Фитохимическое профилирование, газовая хроматография–масс-спектрометрический анализ и активность in vivo терминалии манталии у крыс

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол, который интегрирует фитохимический анализ, газовую хроматографию и масс-спектрометрию, а также валидированные in vivo тесты для оценки противовоспалительной и анальгетической и антипиретической активности Terminalia mantaly, предоставляя воспроизводимую основу для фармакологической оценки лекарственных растений.

Аннотация

Синтетические препараты для лечения воспаления, боли и лихорадки эффективны, но часто вызывают побочные эффекты, что увеличивает интерес к растительным терапевтическим альтернативам. Terminalia mantaly H. Perrier, традиционно используемая в африканской медицине, имеет ограниченное научное подтверждение. В данном исследовании представлен интегрированный экспериментальный протокол, объединяющий фитохимический скрининг, количественный анализ фенольных и флавоноидных соединений, характеристику газовой хроматографии и масс-спектрометрии (GC-MS) и фармакологические испытания in vivo для оценки терапевтического потенциала метанольного экстракта T. mantaly. Фитохимический скрининг подтвердил наличие нескольких биоактивных классов, а анализ GC–MS выявил двадцать компонентов, включая жирные кислоты, фитостеролы, токоферолы и другие биоактивные соединения с известными противовоспалительными и антиоксидантными свойствами. Фармакологическое исследование in vivo у крыс показало дозозависимую противовоспалительную активность в модели отёка лап, вызванной каррагинаном, значительное удлинение задержки боли и отмены в тесте погружения хвоста и снижение дрожжевой пирексии. При высоких дозах экстракт показывал эффекты, сопоставимые со стандартными препаратами, такими как диклофенак и парацетамол. Острые оценки токсичности и цитотоксичности показали благоприятный профиль безопасности в пределах тестируемого диапазона доз. Вместе эти результаты подтверждают этномедицинское применение T. mantaly и демонстрируют воспроизводимую экспериментальную основу для связи фитохимического состава с фармакологической активностью. Протокол служит практическим методологическим ориентиром для исследователей, изучающих лекарственные растения, и поддерживает разработку веществ растительного происхождения для управления воспалительной и лихорадкой.

Введение

Воспаление, боль и лихорадка — взаимосвязанные патологические процессы, лежащие в основе широкого спектра острых и хронических заболеваний. Хотя синтетические препараты, такие как нестероидные противовоспалительные средства, кортикостероиды и парацетамол, остаются основой терапии, их длительное применение часто связано с раздражением желудочно-кишечного тракта, почечными осложнениями, гепатотоксичностью и другими побочными^{эффектами.} Эти ограничения вызвали растущий интерес к лекарственным растениям как к более безопасным и устойчивым альтернативам для управления воспалительной и лихорадкой. Натуральные продукты хорошо известны своим богатым разнообразием биоактивных молекул, многие из которых служат основой для современной разработки лекарств. В этом контексте T. mantaly, представитель семейства Combretaceae, привлекла внимание своим этномедицинским применением в традиционных африканских системах для лечения инфекций, желудочно-кишечных заболеваний и воспалительных^{расстройств 2,3}. Несмотря на традиционную актуальность, систематические фармакологические исследования, подтверждающие его терапевтический потенциал, остаются ограниченными. В частности, существует дефицит комплексных исследований, интегрирующих фитохимический скрининг, биологические оценки in vivo и передовые методы химического профилирования, такие как GC–MS. Устранение этого пробела крайне важно для научного обоснования его фольклорных применений и выявления потенциальных свинцовых соединений для^{фармацевтического применения 4}. В настоящем исследовании метанольный экстракт T. mantaly подвергся детальной фитохимической и фармакологической оценке. Предварительный анализ подтвердил наличие ключевых метаболитов, включая фенолики, флавоноиды, танины, сапонины и терпеноиды, все из которых известны своей способностью противовоспалительного, обезболивающего и антиоксидантного^{эффекта 5}. Количественные анализы также показали, что экстракт содержит значительные уровни фенольных и флавоноидных соединений, со значениями, сопоставимыми с эталонными стандартами, что указывает на высокий антиоксидантный потенциал.

