Секвенирование транскриптома выявило центральные патогенные хемокины в атеросклеротических бляшек

Краткое содержание

Цель данного исследования — проанализировать основные механизмы воспалительных факторов, связанных с атеросклеротическими бляшеками (АП), с помощью РНК-секвенирования. Результаты выявили ключевые гены воспалительных узлов CCL3, CCL4 и CXCL1 в AP. Эти хемокины могут стимулировать атеросклероз, способствуя накоплению макрофагов M0 и одновременно подавляя защитные иммунные клетки, раскрывая потенциальные терапевтические цели.

Аннотация

Атеросклеротическая бляшка (АП) — это разновидность воспалительного пролиферативного заболевания фиброзной ткани после повреждения эндотелиальных и гладкомышечных клеток в стенке артерии, что может привести к различным степеням обструкции кровотока в сердечно-сосудистой и цереброваскулярной системе. Однако эффективные терапевтические подходы, направленные на воспаление, в значительной степени не достигли успеха, что говорит о необходимости получения дополнительных данных. В данном исследовании целью было проанализировать транскриптомические изменения, связанные с воспалительными факторами, с помощью РНК-секвенирования (РНК-секвенирование). РНК-секвенция проводилась на образцах пациентов с АП (n = 11) и контрольных лиц (n = 3). Дифференциально экспрессированные гены (DEG) были выявлены с помощью Metascape, затем был проведен анализ обогащения путей KEGG с использованием пакета clusterProfiler в программном обеспечении R, анализ иммунной инфильтрации с использованием CIBERSORT, а также сеть взаимодействия белков и белков (PPI) с использованием базы данных STRING. Гены хаба в сети PPI были выявлены с помощью плагина CytoHubba. В группе AP было выявлено всего 3713 DEGs, включая 2097 генов с повышенной регуляцией и 1616 с пониженной регуляцией. Результаты показали, что DEG в основном обогащаются путями, связанными с иммунным и воспалением. Три фактора, связанных с воспалением — CCL3, CCL4 и CXCL1 — рассматривались как основные центральные гены в патологическом процессе AP. Анализ иммунной инфильтрации выявил уникальную микросреду в AP, характеризующуюся значительным увеличением количества макрофагов M0 и уменьшением CD8⁺ T-клеток, активированных NK-клеток и покоящих тучных клеток внутри AP. В заключение, эти процедурные результаты описывают различие экспрессии CCL3, CCL4 и CXCL1 и их связь с изменённым составом иммунных клеток в AP, выделяя три хемокина как потенциальных кандидатов для дальнейших механистических исследований.

Введение

Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) представляют серьёзную угрозу для здоровья человека^{во всем мире 1}. По мере усиления глобальной тенденции старения населения также растёт заболеваемость^{ССЗ 2}. Среди них атеросклеротическая бляшка (АП) является одной из основных причин^{сердечно-сосудистого заболевания 3}. АП — хроническое воспалительное заболевание, характеризующееся постепенным накоплением липидов в интимах артерий и образованием бляшек⁴. АП является распространённым основанием для сердечно-сосудистых и цереброваскулярных событий и в основном затрагивает крупные и средние артерии, приводящие к ишемии и травмам, а также является основным фактором, вызывающим сердечно-сосудистые и цереброваскулярные заболевания^{и смерть 5}. Из-за отсутствия явных симптомов на ранних стадиях АП обычно прогрессирует к моменту постановки диагноза, что приводит к высокому уровню^{летальности 6}. Лечение АП сосредоточено на факторах риска, включая изменяемые факторы, такие как низкая физическая активность, малоподвижное поведение, курение, психические проблемы⁷, а также ожирение и диабет 2 типа из-за диеты с высоким содержанием жиров, а также неизменяемые факторы, такие как гены, возраст и пол⁸. Недавние исследования показали, что метаболический синдром, гомоцистеинемия, гиперурикемия и поджелудочная резистентность являются важными факторами риска возникновения и развития атеросклероза ^9,10.

