Анализы клональности с использованием секвенирования следующего поколения: клиническая валидация для мониторинга минимальной остаточной болезни при множественной миеломе

Краткое содержание

В данном исследовании оценивался новый метод анализа клональности BCR/TCR на основе NGS (OriMIRACLE LTM) для детекции МРБ при лимфоидных злокачественных новообразованиях, включая множественную миелому (ММ). При использовании клеточных линий и клинических мазков была продемонстрирована частота обнаружения >90% и конкордантность с проточной цитометрией на уровне 81,36%. Данный анализ обладает высокой чувствительностью, позволяет прогнозировать рецидивы и обосновывать решения по тактике лечения.

Аннотация

Обнаружение минимальной остаточной болезни (МОБ) имеет решающее значение для ведения пациентов с лимфоидными злокачественными новообразованиями. В данном исследовании представлен OriMIRACLE LTM — новый метод анализа клональности B-клеточных рецепторов (BCR) и T-клеточных рецепторов (TCR) на основе секвенирования следующего поколения (NGS) для детекции МОБ. Мы валидировали данный анализ, используя клеточные линии и клинические образцы, включая остаточные мазки пациентов с множественной миеломой (ММ). Анализ клональности BCR/TCR продемонстрировал частоту положительного обнаружения более 90% при лимфоидных злокачественных новообразованиях. Исследования по валидации у пациентов с ММ показали уровень согласованности 81,36% (48/59) между многоцветной проточной цитометрией (MFC) и клинической оценкой ответа при выявлении опухолевых клеток. Примечательно, что 61,11% (11/18) пациентов с ММ, у которых МОБ была обнаружена как методом NGS, так и методом MFC, перенесли прогрессирование заболевания или рецидив. У пациентов, у которых МОБ была обнаружена только с помощью NGS, наблюдались более низкие показатели полного клинического ответа, а некоторые пациенты с ММ, изначально ответившие на терапию, перенесли рецидив после прекращения лечения. Эти результаты указывают на то, что данный анализ на основе NGS обеспечивает высокочувствительную и специфичную детекцию МОБ при лимфоидных злокачественных новообразованиях, в том числе в образцах остаточных мазков, полученных от пациентов с ММ. Он демонстрирует преимущества перед MFC и оказывается ценным для мониторинга МОБ. В заключение, имеющиеся данные подтверждают, что NGS является дополнительным инструментом к MFC, особенно у пациентов с результатами MFC⁻/NGS⁺, поскольку NGS обеспечивает более глубокую стратификацию рисков. Однако оптимальный порог для терапевтического вмешательства должен быть определен в ходе проспективных исследований.

Введение

Множественная миелома (ММ) представляет собой гематологическое злокачественное новообразование, характеризующееся пролиферацией аберрантных клональных плазматических клеток в костном мозге¹. В Китае в 2022 году было зарегистрировано приблизительно 22 450 новых случаев диагностики ММ и 17 360 соответствующих летальных исходов². Несмотря на значительные успехи в лечении ММ за последнее десятилетие, которые существенно увеличили медиану выживаемости пациентов, большинство из них в конечном итоге сталкиваются с рецидивом^3,4. Столь резкий рост подчеркивает критическую необходимость в точном мониторинге ремиссии, раннем прогнозировании рецидива и своевременном терапевтическом вмешательстве.

Клинические данные убедительно подтвердили прогностическую значимость статуса минимальной остаточной болезни (МОБ) при гематологических злокачественных новообразованиях^5,6,7. Признавая эту важность, Международная рабочая группа по миеломе (IMWG) в 2016 году включила оценку МОБ в критерии оценки ответа на терапию⁸. Современные методы оценки МОБ в костном мозге включают аллель-специфичную олигонуклеотидную полимеразную цепную реакцию (ASO-PCR), цифровую ПЦР (dPCR), многопараметрическую проточную цитометрию (MFC) и методы секвенирования следующего поколения (NGS)⁸. Хотя ASO-PCR обеспечивает высокую чувствительность детекции, этот метод требует много времени и трудно поддается стандартизации из-за необходимости использования праймеров, специфичных для каждого пациента^9,10. Аналогичным образом, применение dPCR ограничено ее аллель-специфичным дизайном^10,11. MFC играет важную роль в выявлении МОБ¹², предоставляя быструю информацию на клеточном уровне, однако этот метод сталкивается с проблемами стандартизации и воспроизводимости.