Использовались модели на животных, поскольку оцениваемые фармакологические реакции включают интегрированные воспалительные и нейронные и терморегуляционные пути, которые невозможно воспроизвести in vitro. Тесты in vivo предоставили чёткие фармакологические доказательства биоактивности. Противовоспалительные свойства (отёк лап, вызванный каррагинаном), обезболивающие (погружение хвоста) и антипиретические (пирексия, вызванная дрожжами) свойства были протестированы у крыс, демонстрируя дозозависимую противовоспалительные свойства, аналогичную диклофенаку натрия при высоких дозах. Аналогично, экстракт усилил задержку погружения в хвост у крыс, подтвердив его обезболивающую эффективность, а модели пирексии, вызванные дрожжами, показали выраженные антипиретические эффекты, близкие к^{парацетамолу 6}. Химическое профилирование с помощью анализа GC–MS дало более глубокое понимание его биоактивного состава. Было выявлено всего 20 соединений, включая 3,5-дигидрокси-6-метил-2,3-дигидро-4H-пиран-4-он, линолеевую кислоту, γ-ситостерол, сквален и витамин E. Эти соединения хорошо задокументированы своими антиоксидантными, противовоспалительными и кардиопротективными свойствами, что подтверждает наблюдаемые фармакологические^{результаты 7,8}. Важно, что оценки токсичности выявили незначительное цитотоксичное воздействие, что подчёркивает его безопасность при тестируемых дозах. В совокупности это исследование устраняет критический пробел, предоставляя как фитохимические, так и фармакологические доказательства медицинской ценности T. mantaly. Результаты не только подтверждают его традиционное применение, но и подчёркивают его потенциал как естественного источника свинцовых соединений для разработки новых методов лечения воспаления и связанных с ними заболеваний. Экспериментальные модели, использованные в этом исследовании, в основном отражают острые воспалительные и ноцицептивные реакции и, следовательно, предоставляют предварительные фармакологические доказательства, а не прямое свидетельство хронической терапевтической эффективности.

Протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с международными рекомендациями по уходу и использованию лабораторных животных и соответствовали рекомендациям ОЭСР. Протокол исследования был утверждён Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Университета Бахауддина Закария, Мултан. (Одобрение No 3 /UREC/2025). Были предприняты все усилия для минимизации страданий животных и сокращения количества используемых животных.

1. Приготовление цельного метанолового экстракта T. mantaly (TMWM)

1. Соберите свежие стебли, корни и листья T. mantaly, подтвердите растительный материал и поместите ваучерный образец в признанный гербарий.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Растительный материал, использованный в этом исследовании, был собран в питомнике Punjab Nursery, Mattital Road, Мултан, 12 ноября 2023 года. Географические координаты участка сбора: 30.2236° с.ш., 71.4755° в.д. Растение было таксономически утвертифицировано таксономистом проф. Зафар Улла Зафар, профессор ботаники Университета Бахауддина Закария, Мултан, и образец ваучера (www.theplantlist.org/tpl1.1/record/kew-2434420) был помещён в гербарий Университета Бахауддина Закария в Мултане. Растение было собрано в естественной среде обитания при соответствующих условиях, а место сбора было задокументировано фотографиями.
2. Промыйте растительный материал водопроводной водой, затем дистиллированной водой для удаления загрязнений, затем сушите в тени при 25–30 °C в течение 7–10 дней, пока не достигнут стабильный вес.
3. Измельчите высушенный материал до крупного порошка и взвешивайте 500 г с помощью аналитических весов. Переложите порошок в чистую стеклянную ёмкость и добавьте 2,5 л метанола.
4. Макерируйте смесь при комнатной температуре в течение 72 часов с периодическим встряхиванием каждые 6–8 часов. Фильтруйте через фильтрующую бумагу Whatman No.1.
5. Концентрируйте фильтрат под пониженным давлением с помощью вращательного испарителя при 39 °C, затем храните высушенный экстракт в герметичных ёмкостях при комнатной температуре до использования.
   ВНИМАНИЕ: Метанол токсичен и горючий. Ведите себя в капюшоне с паром, надевая перчатки и защитные очки. Утилизировать отходы растворителей в соответствии с институциональными рекомендациями по химической безопасности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Высушенный экстракт можно хранить в герметичных контейнерах при комнатной температуре несколько недель перед дальнейшим анализом.