Теории, связанные с патогенезом АП, в основном включают теории липидной инфильтрации, воспаления, окислительного стрессового ответа, инфекции и взаимодействия генетических и экологических^{факторов 11,12}. Среди них воспаление и окислительный стресс признаны основными патогенезами АП и участвуют во всех процессах — от появления до развития и ухудшения АП¹³. Внезапное повреждение нестабильного бляшка AP, активация тромбоцитов и тромбоз являются важными патогенезами инфаркта миокарда и геморрагического^{инсульта 14}. В ходе постоянных исследований было установлено, что АП содержат не только липиды, но и множество воспалительных^{клеток 15}. Курение, гипертония, липидные нарушения, гиперинсулинемия, гипергликемия, высокий уровень мочевой кислоты и другие вредные стимулы вызывают непрерывное высвобождение растворимых адгезионных молекул и различных цитокинов и стимулируют прилипывание моноцитов к сосудистым эндотелиальным клеткам. Накопленные хемокины дополнительно приводят к миграции моноцитов в субэндотелиальное пространство, где они дифференцируются в макрофаги, которые затем фагоцитозируют окисленный холестерином липопротеин низкой плотности (ЛПНПН) внутри ткани, превращаясь в пенистые клетки и инициируя образование липидных^{полос 16}. Раннее патологическое повреждение AS, а именно липидные полосы, в основном состоит из макрофагов и Т-лимфоцитов, которые являются типичным воспалительным^{поражением 17}. Таким образом, различные воспалительные клетки и их продукты участвуют в инициации и прогрессировании AP¹⁸. Однако воспалительный ландшафт АП сложен и включает множество известных и потенциально неизвестных факторов. Традиционные подходы с кандидатами на генах могут не охватить весь спектр воспалительных факторов.

Для устранения этого ограничения мы использовали РНК-секвенирование (RNA-seq) — непредвзятый высокопроизводительный транскриптомический метод. Этот подход особенно уместен для исследований, генерирующих гипотезы, где ключевые молекулярные драйверы не заранее определены. В отличие от методов кандидатов на генах или микрочипах, RNA-seq предлагает более широкий динамический диапазон, более высокую чувствительность и способность обнаруживать новые транскрипты без предварительного проектирования^{зонда 19,20}. Эти особенности делают его особенно подходящим для обнаружения воспаления-сигнатур в AP, где молекулярная основа остаётся неполностью охарактеризованной.

В этом исследовании RNA-seq проводился для анализа основных механизмов воспалительных факторов, связанных с AP. Биоинформатика с использованием различных алгоритмов использовалась для скрининга серии DEG. Впоследствии были проведены анализ обогащения (WGCNA, KEGG pathway, mcode, GSEA, анализ генов хаба) и анализ сетей взаимодействия белков и белков (PPI). Результаты этого исследования способствуют лучшему пониманию молекулярно-патологического механизма, лежащего в основе воспаления, вызванного АП, и играют важную роль в поиске новых биомаркеров.

Протокол

Это исследование было одобрено Этическим комитетом Народной больницы Ляочэн (номер одобрения: 2023014) и соответствовало принципам Хельсинкской декларации. Все участники получили информированное согласие. Формы информированного согласия подписывались всеми пациентами или их семьями.