NGS представляет собой воспроизводимый, высокочувствительный подход, который устраняет необходимость в использовании праймеров, специфичных для конкретного пациента. Он позволяет надежно идентифицировать и количественно определять уникальные перестройки иммуноглобулинов при гематологических злокачественных новообразованиях¹³. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) одобрило систему ClonoSEQ компании Adaptive Biotechnologies для тестирования на МРБ у пациентов с острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), ММ и хроническим лимфоцитарным лейкозом (ХЛЛ)^14,15,16. Многие международные клинические рекомендации в настоящее время включают NGS в качестве рекомендуемого метода мониторинга МРБ. Китайские рекомендации по диагностике и лечению ММ (в редакции 2020 г.) также поддерживают оценку МРБ у пациентов с ММ с использованием таких методов, как проточная цитометрия следующего поколения (NGF) и NGS¹⁷.

По имеющимся у нас данным, технология NGS не является предпочтительным методом выявления MRD при лимфоидных злокачественных новообразованиях в клинической практике из-за ограничений по стоимости и времени. В случае отрицательных результатов MFC часто требуется дополнительная аспирация костного мозга для обнаружения MRD. Эта дополнительная процедура может создавать значительную физическую и психологическую нагрузку на пациентов, что потенциально ограничивает её широкое клиническое применение.

В данном исследовании мы разработали, охарактеризовали и подтвердили эффективность анализа клональности B- или T-клеточных рецепторов (BCR/TCR) на основе NGS (OriMIRACLE LTM). Основными целями данного исследования были проверка чувствительности и специфичности этого анализа для мониторинга минимальной остаточной болезни (MRD) при лимфоидных злокачественных новообразованиях, в том числе с использованием остаточных мазков. Этот метод позволяет напрямую использовать остаточные мазки костного мозга, оставшиеся после рутинной диагностики, преодолевая тем самым присущие мазковым образцам ограничения. Даже если ДНК в мазках фрагментирована вследствие фиксации, окрашивания и длительного хранения, присутствует в крайне низких количествах или частично деградирована, надежные профили иммунного репертуара могут быть получены благодаря оптимизированной экстракции нуклеиновых кислот и мультиплексной ПЦР-амплификации. Метод обеспечивает высокочувствительное клональное отслеживание с чувствительностью от 10⁻⁵ до 10⁻⁶, что превосходит нижний предел обнаружения традиционного мониторинга MRD на основе проточной цитометрии. Данная работа подчеркивает потенциал оценки клональности BCR/TCR на основе NGS в улучшении мониторинга MRD и обосновании решений по лечению пациентов с MM, что может решить существующие проблемы в клинической практике.

Протокол

Данное исследование было проведено в соответствии с принципами Хельсинкской декларации и одобрено Комитетом по этике Первой аффилированной больницы Медицинского университета Ганнань (номер одобрения этического комитета: 22SC-2023011201). До включения в исследование от всех участников было получено письменное информированное согласие.

Выбор образцов
Клинические образцы были получены от 40 пациентов с диагностированными различными гематологическими злокачественными новообразованиями, включая ALL, MM, CLL и лимфому. Кроме того, были собраны парные образцы хронической и бластной фаз от пациентов с хроническим миелоидным лейкозом. Образцы были получены в Первой аффилированной больнице медицинского университета Ганнань (Цзянси, Китай) в период с декабря 2016 по август 2022 года. Данные биоматериалы были получены из аспиратов костного мозга (BMA) или периферической крови. Также использовались четыре клеточные линии лимфоидных злокачественных новообразований: линии B-ALL REH и NALM6, линия T-ALL Jurkat и линия лимфомы H9, все закуплены в Американской коллекции типовых культур (ATCC; Манассас, Вирджиния).

Для исследования аналитической валидации была использована подгруппа парных мазков остаточного костного мозга, полученных до и после лечения у 30 пациентов с впервые диагностированной или рецидивирующей множественной миеломой (MM). Анализы MFC проводились на образцах аспиратов костного мозга (BMA) в соответствующие временные точки с использованием 4-цветной проточной цитометрии.

Образцы окрашивали с использованием шести различных 4-цветных комбинаций антител (разведения согласно инструкциям производителя): CD38/CD56/CD45/CD19, CD38/CD138/CD45/CD34, CD38/CD117/CD45/CD33, CD38/CD22/CD45/CD20, CD38/CD9/CD45/HLA-DR и K/L/CD45/CD38. Окрашивание проводили в течение 30 мин при 4 °C в темноте с последующим двукратным промыванием буфером PBS (центрифугирование при 500 × g в течение 5 мин при 4 °C). В иммуногематологических лабораториях положительный результат MFC-MRD в костном мозге в настоящее время определяется по порогу 10^-4 (1 клетка на 10 000). Качество сбора данных проточной цитометрии проверяли путем визуализации прямого и бокового светорассеяния и подтверждения наличия не менее 10 000 событий CD45⁺ в одной пробирке.