2. Оценка общего содержания фенолов (метод Фолина–Чиокальтеу)

1. Приготовьте раствор галловой кислоты (100 мкг/мл), растворив 10 мг галловой кислоты в 100 мл метанола, и подготовьте серийные разбавления в диапазоне от 1 до 10 мкг/мл.
2. Растворите экстракт 10 мг в 10 мл метанола для получения раствора 1 мг/мл. Перенесите 0,5 мл каждого стандарта или образца в пробирки.
3. Добавьте 2,5 мл реагента Фолин–Чиокальтеу, разбавленных 1:1 водой, затем добавьте 2,0 мл раствора карбоната натрия 7,5%. Перемешайте и инкубуйте при 25 ± 2 °C в течение 30 минут.
4. Измерьте абсорбцию на 765 нм относительно заготовки реагента и рассчитайте общее содержание фенолов в эквиваленте галловой кислоты мг на один г экстракта.

3. Оценка общего содержания флавоноидов (метод хлорида алюминия)

1. Приготовьте раствор рутина (1000 мкг/мл), растворив рутин в метаноле, затем подготовьте последовательные разведения в диапазоне 10–80 мкг/мл.
2. Переливайте 0,5 мл стандартного или экстрактного раствора в пробирки и добавляйте 1,5 мл метанола, 0,1 мл раствора 10% хлорида алюминия (AlCl₃), 0,1 мл раствора ацетата калия объемом 1 м и 2,8 мл дистиллированной воды.
3. Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут и измерить поглощение на 415 нм. Экспресс результаты в виде эквивалентов мг рутина на г^{экстракта 9}.

4. Анализ в области газовой хроматографии и масс-спектрометрии (GC–MS)

1. Растворите экстракт 10 мг в метаноле HPLC-класса 1 мл и фильтруйте через шприцовый фильтр 0,22 мкм в флакон GC.
2. Проводите анализ с помощью Agilent 7890B GC в сочетании с 5977A MS с капиллярной колонной HP-5MS (30 м × 0,25 мм × 0,25 мкм). Используйте гелий в качестве носителя при 1,0 мл/мин при температуре форсунки 250 °C.
3. Поддерживайте температуру ионного источника на уровне 230 °C и температуру квадруполя при 150 °C. Запрограммируйте духовку с 60 °C (2 минуты задержки) до 180 °C при 10 °C/мин, а затем до 280 °C при 5 °C/мин с последним задержкой 10 минут.
4. Вводите 1 мкл фильтрованного экстракта в разделённом режиме (10:1) и записывайте хроматограммы в диапазоне от 40 до 600 мг. Перед инъекцией образца пропустите заготовку растворителя.
5. Идентифицировать соединения, сравнивая спектры с масс-спектральной библиотекой NIST, и подтверждать идентичность с помощью времени удержания и нормализации пиковой области.