Пациенты и образцы

В этом исследовании ретроспективно проанализировали 11 пациентов с тяжёлым стенозом сонной артерии, которые проходили эндартерэктомию сонной артерии в отделении сосудистой нейрохирургии Народной больницы Ляочэн, провинция Шаньдун, Китай, с января 2023 по декабрь 2023 года. Эти пациенты были зачислены в группу AP. Диагноз стеноза сонной артерии основывался на данных визуализации, таких как КТА или церебральная ангиография. Критерии включения в группу AP были: (1) возраст от 50 до 80 лет; (2) компьютерная томография/цифровая субтракция ангиография подтвердила внутреннечерепный стеноз внутренней сонной артерии ≥70%; (3) изменённый балл по шкале Ранкина до начала ≤ 1; (4) информированное согласие, полученное от пациента или его законного представителя. Критерии исключения были: (1) воспалительные или иммунные заболевания; (2) наличие психиатрических расстройств; (3) наличие злокачественных опухолей; (4) беременность, лактация или потенциал репродуктивности. Возрастное сопоставление Пациенты с тяжелой черепно-мозговой травмой, проходившие донорство органов в той же больнице в тот же период в тот же период, были отобраны в контрольную группу (NA; Нормальное управление, n = 3). Участников в двух группах сопоставили по возрасту, полу и индексу массы тела, чтобы исключить смешивающие факторы. Критерии включения в контрольную группу были следующими: (1) возраст от 50 до 80 лет; (2) отсутствие анамнеза ишемической болезни сердца, стеноза сонной артерии или других системных сосудистых заболеваний; (3) информированное согласие, полученное от законного представителя пациента. Образцы интимы сонной артерии и бляшек были собраны из группы AP во время эндартеректомии сонной артерии, а образцы интимы аорты — из контрольной группы после донорства органов. Сосудистые и бляшчатые ткани хранились в резервуарах с жидким азотом для последующих исследований. Исходные характеристики пациентов с АП показаны в Таблице 1.

Подготовка образца

Общая экстракция РНК проводилась с использованием реагента TRIzol в соответствии с инструкциями производителя. Концентрация и чистота РНК оценивались с помощью спектрофотометра Nanodrop ND-2000 на 260 нм и 280 нм (соотношение A260/A280 от 1,8 до 2,0). Целостность РНК оценивалась с использованием электрофореза 2% агарозного геля при 100 В в течение 30 минут. Значения целостности РНК (RIN) были получены с помощью биоанализатора Agilent 2100 (образцы с RIN ≥ 7.0 использовались для дальнейшего анализа). Все процедуры обработки образцов и экстракции РНК проводились при комнатной температуре, если не указано иное. Реагент отходов TRIzol утилизировался в соответствии с институциональными рекомендациями по опасным химическим отходам.

Секвенирование РНК

После обработки общей РНК ДНКазой I мРНК обогащалась с помощью магнитных шариков Oligo D (T), а затем фрагментировала на короткие части при 94 °C в течение 5 минут. Полученные фрагменты мРНК служили шаблоном, а случайный олигонуклеотид — в качестве праймера. КДНК первой цепи синтезировалась с помощью системы обратной транскриптазы M-MuLV при температуре 42 °C в течение 50 минут, после чего РНК-цепи были опосредованы РНК-опосредованными H. Синтез второй цепочки осуществлялся с использованием dNTP в системе ДНК-полимеразы I. Двухцепочечная кДНК была очищена, концы ремонтированы и закреплены навесом «A» для облегчения переходной связки. Бусины AMPure XP использовались для отбора фрагментов cDNA весом 250-300 п.п., которые затем амплифицировались с помощью ПЦР. Затем усиленные продукты очищались для получения конечной библиотеки. Секвенирование библиотеки проводилось на платформе Illumina HiSeq с парной длиной чтения 150 bp. Для контроля качества данных (QC) исходные данные, содержащие последовательности адаптеров или базы низкого качества, фильтровались с помощью внутренних скриптов. Из-за ошибок секвенирования, которые могут возникать при использовании прибора, качество данных оценивалось путём анализа распределения уровней ошибок секвенирования (уровень ошибки < 1% считался приемлемым). Кроме того, было определено распределение контента GC. Все процедуры секвенирования проводились при температуре окружающей среды, если не указано иное. Реагенты, содержащие опасные химикаты (например, буферы DNase I), утилизировались в соответствии с институциональными рекомендациями по биобезопасности.