Определение клональности и мониторинг МРБ с помощью анализа клональности на основе NGS
гДНК экстрагировали из 200 µL аспирата костного мозга, периферической крови или всего остатка мазка (ресуспендированного в 200 µL PBS) с использованием соответствующего набора согласно инструкциям производителя. Требовалась минимальная концентрация гДНК 20 ng/µL и общий выход ≥ 1 µg. Было подтверждено соотношение A260/A280 в диапазоне 1,8–2,0. В данном анализе гДНК амплифицируют с помощью локус-специфической мультиплексной ПЦР с использованием праймеров с последующим добавлением индекса-штрихкода специфичности реакции к амплифицированной последовательности рецептора для идентификации образца. Затем амплифицированная ДНК со штрихкодами объединяют для подготовки библиотек секвенирования, которые подвергаются NGS на платформе Illumina. Конечный размер библиотеки 350–450 bp и концентрация ≥ 5 nM были подтверждены на Bioanalyzer. Данные секвенирования обрабатывают с использованием специализированных биоинформатических конвейеров и строгих мер контроля качества. Риды присваивают перестроенным BCR или TCR для каждого образца и объединяют в клональные последовательности рецепторов. Затем эти последовательности оценивают на предмет их связи с заболеванием и пригодности для последующего мониторинга. Чтобы последовательность считалась подходящей, она должна составлять не менее 10% всех последовательностей BCR в данном локусе и обладать достаточной уникальностью. При оценке последовательности для мониторинга МРБ ее уникальность определяют путем сравнения с комплексной базой данных репертуаров B- или T-клеток, такой как база данных ImMunoGeneTics (IMGT) (http://www.imgt.org). Частота данной последовательности в этой базе данных используется для оценки ее специфичности. После идентификации соответствующих связанных с заболеванием последовательностей их сравнивают с последующими образцами для мониторинга МРБ. Образцы классифицируют как МРБ-положительные (+) при обнаружении соответствующих последовательностей или МРБ-отрицательные (-), если соответствия не обнаружены. Количественно определяют концентрацию каждой отслеживаемой последовательности, что позволяет рассчитать консенсусное количество злокачественных клеток и общее количество ядерных клеток на уровне образца. Отношение этих показателей дает оценку частоты опухолевых клеток в образце, предоставляя ценные сведения о прогрессировании или ремиссии заболевания. Клональная последовательность считалась пригодной для мониторинга, если было обнаружено не менее 50 подтверждающих ридов и последовательность составляла ≥10% общего репертуара BCR/TCR при постановке диагноза.

Все образцы человеческого происхождения обрабатывались как биологически опасные в шкафу биологической безопасности (BSC) II класса с использованием средств индивидуальной защиты (СИЗ). Загрязненные расходные материалы перед утилизацией автоклавировали (121 °C, 20 min); жидкие отходы обрабатывали 10% раствором гипохлорита натрия.

Исследования точности и чувствительности
Предел обнаружения (LOD) был определен с использованием клинических образцов и клеточных линий на фоне гДНК периферической крови здоровых доноров. Для установления линейности обнаружения гДНК клеточных линий добавляли в нормальную гДНК для создания диапазона клональных частот, охватывающего несколько порядков величины. В частности, добавляли злокачественные клетки, начиная с 10 клеток, с последующим 10-кратным серийным разведением: 10, 100, 1 000 и 10 000 клеток. LOD рассчитывали как ожидаемое количество вводимых злокачественных клеток, при котором подогнанная пробит-кривая достигала 95% вероятности обнаружения. Соответствие между наблюдаемыми и ожидаемыми частотами анализировали с помощью линейной регрессии. Эти параметры обеспечивают надежную основу для оценки минимальной остаточной болезни (MRD) на уровне образца в последующих оценочных исследованиях. Данная уточненная версия сохраняет академический тон, при этом повышая четкость и лаконичность. Она также обеспечивает правильное использование научной терминологии и соответствует конвенциям научных публикаций в области наук о жизни и медицины.

Статистический анализ
Двустороннее значение p < 0.05 считалось статистически значимым. Линейность оценивали и рассчитывали с использованием коэффициента корреляции Пирсона (r) в программе GraphPad Prism. Статистический анализ проводили с помощью языка R (версия 3.6.1). Расчет выживаемости без прогрессирования (PFS) начинается с момента достижения пациентом полного ответа (CR), частичного ответа (PR) или очень хорошего частичного ответа (VGPR) и продолжается до развития прогрессирования заболевания (PD) или смерти от любой причины. Для анализа выживаемости использовали кривую Каплана-Мейера, а для сравнения различий в выживаемости между подгруппами — логарифмический ранговый критерий (log-rank test). Анализ Кокса проводили с использованием как одномерного, так и многомерного анализа.