5. Противовоспалительная активность (отёк лап, вызванный каррагинаном)

1. Используйте здоровых крыс Albino Wistar весом 180–220 г и акклиматизируйтесь в течение 7 дней. Быстрые животные на ночь перед экспериментом с бесплатным доступом к воде.
2. Случайным образом разделите животных на пять групп (n = 5 на группу). Вводите обычный физиологический раствор в органы контроля; перорально вводить 100, 200 и 300 мг/кг группам лечения; и вводят диклофенак натрия (40 мг/кг, подкожно) стандартной группе.
3. Через 1 час введите 0,1 мл свежеприготовленного 1% каррагинана в подподплантарную область правой задней лапы.
4. Измерьте толщину лапы на 0, 1, 2, 3 и 4 часа с помощью цифрового верньерного суппорта и рассчитайте увеличение относительно базовой линии.
5. Определите процент ингибирования отёка по сравнению с контрольной^{группой 10}.
   ВНИМАНИЕ: Порошок каррагинана может вызвать раздражение. Избегайте вдыхания и контакта с кожей, а также утилизируйте биологические отходы в соответствии с институциональными процедурами биобезопасности.

6. Обезболивающая активность (тест на погружение хвоста)

1. Используйте акклиматизированных крыс Albino Wistar, поддерживаемых в 12-часовом цикле свет/темнота с свободным доступом к корму и воде.
2. Разделим животных на пять групп (n = 5). Вводите дистиллированную воду контрольным группам, экстракцируйте перорально в концентрациях 100, 200 и 300 мг/кг в группы, а парацетамол (20 мг/кг) в стандартную группу.
3. Поддерживайте водяную ванну при температуре 55 ± 1 °C. Погрузите 1–2 см дистального хвоста и зафиксируйте базовую задержку отъёма с ограничением в 15 секунд.
4. Повторяйте измерения через 30, 60, 90 и 120 минут после обработки, гарантируя, что одна и та же часть хвоста погружается каждый раз.
5. Вычислите процент увеличения задержки и выявите результаты как среднее ± SD.

7. Антипиретическая активность

1. Используйте акклиматизированных крыс и фиксируйте нормальную ректальную температуру с помощью смазанного цифрового термометра.
2. Приготовьте 20% суспензию из пивоварных дрожжей в дистиллированной воде и введите подкожно с концентрацией 10 мл/кг в спинку, чтобы вызвать пирексию.
3. Через 18 часов снова измерьте ректальную температуру и исключите животных, у которых не наблюдается как минимум 0,5 °C.
4. Случайным образом разделите лихорадочных крыс на пять групп (n = 5 на группу). Вводите нормальный физиологический раствор в контрольную группу, растительный экстракт перорально в дозах 100, 200 и 300 мг/кг в группы, а также парацетамол (150 мг/кг) в стандартную группу.
5. Измерьте ректальную температуру на 0, 1, 2 и 3 часа после обработки и рассчитайте снижение относительно исходной^{линии 11}.
   ВНИМАНИЕ: Дрожжевые суспензии Brewer's — это биологические материалы, и с ними следует обращаться с соблюдением стандартных мер биобезопасности. Утилизировать неиспользованную суспензию и загрязнённые материалы в качестве биологических отходов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После инъекции дрожжей животных могут возвращать в клетки и содержать в стандартных условиях до измерения температуры.

8. Исследования острой токсичности

1. Проведите исследование в соответствии с рекомендациями 423 Организации экономического сотрудничества и развития (ОЭСР), используя здоровых альбиносов Вистар любого пола весом от 180 до 220 г.
2. Быстрые животные на ночь перед дозировкой и случайным образом делят их на группы (n = 5 на группу).
3. Введите одну пероральную дозу 5 г/кг массы экстракта обработанным животным и дистиллированную воду (1 мл/кг) контрольным животным.
4. Наблюдайте за животными непрерывно первые 4 часа после приема, периодически в первые 24 часа и ежедневно в течение 14 дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Критерии наблюдения включают изменения состояния кожи и шерсти, глаз и слизистых оболочек, дыхательные системы, слюноотделение, тремор, судороги, локомоторную активность и общие поведенческие реакции.
5. Зафиксируйте клинические признаки токсичности, смертности и массы тела на 0, 7-й и 14-й день.
6. Оценивайте безопасность на основе показателя выживаемости и наблюдаемых поведенческих или физических^{изменений 12}.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поведенческая оценка включает мониторинг осанки, походки, уровня активности, поведения при уходе, реакции на внешние раздражители и признаков вялости или гиперактивности.