Пороги контроля качества и устранение неполадок

Использовались только сэмплы с RIN ≥ 7.0 и библиотеки с размером фрагмента 250–300 bp. Требовалось минимум 14 миллионов исходных чтений на выборку с показателем Q30 ≥ 98%. Низкий выход библиотеки был решен увеличением циклов ПЦР до 18, но для поддержания уровня дублирования ниже 15% предпочитали 15 циклов.

Скрининг DEG

Мы оценивали распределение уровней экспрессии генов по разным образцам. Для проверки надежности экспериментов и уместности выбора использовалась межвыборная корреляция уровней экспрессии генов. Анализ основных компонентов (PCA) применялся для оценки межгрупповых различий и воспроизводимости внутри групп. DEG были выявлены с помощью онлайн-базы данных Metascape (http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1). DEG определялись как те, с |log₂(изменение сгиба) | > 1 и p.-значение < 0,05, которые считались статистически значимыми. Все биоинформатические анализы проводились с использованием стандартных параметров, если не указано иное. В качестве контрольной точки промежуточной воспроизводимости были созданы графики PCA, подтверждающие, что выборки кластеризуются по группам, а не по партиям.

Анализ обогащения Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG)

Анализ KEGG (http://www.genome.jp/) — это систематический подход к оценке функции генов для открытия биологических регуляторных путей. В этой статье впервые был получен официальный идентификатор гена преобразования символов дифференциального гена из org.Hs.eg года (версия 3.12.0). Анализ пути KEGG проводился с помощью пакета clusterProfiler в программном обеспечении R (версия 4.2.0). P . < 0,05 считался статистически значимым. Промежуточным результатом стало формирование ранжированного списка обогащённых путей с соответствующим количеством генов и скорректированными p-значениями.

Анализ сетей ИПП

Для построения сети PPI и гена экранного ключа была использована база данных STRING (версия 11.0, https://string-db.org/). Статистически значимыми сохранялись только взаимодействия с композитным баллом выше 0,9. Сеть была визуализирована и проанализирована с помощью Cytoscape (версия 3.10.1) — открытого биоинформатического инструмента, предназначенного для изучения сетей молекулярного взаимодействия. Гены хаба в сети PPI были идентифицированы с помощью плагина CytoHubba (версия 0.1).

Ген хаба

Топ-20 ключевых генов были выбраны CytoHubba Plugin. Красный означает высокий уровень этого гена. Биоинформатический анализ генов хаба с помощью онлайн-базы данных metascape (версия 3.5, http://metascape.org/gp/index) для анализа 20 генов хаба до этого. Обогащение генов было выявлено в следующих онтологических классах: WGCNA, PCA, mcode, GSEA. Все гены в геноме служат фоном обогащения. Тесты с p. < 0,05, минимальным количеством 3 и коэффициентом обогащения > 1,5 были отсеяны.

Метод статистического анализа

Для анализа данных использовалось статистическое программное обеспечение SPSS 25.0. Данные подсчёта выражались в виде частоты или процентов, а сравнение между группами проверялось с помощью теста хи-квадрата. Данные измерений соответствовали среднему ± стандартному отклонению нормального распределения, и для сравнения между группами использовался T-тест. стр . < 0,05 рассматривался как значительная разница.