Результаты

Обработка, линейность и прецизионность определения клональности
Анализы на клональность BCR/TCR были основаны на двух раундах мультиплексной ПЦР с последующим NGS (Рисунок 1). Анализы на клональность BCR позволяли выявлять перестройки IGH (VH-DH-JH или DH-JH), IGK (Vκ-Jκ, Vκ-Kde и intronRSS-Kde) и IGL (Vλ-Jλ), а также транслокации BCL1-IGH и BCL2-IGH с использованием отдельных реакций или одной скорректированной смешанной реакции. Анализы на клональность TCR позволяли выявлять перестройки TCRB (Vβ-Dβ-Jβ) и TCRG (Vγ –Jγ). Частота выявления клональности BCR при В-клеточных лимфоидных злокачественных новообразованиях составила 93,94%, а клональности TCR при Т-клеточных лимфоидных злокачественных новообразованиях — 90,91% (Таблица 1).

Линейность была продемонстрирована в широком диапазоне количеств образца (0,2 µg, 2 µg и 20 µg) на основании результатов тестов клеточных линий, охватывающих несколько порядков величины. Для установления линейности злокачественные клетки добавляли в нормальную гДНК, используя 10-кратные серийные разведения (10, 100, 1 000 и 10 000 клеток). Линейность наблюдалась с расчетными значениями наклона от 0,93 до 1,06 при клональных частотах от 1 до 10^-6 (Рисунок 2A). LOD оценивался в пределах от 1 до 2 злокачественных клеток в обоих анализах клональности BCR и TCR (Рисунок 2B). Кроме того, анализы клональности BCR/TCR позволили выявить клональность при лимфоме с использованием образцов тканей (BMA) и соответствующей периферической крови (Дополнительная таблица 1).

Пациенты и образцы, использованные для валидации детекции MRD
Валидация детекции MRD включала в общей сложности 29 пациентов с ММ, один из которых был исключен из-за повреждения образца. Исследуемая популяция состояла из 65,52% (19/29) мужчин и 34,48% (10/29) женщин, медианный возраст которых составил 65 лет (диапазон 33–82) (Таблица 2). В данной когорте 31,03% (9/29) пациентов были классифицированы как группа высокого риска, 24,14% (7/29) — как стандартного риска и 37,93% (11/29) — как низкого риска согласно критериям IMWG¹⁸. Стадии I, II и III по пересмотренной международной системе стадирования множественной миеломы (R-ISS) соответствовали 10,34% (3/29), 48,28% (14/29) и 20,69% (6/29) пациентов соответственно¹⁹.

Сравнение анализов NGS и MFC
Для оценки количественной точности анализов OriMIRACLE LTM и MFC было проведено прямое попарное сравнение. Результаты продемонстрировали схожую количественную точность в протестированном диапазоне, особенно при частоте MRD выше 10⁻⁴, при значении коэффициента корреляции Пирсона R = 0,73 (Рисунок 3). Опухолевые клетки были обнаружены обоими методами (MFC и NGS) в 59 образцах от 29 пациентов с MM, при этом согласованность составила 81,36% (48/59). Эта согласованность отражает наличие определяемых опухолевых клеток в разные моменты времени, а не истинную конкордантность методов. Среди образцов 62,07% (18/29) оказались MRD-положительными при обоих анализах (NGS и MFC), один пациент был MRD-отрицательным при обоих методах, а у 11 пациентов результат был MRD-положительным по данным NGS, но MRD-отрицательным по данным MFC. Среди пациентов с несогласованными результатами обнаружения у троих частота обнаружения была ниже 10^-4, тогда как у восьми частота обнаружения находилась в диапазоне 10^-2–10^-4 (Рисунок 3). Экстракция ДНК из остаточных мазков костного мозга проводится для получения максимально возможного количества ДНК. Для определения клональности перед началом лечения тестировалось в среднем 91,95 ng (до 100,0 ng) исходной ДНК. Для последующего тестирования на MRD было экстрагировано в среднем 1623,39 ng ДНК (в диапазоне от 50,1–17400,0 ng) (Дополнительная таблица 2). Это показало, что NGS может обнаруживать MRD даже при недостаточном объеме остаточного образца, в то время как MFC в некоторых случаях не позволял обнаружить MRD.