9. Статистический анализ

1. Собрать все экспериментальные данные и представить их как среднее ± стандартное отклонение с n = 5 животных на группу.
2. Введите данные в программное обеспечение GraphPad Prism в виде столбцов.
3. Оцените нормальность данных с помощью теста Шапиро–Уилка перед применением сравнительного анализа.
4. Проведите статистический анализ с помощью программного обеспечения GraphPad Prism, выбрав: Анализировать → односторонний ANOVA → множественные сравнения Tukey.
5. Проведите односторонний анализ дисперсии, а затем пост-хок многократный тест Тьюки для определения статистической значимости между группами.
6. Рассмотрим различия статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты

Экспериментальные подходы, описанные в этом исследовании, дали воспроизводимые данные in vitro и in vivo, позволившие оценить как фитохимический состав, так и фармакологическую активность метанольного экстракта T. mantaly. Все экспериментальные измерения проводились в репликах, а результаты представлены как среднее ± стандартное отклонение (SD). Статистическая значимость между группами определялась с помощью одностороннего ANOVA, за которым следовал пост-хок тест Тьюки, при этом p < 0,05 считался значимым.

Обсуждение

В этом исследовании была использована комбинация фитохимической характеристики и установленных in vivo фармакологических моделей для оценки противовоспалительного, обезболивающего и антипиретического потенциала метанольового экстракта T. mantaly. Используемые экспериментальные модели широко применяются в исследованиях природных продуктов и предоставляют практическую основу для предварительной оценки биологической активности.

Воспроизводимые времена уд...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Альбиносы-крысы Вистар	Институциональный дом для животных	Н/Д	Экспериментальные животные
Хлорид алюминия	Сигма-Олдрич	237051	Флавоноидный анализ
Брюэр» Дрожжи	Сигма-Олдрич	YSC2	Индукция пирексии
Каррагинан	Сигма-Олдрич	C1013	Индукция отёка лап
Центрифуга	Эппендорф	5810R	Обработка образцов
Диклофенак натрий	Сигма-Олдрич	D6899	Противовоспалительный стандарт
Цифровой ректальный термометр	Омрон	MC-246	Измерение ректальной температуры
Цифровой верньерный суппорт	Митутойо	500-196-30	Измерение толщины лапы
Дистиллированная вода	Внутри компании	Н/Д	Растворитель
Folin– Реагент Ciocalteu	Сигма-Олдрич	F9252	Фенольный анализ
Галловая кислота	Сигма-Олдрич	G7384	Фенольный стандарт
Система GC–MS	Agilent Technologies	7890B– 5977A	Фитохимическое профилирование
GraphPad Prism	Программное обеспечение GraphPad	Версия 8.0	Программное обеспечение для статистического анализа
Метанол (класс ВЭЖХ)	Merck	106009	Растворитель для экстракции
Оральная игла для гаважа	Instech	FTP-20-38	Оральное введение
Парацетамол	Сигма-Олдрич	P0300000	Анальгетический и антипиретический стандарт
Ацетат калия	Merck	104820	Флавоноидный анализ
Роторный испаритель	Bü Чи	Р-200	Концентрация экстракта
Рутин	Сигма-Олдрич	R5143	Флавоноидный стандарт
Карбонат натрия	Merck	106392	Фенольный анализ
UV– Видимый спектрофотометр	Симадзу	UV-1800	Измерение поглощения
Водяная баня (термостатская)	Меммерт	WNB14	Тест погружения хвоста