that achieves theoretically minimum uncertainty. Nat Methods. 7 (5), 373-375 (2010).
  36. Chatterjee, T., et al. Direct Kinetic Fingerprinting and Digital Counting of Single Protein Molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (37), 22815-22822 (2020).
  37. A density-based algorithm for discovering clusters in large spatial databases with noise. Ester, M., Kriegel, H. P., Sander, J., Xu, X. Int Conf Knowledge Disc Data Mining, 240, 226-231 (1996).
  38. Termini, C. M., Gillette, J. M. Tetraspanins Function as Regulators of Cellular Signaling. Front Cell Dev Biol. 5, 242379(2017).
  39. Levy, S., Shoham, T. Protein-protein interactions in the tetraspanin web. Physiology. 20, 218-224 (2005).
  40. Rubinstein, E., et al. CD9, CD63, CD81, and CD82 are components of a surface tetraspan network connected to HLA-DR and VLA integrins. Eur J Immunol. 26 (11), 2657-2665 (1996).
  41. Schmidt, S. C., Massenberg, A., Homsi, Y., Sons, D., Lang, T. Microscopic clusters feature the composition of biochemical tetraspanin-assemblies and constitute building-blocks of tetraspanin enriched domains. Sci Rep. 14 (1), 2093(2024).
  42. Zuidscherwoude, M., et al. The tetraspanin web revisited by super-resolution microscopy. Sci Rep. 5, 12201(2015).
  43. Comparative performance analysis of K-means and DBSCAN clustering algorithms on various platforms. Shahriar, N., Akib Al Faisal, S. M., Pinjor, M. M., Sharif Zobayer Rafi, M. A., Rahman Sarkar, A. Proceedings of the 22nd International Conference on Computer and Information Technology (ICCIT), , 1-6 (2019).
  44. Hahsler, M., Piekenbrock, M., Doran, D. dbscan: Fast Density-Based Clustering with R. J Stat Softw. 91 (1), 1-30 (2019).
  45. Pedregosa, F., et al. Machine Learning with PyTorch and Scikit-Learn: Develop machine learning and deep learning models with Python. J Mach Learn Res. 12, 2825-2830 (2011).
  46. Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Non-specific binding of antibodies in immunohistochemistry: fallacies and facts. Sci Rep. 1, 28(2011).
  47. Bond, C., Santiago-Ruiz, A. N., Tang, Q., Lakadamyali, M. Technological advances in super-resolution microscopy to study cellular processes. Mol Cell. 82 (2), 315-332 (2022).
  48. Garcia-Parajo, M. F., Cambi, A., Torreno-Pina, J. A., Thompson, N., Jacobson, K. Nanoclustering as a dominant feature of plasma membrane organization. J Cell Sci. 127 (23), 4995-5005 (2014).
  49. Tan, H. L., Bungert-Plümke, S., Kortzak, D., Fahlke, C., Stölting, G. Determination of oligomeric states of proteins via dual-color colocalization with single molecule localization microscopy. eLife. 11, e76631(2022).
  50. Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).
  51. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  52. Shivanandan, A., Deschout, H., Scarselli, M., Radenovic, A. Challenges in quantitative single molecule localization microscopy. FEBS Lett. 588 (19), 3595-3602 (2014).
  53. Endesfelder, U., Heilemann, M. Art and artifacts in single-molecule localization microscopy: beyond attractive images. Nat Methods. 11 (3), 235-238 (2014).
  54. Lambert, T. J., Waters, J. C. Navigating challenges in the application of superresolution microscopy. J Cell Biol. 216 (1), 53-63 (2017).
  55. Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Quantitative photo activated localization microscopy: unraveling the effects of photoblinking. PloS One. 6 (7), e22678(2011).
  56. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nat Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  57. Unterauer, E. M., Jungmann, R. Quantitative Imaging With DNA-PAINT for Applications in Synaptic Neuroscience. Front Synaptic Neurosci. 13, 798267(2021).
  58. Stein, J., Stehr, F., Jungmann, R., Schwille, P. Calibration-free counting of low molecular copy numbers in single DNA-PAINT localization clusters. Biophys Rep. 1 (2), 100032(2021).
  59. Youn, Y., et al. Quantitative DNA-PAINT imaging of AMPA receptors in live neurons. Cell Rep Methods. 3 (2), 100408(2023).
  60. Yin, H., Flynn, A. D. Drugging Membrane Protein Interactions. Annu Rev Biomed Eng. 18, 51-76 (2016).
  61. Jin, S., et al. Emerging new therapeutic antibody derivatives for cancer treatment. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 39(2022).
  62. To'a Salazar, G., Huang, Z., Zhang, N., Zhang, X. -G., An, Z. Antibody therapies targeting complex membrane proteins. Engineering. 7 (11), 1541-1551 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Плазматическая мембранамикроскопия сверхвысокого разрешениябелок CD81кластеризация на основе плотностисвязывание антителкоррекция дрифтатерапевтические антитела
Микроскопия локализации мембранных белков с использованием одномолекулярной метки
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.