Клиническая валидность определения ОМР методом NGS для первичного интервала
Клональные последовательности были обнаружены на исходном этапе у всех пациентов с ММ, после чего была проведена оценка ОМР (Рисунок 4). У восемнадцати пациентов было подтверждено наличие ОМР+ с помощью методов NGS и MFC. Среди пациентов с ОМР+ по данным MFC и NGS у 61,11% (11/18) впоследствии наблюдалось прогрессирование заболевания (ПЗ) или рецидив. 38,89% (7/18) пациентов достигли стабилизации заболевания (СЗ) или частичного ответа (ЧО) в ходе исследования. Среди пациентов с подтвержденным ОМР+ по данным NGS, но ОМР− по данным MFC, 36,36% (4/11) не смогли достичь клинического полного ответа (ПО) при последнем клиническом обследовании (Дополнительная таблица 2). Кроме того, среди всех пациентов с клиническим ответом в виде ПО у 37,50% (3/8) наблюдался рецидив после прекращения лечения. Мы также изучили основные клинические характеристики и результаты MFC в связи с показателем выживаемости без прогрессирования (ВБП) (Дополнительный рисунок 1). Однофакторный и многофакторный анализы ВБП показали отсутствие значимой взаимосвязи. В данном исследовании не было выявлено значимой разницы в ВБП при анализе только результатов ОМР, полученных методом MFC.

ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ
В связи с ограничениями конфиденциальности пациентов и политикой учреждений необработанные данные не доступны для публичного доступа. Сводка собранных данных представлена в Дополнительном файле 1.

Рисунок 1: Анализ клональности BCR/TCR включал мультиплексную ПЦР с последующим NGS. В первом раунде ПЦР амплифицировали регион CDR3 перестроенных генов иммунных рецепторов с использованием локус-специфических праймеров и образец-специфических индексов, а адаптеры для NGS добавляли во время второго раунда ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Линейность определения клональности оценивали путем добавления гДНК клеточной линии в нормальную гДНК в диапазоне различных частот клонов. (A) Линейность анализов клональности BCR и TCR. (B) Предел обнаружения (LOD), рассчитанный с использованием клинических образцов и клеточных линий, добавленных в гДНК периферической крови здорового донора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Попарное сравнение измерений частоты минимальной остаточной болезни (МОБ) между методом проточной цитометрии (MFC) и анализом МОБ с помощью секвенирования следующего поколения (NGS). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Динамика МРБ у пациентов с ММ и различные клинические статусы пациентов. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Типы образцов		№	Тип заболевания	Доминирующий клонотип
Клеточные линии	REH	1	B-ALL	IGH, IGK
	NALM6	2	B-ALL	IGH, IGK
	Jurkat	3	T-ALL	TCRB, TCRG
	H9	4	Лимфома	TCRB, TCRG
Клинические B-клеточные лимфоидные злокачественные новообразования		5	B-ALL	IGH
		6	B-ALL	IGL
		7	B-ALL	IGH
		8	B-ALL	Не обнаружено
		9	ХЛЛ	IGH, IGK
		10	ХЛЛ	IGH, IGK
		11	ХП-МЛЛ	IGH
		12	ВП-МЛЛ	IGH
		13	ММ	IGK
		14	ММ	IGH, IGK
		15	ММ	IGK
		16	ММ	IGH
		17	ММ	IGH
		18	ММ	IGK
		19	ММ	IGH
		20	ММ	IGH, IGK
		21	ММ	IGH, IGK
		22	ММ	IGH
		23	Лимфома	IGH, IGK
		24	Лимфома	IGH, IGK, IGL
		25	Лимфома	IGH, IGK, IGL
		26	Лимфома	IGH, IGK, IGL
		27	Лимфома	IGH
		28	Лимфома	IGH
		29	Лимфома	IGH, IGK, IGL
		30	Лимфома	IGH, IGK
		31	Лимфома	IGH, IGK
		32	Лимфома	IGH, IGK, IGL
		33	Лимфома	IGK
		34	Лимфома	IGH
		35	Лимфома	Не обнаружено
Клинические T-клеточные лимфоидные злокачественные новообразования		36	Лимфома	TCGR
		37	Лимфома	TCRB, TCRG
		38	Лимфома	TCRB, TCRG
		39	Лимфома	TCRB, TCRG
		40	Лимфома	TCRB, TCRG
		41	Лимфома	TCRB, TCRG
		42	Лимфома	TCRB, TCRG
		43	Лимфома	TCRB, TCRG
		44	Лимфома	Не обнаружено

Таблица 1: Определение клональности с использованием анализов клональности BCR/TCR в 4 клеточных линиях и 40 клинических образцах. B-ALL: B-клеточный острый лимфобластный лейкоз; T-ALL: T-клеточный острый лимфобластный лейкоз; CP-CML: Хроническая фаза хронического миелолейкоза; BP-CML: Бластная фаза хронического миелолейкоза; CLL: Хронический лимфолейкоз; MM: Множественная миелома.