Результаты

Анализ данных РНК-секвенции дифференциальных генов в атеросклеротических бляшках

Для подготовки библиотеки использовались только сэмплы с RIN ≥ 7.0. Все 14 образцов (11 AP, 3 контрольных) преодолели этот порог. Все образцы секвенировались в одной партии; поэтому корректировка эффекта пакета не требовалась. В среднем было получено 16,8 миллиона необработанных чтений на выборку; После качественной фильтрации было сохранено 16,5 миллиона чистых считываний (98%), из которых 91% были уникально сопоставлены с человеческим эталонным геномом (HG38). Анализ DEGs показал, что у пациентов с бляшками атеросклероза было зарегистрировано 2097 генов с повышенной регулированностью и 1616 (|log2FC| >1, P <0,05) по сравнению со здоровыми контролями (см. рисунок 1A). Тепловая карта топ-20 генов с дифференциально экспрессированной формой была показана на рисунке 1B. Секвенирование РНК секвенирования транскриптома выявило корреляции выборок (рисунок 1C). Корреляция между соэкспрессированными генными модулями и фенотипами была проанализирована WGCNA (рисунок 1D). Анализ PCA показал значимую разницу между группой NA и AP группой (P.< 0,05) (рисунок 1E).

Анализ обогащения КЕГГ дифференциальных генов

Анализ обогащения путей KEGG с использованием пакета ClusterProfiler в программном обеспечении R (версия 4.2.0) проводился отдельно на генах повышенной и пониженной дифференциальной экспрессии в группе заболеваний (рисунок 2A,B). Результаты показали, что эти гены были значительно обогащены путями, связанными с иммунитетом и воспалением, такими как гемопоэтическая клеточная линия, ревматоидный артрит, фокальная адгезия, сигнализация интегрина и сигнальный путь хемокина.

Анализ GSEA

Анализ GSEA показал, что основные гены в экспериментальной группе в основном обогащены в верхней части, что демонстрирует тенденцию к повышению регуляции (см. рисунок 3A). Основные гены в контрольной группе были в основном обогащены внизу, что демонстрирует нисходящую тенденцию (рисунок 3B). В итоге, воспалительные гены были повышены в экспериментальной группе (ASA) и понижены в контрольной группе (NA).

Анализ сетей PPI

В сети PPI, анализируемой с использованием базы данных STRING (версия 11.0), узлы с одним и тем же идентификатором кластера, как правило, расположены близко друг к другу. Как показано на рисунке 4A, это кластерирование показало, что соответствующие гены в первую очередь участвуют в регуляции клеточной активации, воспалительном ответе и активации клеток. На рисунке 4B показана та же сеть, окрашенная p-значениями, где кластеры с большим количеством генов демонстрируют более значимые p.-значения.

Идентификация генов хаба и анализ инфильтрации иммунных клеток

Для анализа mcode и результатов анализа, которые в основном связаны с ацетилхолиновым рецепторами, были выбраны DEGs (Рисунок 5 и Таблица 2). Анализ генов хаба с использованием плагина CytoHubba в Cytoscape выявил 20 главных генов хаба, большинство из которых были связаны с иммунитетом и воспалениями (рисунок 6A, левая панель). Топ-10 генов хаба включали CXCR4, CCL4, CCL3, CCL20, CXCL1, CCL5, CXCL8, CD4, CCR2 и CCR5 (рисунок 6A, правая панель). Пересечение генов хаба с генами воспалительной панели 92 олинка выявило 5 распространённых генов, включая CXCL1, CCL20, TNF, CCL3 и CCL4 (рисунок 6B). Анализ CIBERSORT выявил значительные различия в инфильтрации иммунных клеток между группой заболевания и здоровой контрольной группой. По сравнению с контрольной группой, в этой группе наблюдалась значительно большая доля макрофагов M0 (p < 0,05) (рисунок 6C). Напротив, доля CD8 T-клеток, активированных NK-клеток и большинства покоящих клеток в этой группе была значительно ниже (p. < 0,05 для всех) (рисунок 6C).

