Микроскопия локализации мембранных белков с использованием одномолекулярной метки

Summary

Этот протокол описывает маркировку одного антитела (SAL) для разрешения наномасштабной пространственной организации белков плазматической мембраны. Используя кумулятивные взаимодействия антитела и эпитопов на уровне одной молекулы, мембранный SAL (mSAL) картирует локальное распределение эпитопов, одновременно фиксируя поведение связывания антител в родной клеточной среде.

Abstract

Плазматическая мембрана определяет форму клетки и служит интерфейсом, управляющим межклеточной коммуникацией. Мембранные белки составляют основной класс терапевтических мишеней; Поэтому суперразрешение клеточной мембраны через её составляющие белки имеет большие перспективы для развития клеточной биологии и терапии антител. В этом отношении микроскопия локализации одной молекулы (SMLM) позволяет наномасштабно визуализировать структуры белков на биологических структурах. Несмотря на свою важность, применение SMLM к белкам плазматических мембран создаёт уникальные задачи. В этом протоколе мы представляем эффективный подход с использованием таймлапс-метки одиночных антител (SAL), называемого мембранным SAL (mSAL). Мы предоставляем подробные пошаговые инструкции, включая оптимизацию концентрации антител, плотности мощности лазера, длительности интервалов без освещения, реконструкцию изображений и анализ кластеров на основе плотности для определения распределения белков мембран в наномасштабе и морфологии мембраны. Мы используем белок тетраспанина CD81 в качестве модельного мембранного белка для демонстрации способности mSAL как на адгерентных, так и на суспензионных клетках млекопитающих. Помимо суперразрешения клеточной мембраны и распределения мембранных белков, наша техника позволяет исследовать фармакодинамику терапевтических антител, взаимодействующих с мембранными мишеньями в естественной мембранной среде.

Introduction

Плазматическая мембрана содержит разнообразные белки, регулирующие подвижность клеток, адгезию, сенсорность и межклеточные коммуникации. Понимание наномасштабного распределения белков плазматических мембран важно, поскольку функция белка часто определяется не только уровнем экспрессии, но и их пространственной организацией на^{мембране 1,2}. Примечательно, что многие терапевтические антитела нацелены на мембранные^{белки 3,4}, что делает наномасштабные исследования необходимыми для понимания того, как взаимодействия антител ....

Protocol

Этот протокол использует устоявшиеся линии Jurkat E6.1 и U2OS и не включает первичные человеческие или живые животные материалы.

1. Посев/посадка и фиксация клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка образца следует стандартным протоколам окрашивания по иммунофлуоресценции (IF), оптимизированным для сохранения субклеточной организации белков плазматической мембраны между различными типами клеток. Если существует установленный протокол иммунокрашивания для интересующего объекта, пользователи могут следовать этому протоколу до этапа блокировки образца 1.2.14. Маркировка одиночных антител (SAL) ос....

Results

Технология mSAL, описанная в этом протоколе, позволяет визуализировать отдельные события связывания антител с соответствующими белковыми мишеньями плазматической мембраны, создавая суперразрешённую карту распределения белков мембраны. Здесь используется CD81 в качестве репрезентативного примера, хотя этот подход легко адаптируется к другим мембранным белкам.

Иммобилизация Т-клеток Jurkat с достаточным расстоянием между клетками обеспечивает доступ к мембранном.......

Discussion

Организация белков плазматической мембраны играет жизненно важную роль в регулировании функции клетки. Традиционные методы флуоресцентной микроскопии ограничены пределом дифракции света, что скрывает их наномасштабную организацию. SMLM преодолевает это ограничение, достигая пространственного разрешения 10-20^{нм 47}, что позволяет характеризуть свои наномасштабные^{сборки 10, 48, 49.......}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
антитела против CD81 Alexa Fluor 488	Термо Фишер Сайентифик	MA5-44132	Антитела для визуализации
Настольная центрифуга	Эппендорф	5424
Бычий сывороточный альбумин	MilliporeSigma	A7906-100G
Камерное крышное стекло, 8-колодец	Cellvis	C8-1-N
Медиа DMEM	Термо Фишер Сайентифик	11960069
Физиологический раствор с буфером фосфатов Dulbecco	Термо Фишер Сайентифик	14190-144
Сыворотка плода крупного рогатого скота	MilliporeSigma	F0926-500ML
Глутаральдегид, 10 %	Науки об электронной микроскопии	16120
Золотые коллоиды, 100 нм	Тед Пелла	15711 и минус; 20	Фидуциальный маркер
Погружное масло и bbsp;	Лаборатории Каржиль	16245
Инвертированный микроскоп и bbsp; оснащённый модулем TIRF	Nikon Instruments	Eclipse Ti2-E	Микроскоп
Ячейковая линия Jurkat E6.1	MilliporeSigma	88042803-1VL	Подвесные ячейки
Лазерный запуск, 6 строк	Оксиус	L6CC-CS8-1511	Возбуждающий лазер
Липофектамин 2000	Термо Фишер Сайентифик	11668019	Трансфекционный реагент
Микроцентрифугная трубка, 1,5 мл	VWR	89000-028
Программное обеспечение для микроскопической визуализации	Nikon Instruments	Передовые исследования NIS-Elements	Программное обеспечение для обработки изображений
Цель: 100x/1.49 CFI APO TIRF	Nikon Instruments	MRD01991	Объектив микроскопа
Параформальдегид, 16 %	Науки об электронной микроскопии	15710
Пенициллин-стрептомицин	Термо Фишер Сайентифик	15140-122	Антибиотики
Раствор поли-L-лизина, 0,01%	MilliporeSigma	P4707-50ML
Камера prime 95B sCMOS	Решения Teledyne Vision	01-PRIME-95B-R-M-16-C	Камера
Медиа RPMI 1640	Термо Фишер Сайентифик	11875-093	Среда для подвесных ячеек
Натрий-азид	Термо Фишер Сайентифик	19038-1000
Боргидрид натрия	MilliporeSigma	213462-25G
Фляжки для культуры T25	Термо Фишер Сайентифик	169900
Микросферы TetraSpeck			Фидуциальный маркер
Контейнер для культуры тканей, 100 mm	Корнинг	353003
Ячеточная линия U2OS	ATCC	HTB-96	Адгерентные ячейки