Характеристика	Всего (N = 29)
Медианный возраст, лет (диапазон)	65 (33-82)
Пол, n (%)
Мужской	19 (65.52)
Женский	10 (34.48)
Тип тяжелой цепи, n (%)
IgG	14 (48.28)
IgA	7 (24.14)
IgE	1 (3.45)
Тип легкой цепи, n (%)
k	19 (65.52)
λ	8 (27.59)
Цитогенетическая аномалия, n (%)
del17p	2 (6.90)
del13q14	9 (31.03)
gain/amp 1q21	12 (41.38)
t (4;14)	2 (6.90)
Аномалий не выявлено	9 (31.03)
Стадия ISS, n (%)
I	4 (13.79)
II	13 (44.83)
III	12 (41.38)
Стадия R-ISS, n (%)
I	3 (10.34)
II	14 (48.28)
III	6 (20.69)
Отсутствуют данные	6 (20.69)
IMWG, n (%)
Высокий риск	9 (31.03)
Стандартный риск	7 (24.14)
Низкий риск	11 (37.93)
Отсутствуют данные	2 (6.90)

Таблица 2: Исходные характеристики 29 пациентов с множественной миеломой, включенных в данное исследование. k: каппа; λ: лямбда; DS: классификация Дюри-Салмона; ISS: международная система стадирования; R-ISS: пересмотренная международная система стадирования; IMWG: Международная рабочая группа по миеломе

Дополнительный рисунок 1: Анализ выживаемости на основе клинических характеристик и результатов MFC. (A) Однофакторный и многофакторный анализы ВБП. (B) Кривая Каплана-Мейера в зависимости от результата MFC. (C) Кривая Каплана-Мейера в зависимости от результата NGS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 1: Определение клональности лимфомы с помощью анализов клональности BCR/TCR в образцах тканей и соответствующей периферической крови. NHL: неходжкинская лимфома; HGBL: высокозлокачественная В-клеточная лимфома; FL: фолликулярная лимфома; DLBCL: диффузная B-крупноклеточная лимфома; ITLPD-GI: инертные Т-лимфопролиферативные заболевания желудочно-кишечного тракта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 2: Результаты определения минимальной остаточной болезни (MRD) на основе анализов MFC и NGS. ND: не обнаружено; Частичный ответ: PR; Полный ответ: CR; Стабилизация заболевания: SD; Очень хороший частичный ответ: VGPR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 1: Сводка необработанных данных, собранных в данном исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

В последние годы наблюдается значительное улучшение клинических исходов при лимфоидных злокачественных новообразованиях, что стимулирует поиск альтернативных маркеров, способных более ранним этапом предсказывать показатели выживаемости и ускорять оценку эффективности новых методов терапии²⁰. Комплексный метаанализ с участием 8 098 пациентов подтвердил высокую прогностическую ценность отрицательного статуса МРБ в увеличении долгосрочной выживаемости пациентов с множественной миеломой²¹. Кроме того, клональные перестройки BCR и TCR стали важнейшими диагностическими маркерами и инструментами мониторинга МРБ, определяющими тактику лечения при злокачественных новообразованиях лимфатической системы²².

Растущее число доказательств подтверждает превосходство оценки клональности BCR/TCR на основе NGS по сравнению с анализами методом MFC и ПЦР, особенно при наличии достаточного количества образцов ДНК. NGS обеспечивает более высокую чувствительность и более простую стандартизацию^{10,23,24,25,26} и был определен как значимый прогностический фактор как для PFS, так и для общей выживаемости при начале поддерживающей терапии²⁷.
В данном исследовании мы разработали анализ на основе NGS, который демонстрирует частоту положительного обнаружения более 90% как для клональности BCR, так и для TCR при лимфоидных злокачественных новообразованиях. LOD данного анализа оценивается в пределах от 1 до 2 злокачественных клеток для анализа клональности как BCR, так и TCR, что сопоставимо с высокой чувствительностью анализа clonoSEQ с LOD 1,903 злокачественных клеток¹⁶. Мы наблюдали линейность с расчетными коэффициентами наклона от 0,93 до 1,06 в диапазоне клональных частот от 1 до 10^-6, что указывает на сильную пропорциональность между наблюдаемыми и ожидаемыми клональными частотами. После установления стандартизированных методов обнаружения и завершения лабораторной валидации мы провели клиническую валидацию, чтобы подтвердить пригодность анализа для клинического мониторинга MRD.