Функциональный анализ генов хаба

Мы дополнительно проанализировали биологическую функцию гена Hub с помощью базы данных metascape, выявив, что эти гены в основном связаны с цитокино-опосредованными сигнальными путями и кальциевыми сигналами (см. рисунок 7A и Таблица 3). Затем были использованы сигнатуры типов клеток для обогащения транскрипционных регуляторных факторов хаб-гена, показывая, что гены хаба в основном связаны с клеткой, похожей на 24W C11 paneth, развивающимися макрофагами сердца cui и нейротипами манно среднего мозга hmgl (Рисунок 7B). Анализ обогащения заболеваний базы данных DisGeNET показал, что гены хаба связаны с кожными поражениями, инфекциями вируса Эпштейна-Барра и энцефалитом клещей (рисунок 7C). Анализ характеристик тканей базы данных PaGenBase показал, что гены хаба в основном обогащаются в селезёнке, крови и легких (рисунок 7D). Кроме того, анализ базы данных TRRUST выявил, что RELA и NFKB1 являются основными транскрипционными факторами, регулирующими гены хаба (рисунок 7E).

ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ:

Обработанная матрица подсчёта предоставлена в виде дополнительных файлов (Дополнительный файл 1 и Дополнительный файл 2). Все остальные данные подробно представлены в статье. Исходные данные секвенирования доступны соответствующим автором по разумному запросу.

Рисунок 1: Анализ DEGs. (A) Здоровые бляшки и атеросклеротические бляшки, дифференциальная карта вулкана гена, повышенная регуляция 2097, понижена 1616 (|log2FC| > 1, P .< 0,05). (B) Тепловая карта топ-20 генов с дифференциальной экспрессией повышенной и пониженой регуляцией. (C) Анализ корреляции выборок. (D) Корреляция между коэкспрессированными генными модулями и фенотипами была проанализирована WGCNA. (E) Анализ PCA (группа NA значительно отличалась от группы AP). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Анализ KEGG. Анализ обогащения путей KEGG проводился отдельно на повышенных (A) и пониженных (B) дифференциально экспрессированных генах в этой группе заболевания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Анализ GSEA. (A) Анализ GSEA показал, что основные гены в экспериментальной группе были в основном обогащены в верхней части, что демонстрирует тенденцию к повышению регуляции. (B) В контрольной группе основные гены в основном обогащались внизу и демонстрировали нисходящую тенденцию. В заключение, воспалительные гены были повышены в экспериментальной группе (AP) и понижены в контрольной группе (NA). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Схема сети PPI. (A) Окрашен по идентификатору кластера, где узлы с одним и тем же идентификатором кластера обычно расположены близко друг к другу. (B) Раскраска с P-значениями, когда элементы с большим количеством генов имеют более значимые P-значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: анализ MCODE DEG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Анализ генов хаба. (A) Топ-20 генов хаба (левая панель) и верхняя 10 гена хаба (правая панель), полученные методом расчёта степеней через плагин CytoHubba в Cytoscape, которые в основном связаны с иммунитетом и воспалением. (B) Пересечение генов хаба и олинковой воспалительной панели 92 выявили 5 генов пересечения. (C) Алгоритм CIBERSORT был использован для сравнения инфильтрационного количества 22 подмножеств иммунных клеток между группами AP и NA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7: Биоинформатический анализ генов хаба. (A) Функциональная аннотация генов хаба с использованием базы данных Metascape. (B) Анализ обогащения транскрипционных регуляторов, связанных с генами хаба, на основе сигнатур типов клеток. (C) Анализ обогащения заболеваний хаб-генов, проведённый с помощью базы данных DisGeNET. (D) Тканевые специфические паттерны экспрессии хаб-генов, выявленные через базу данных PaGenBase. (E) Транскрипционная регуляторная сеть генов-хабов, анализируемая с использованием базы данных TRRUST. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

MCODE	ВПЕРЁД	Описание	Журнал10(P)
MCODE_1	R-HSA-629597	Высокопроницаемые кальций никотиновые ацетилхолиновые рецепторы	-10.7
MCODE_1	R-HSA-622323	Пресинаптичные никотиновые ацетилхолиновые рецепторы	-10.3
MCODE_1	R-HSA-629594	Высокопроницаемые кальций постсинаптические никотиновые ацетилхолиновые рецепторы	-10.3
MCODE_2	R-HSA-1296346	Тандемные поровые каналы калия	-10.3
MCODE_2	ВПЕРЁД:0030322	стабилизация мембранного потенциала	-9.8
MCODE_2	R-HSA-5576886	Фаза 4 — потенциал покоящей мембраны	-9.7