Данное исследование выявило соответствие между анализом на основе NGS и MFC на уровне 81,36% (48/59). Оба метода продемонстрировали 100% чувствительность при выявлении опухолевых клеток в случаях с впервые диагностированным заболеванием или рецидивом. При мониторинге после лечения мы не обнаружили значимой корреляции между статусом MRD, определенным с помощью MFC, и PFS, что, вероятно, связано с ограниченным размером выборки. Вследствие этого мы провели комплексный анализ всех случаев.

Из 18 пациентов, у которых обоими методами была выявлена положительная MRD, результаты MRD совпали с оценками клинического ответа. У девяти из этих пациентов наблюдались PD или рецидив, у четырех была достигнута SD, у четырех — PR, один пациент скончался. Это говорит о том, что у пациентов с положительным результатом MRD по обоим методам PD или рецидив наблюдаются почти неизменно. Эти данные свидетельствуют о том, что положительный результат MRD в анализах NGS и MFC в основном отражает ограниченную эффективность лечения или плохой прогноз у данных пациентов. Из 11 пациентов, у которых результат MRD был положительным при NGS, но отрицательным при MFC, 36,36% не достигли CR. Эти результаты подчеркивают способность NGS выявлять MRD при частотах от 10^-2 до 10^-6 даже при ограниченном количестве остаточных образцов, в то время как MFC в некоторых случаях не обнаруживала MRD. Это дополнительно подтверждает более высокую чувствительность и специфичность NGS при детекции MRD по сравнению с MFC.

Предыдущие исследования показали, что статус MRD, оцениваемый методом MFC, является сильным предиктором PFS и общей выживаемости у пациентов с MM, что подчеркивает важность мониторинга MRD при принятии решений о лечении и оценке прогноза после аутологичной трансплантации стволовых клеток²⁸. Полученные здесь результаты дополнительно подчеркивают значимость анализов NGS, что иллюстрируют два случая (пациенты 11 и 14), когда у пациентов был выявлен MRD-отрицательный статус при MFC, но MRD-положительный при NGS. Важно отметить, что прекращение лечения в таких случаях может привести к риску рецидива, что указывает на необходимость тщательной оценки ответа на терапию при обнаружении несогласованных результатов MRD.

Данное исследование устраняет зависимость существующих методов NGS и MFC от свежих аспиратов костного мозга или замороженных клеток и впервые систематически подтверждает, что остаточные, окрашенные мазки костного мозга, оставшиеся после рутинной диагностики, могут служить надежным исходным материалом для высокочувствительного обнаружения MRD. Это позволяет напрямую восполнить следующие клинические и методологические пробелы: (1) исключается необходимость забора больших объемов жидкости костного мозга для мониторинга MRD, что особенно важно для пожилых пациентов или лиц с затрудненным забором проб; (2) становится возможным ретроспективный анализ архивных мазков, что позволяет использовать существующие патологоанатомические ресурсы для установления прогностических данных на основе MRD в исторических когортах; и (3) благодаря чувствительности обнаружения 10^-5-10^-6, данный метод значительно превосходит традиционный MFC (обычно 10^-4-10^-5) и позволяет избежать ложноотрицательных результатов, вызванных проблемами качества образцов в MFC, предоставляя инструмент оценки MRD на основе ДНК, пригодный для отслеживания в клинической практике.

Для обеспечения успеха и надежности анализа было определено несколько критических этапов. Для получения достаточного выхода gDNA было необходимо осторожное соскоб residual smears с последующим немедленным нанесением буфера. Чтобы избежать выпадения аллелей или смещения амплификации, требовалось точное количество исходной ДНК (100 ng на реакцию, с точностью ±10%). Эквимолярное объединение баркодированных продуктов (2 nM) способствовало равномерной глубине секвенирования, а последовательное применение биоинформатических порогов (клональная частота ≥10% при диагностике и ≤5% несовпадений для отслеживания) помогло предотвратить ложноположительные результаты определения MRD. Кроме того, были внесены некоторые модификации в стандартный протокол для решения распространенных экспериментальных проблем. Если конечная концентрация библиотеки падала ниже 5 nM, осторожно добавлялся второй раунд ПЦР с 2–4 дополнительными циклами, чтобы избежать смещения из-за избыточной амплификации. Для образцов, в которых клональное отслеживание не удалось из-за чрезмерного количества несовпадений (>5%), обновлялась справочная база данных IMGT, а допустимый уровень несовпадений временно расширялся до 8% для исследовательского анализа, хотя 5% оставался стандартным порогом для клинических отчетов. Если глубина секвенирования опускалась ниже 50,000 чтений на образец, проводились повторное объединение и повторное секвенирование без повторения этапа ПЦР.

В целом, эта практическая валидация демонстрирует, что остаточные образцы мазков костного мозга дают согласованные и надежные результаты тестов в различных условиях лечения. В экономически неблагополучных регионах, где вместо NGS рутинно проводятся биопсия костного мозга и MFC, полученные данные позволяют рассматривать NGS для дальнейшего молекулярного анализа в случае получения отрицательных первичных результатов. В таких ситуациях использование остаточных образцов целесообразно, так как это исключает необходимость повторной аспирации костного мозга, тем самым снижая нагрузку на пациента.

Несмотря на то, что наше текущее исследование в условиях реальной клинической практики направлено на расширение объема выборки для дальнейшего анализа, мы признаем наличие ряда ограничений. Могут возникать ложноотрицательные результаты, особенно при недостаточном содержании экстрагированной ДНК, что наблюдалось при втором определении MRD у пациента 10. Кроме того, на долю клонов, выявляемых методом NGS, влияет количественное определение клеток, что может привести к завышению пропорции клеток MRD. Валидация в основном сосредоточена на образцах костного мозга. Однако долгосрочная значимость NGS-MRD заключается в многократном наблюдении после лечения, при котором более подходящим может быть использование периферической крови. Валидация образцов периферической крови еще не проводилась. Ввиду ограниченного количества образцов для клинической валидации, случайного подбора пациентов и разнообразия подходов к лечению в данном исследовании в реальных условиях, сбор последовательных образцов MRD оказался затруднительным. Следовательно, мы сосредоточились на оценке значимости ранних ответов MRD в связи с последующим прогрессированием заболевания и не смогли продемонстрировать влияние стойкого статуса MRD на долгосрочные исходы. Кроме того, в сравнительный анализ не был включен метод NGF. Хотя NGS и традиционный MFC были систематически сопоставлены, метод NGF, являющийся одним из двух рекомендованных IMWG методов определения MRD (вторым является NGS), позволил бы получить дополнительные данные о качестве анализа. Кроме того, размер выборки относительно невелик (n = 40), а когорта гетерогенна и включает различные гематологические злокачественные новообразования. Для подтверждения и расширения наших выводов обосновано проведение будущих многоцентровых крупномасштабных исследований с использованием NGF и фокусировкой на одном виде злокачественного новообразования, таком как множественная миелома.

После тщательной характеристики и валидации эффективности анализа клональности BCR/TCR на основе NGS мы продемонстрировали, что данный метод обладает потенциалом в качестве высокочувствительного, точного и практичного способа количественного определения и мониторинга MRD в остаточных мазках костного мозга пациентов с MM.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Anti-CD19	Abcam	AB134114	Разведение согласно инструкциям производителя
Anti-CD20	Abcam	AB64088	Разведение согласно инструкциям производителя
Anti-CD22	Abcam	AB32123	Разведение согласно инструкциям производителя
Anti-CD33	Abcam	AB134115	Разведение согласно инструкциям производителя
Anti-CD34	Abcam	AB81289	Разведение согласно инструкциям производителя
Anti-CD38	Abcam	AB183326	Разведение согласно инструкциям производителя
Anti-CD45	Abcam	AB40763	Разведение согласно инструкциям производителя
Anti-CD56	Abcam	AB75813	Разведение согласно инструкциям производителя
Anti-CD9	Abcam	AB2215	Разведение согласно инструкциям производителя
Anti-HLA-DR	Abcam	AB20181	Разведение согласно инструкциям производителя
GraphPad Prism	GraphPad	https://www.graphpad.com/
Illumina NovaSeq 6000	Illumina	NovaSeq 6000	https://www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/novaseq.html
База данных ImMunoGeneTics (IMGT)	ImMunoGeneTics (IMGT) database	http://www.imgt.org/
Клеточные линии лимфоидных злокачественных новообразований	ATCC	https://www.atcc.org/	линии B-ALL REH и NALM6, линия T-ALL Jurkat и линия лимфомы H9 (DSMZ)
Multiparametric flow cytometry	BECKMAN COULTER	CytoFLEX
Анализ OriMIRACLE LTM	Origimed Co., Ltd., Шанхай, Китай
Язык программирования R	R Foundation for Statistical Computing	версия 3.6.1