Таблица 1: Исходные характеристики пациентов с АП

MCODE	ВПЕРЁД	Описание	Журнал10(P)
MCODE_1	ВПЕРЁД:0030322	Высокопроницаемые кальций никотиновые ацетилхолиновые рецепторы	-19.9
MCODE_1	R-HSA-5576886	Пресинаптичные никотиновые ацетилхолиновые рецепторы	-19.6
MCODE_1	R-HSA-1296346	Высокопроницаемые кальций постсинаптические никотиновые ацетилхолиновые рецепторы	-16.7

Таблица 2: Анализ обогащения MCODE DEG.

MCODE	ВПЕРЁД	Описание	Журнал10(P)
MCODE_1	R-HSA-629597	Высокопроницаемые кальций никотиновые ацетилхолиновые рецепторы	-10.7
MCODE_1	R-HSA-622323	Пресинаптичные никотиновые ацетилхолиновые рецепторы	-10.3
MCODE_1	R-HSA-629594	Высокопроницаемые кальций постсинаптические никотиновые ацетилхолиновые рецепторы	-10.3
MCODE_2	R-HSA-1296346	Тандемные поровые каналы калия	-10.3
MCODE_2	ВПЕРЁД:0030322	стабилизация мембранного потенциала	-9.8
MCODE_2	R-HSA-5576886	Фаза 4 — потенциал покоящей мембраны	-9.7

Таблица 3: Анализ обогащения MCODE гена хаба.

Дополнительный файл 1: Контрольная (n=3) экспрессия генов.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 2: Пациенты (n=10) Ген основной таблицы.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

С постоянным углублением исследований AP новые цитокины постоянно обнаруживаются в AP, и воспаление стало важным фактором в возникновении и развитии AS^21,22. Активация альбумина может разорвать связь между эндотелиальными клетками и сосудистым интимным матриксом и способствовать отслаиванию эндотелиальных клеток от сосудистой интимы. Индуцированное сосудистое интимное^{повреждение 23,24}. Воспаление индуцирует окислительную модификацию ЛПНП-C, а модифицированный ЛПНП-C приводит к воспалительному процессу внутри интимы артерии, тем самым ускоряя образование^{ПНП 25}. Нестабильные бляшки могут в конечном итоге разорваться и вызвать ACS при воздействии внутренних и внешних^{причин 26}. Во время разрыва бляшки макрофаги, сосудистые гладкомышечные клетки (VSMC) и лимфоциты выделяют воспалительные факторы, такие как лейкоцитарный интерлейкин-1 (IL-1), IL-6, межсосудистый фактор адгезии-1 и фактор межклеточной адгезии-1. Одновременно экспрессия лейкоцитного интегрина (CD11b/CD18), рецептора на моноцитах и гранулоцитах,^{увеличивается на 27,28}. Однако молекулярный механизм воспаления, приводящего к образованию АП, остаётся дальнейшим изучением.

Возникновение и развитие АП, вызванного воспалением, представляет собой сложный процесс многофакторного воздействия, многогенного изменения и многоступенчатого заболевания, особенно тесно связанных с аномальной экспрессией многих генов. В этом исследовании анализ RNA-Seq и биоинформатики показал, что между здоровыми контрольными тканями и AP вулканический график DEG показал 2097 генов с повышенной регулированностью и 1616 пониженных генов. Дальнейший анализ обогащения ДЭГГ показал, что ДЭГГ в основном обогащаются иммунными и воспалениями путями. Анализ хабовых генов выявил 10 ведущих хаб-генов: CXCR4, CCL4, CCL3, CCL20, CXCL1, CCL5, CXCL8, CD4, CCR2 и CCR5. Пересечение генов хаба с генами воспалительной панели 92 олинка выявило 5 распространённых генов, включая CXCL1, CCL20, TNF, CCL3 и CCL4. Эти результаты свидетельствуют о том, что факторы, связанные с воспалением, CCL3, CCL4 и CXCL1, могут играть ключевую роль в патологическом процессе АП. Анализ иммунной инфильтрации выявил особую микросреду, характеризующуюся значительным увеличением количества макрофагов M0, а также уменьшением количества CD8⁺ Т-клеток, активированных NK-клеток и отдыхающих тучных клеток внутри бляшек.

Макрофаги M0 представляют собой неактивный пул, который может легко внутренне усвоить окисленный ЛПНП и дифференцироваться в пенные клетки — характерное событие раннего^{атерогенеза 29}. Повышенная доля макрофагов M0, наблюдаемых в группе заболевания, указывает на накопление этих предшествующих клеток в микросреде бляшек. CCL4, в основном производимый активированными макрофагами и Т-клетками, служит устойчивым стимулом, поддерживающим активацию макрофагов через сигнальный путь NFκB, стимулирует экспрессию адгезионных молекул и индуцирует матриксные металлопротеиназы-2 и -9, тем самым облегчая переход макрофагов M0 в проатерогенное состояние и напрямую снижая стабильность^{бляшек 30}. Сниженная доля CD8⁺ Т-клеток может отражать подавление атеропротективных Т-клеток под влиянием CCL3. Комиссаров и др. продемонстрировали, что миграция Т-клеток в человеческие атеросклеротические бляшки происходит преимущественно по оси^{CCR5-CCL3 31}. Кроме того, Дёринг и ^др.32 выявили неканонический путь, при котором CCL17 сигнализирует через CCR8 для индуцирования экспрессии CCL3, которая, в свою очередь, подавляет регуляторную дифференцировку Т-клеток; генетическая абляция CCL3 в Т-клетках CD4⁺ увеличивала количество FoxP3⁺ Treg и ограничивала атеросклероз, тогда как введение CCL3 усугубляло заболевание и замедляло дифференцировку Treg. Этот сдвиг, вероятно, уменьшает атеропротективные Т-клетки CD8⁺, одновременно стимулируя патогенные эффекторные Т-клетки, что приводит к чистому снижению доли CD8⁺ Т-клеток, наблюдаемого в нашем анализе. Снижение активированных NK-клеток и отдыхающих тучных клеток, вероятно, отражает изменения активации, а не абсолютную потерю этих популяций. Бонаккорси и ^др.33 сообщили, что симптоматические сонные бляшки демонстрируют повышенную инфильтрацию NK-клеток и выработку IFN-γ, что напрямую связывает активацию NK-клеток с клинической нестабильностью бляшек. Для тучных клеток Wezel et ^al.34 показали, что хемокины, выделяемые активированными тучными клетками, особенно CXCL1, индуцируют рекрутацию нейтрофилов по оси CXCL1/CXCR2, тем самым усугубляя продолжающуюся воспалительную реакцию и способствуя прогрессированию и дестабилизации бляшек. Таким образом, снижение доли активированных NK-клеток и покоящих тучных клеток, вероятно, отражает их активацию, дегрануляцию или истощение в среде воспалительных бляшек, а не истинное численное истощение.

У этого исследования есть несколько ограничений. Во-первых, это исследование основано исключительно на секвенировании транскриптома и ограничено малым размером выборки. Помимо ограниченного размера выборки, следует отметить ряд технических ограничений протокола RNA-seq. Объёмная РНК-секвенция маскирует клеточную гетерогенность; Для разрешения специфической экспрессии CCL3, CCL4 и CXCL1 необходимы одноклеточные подходы. Вычислительная иммунная деконволюция (CIBERSORT) предоставляет только оценки, а не прямые измерения. Количество РНК не всегда коррелирует с уровнем белка; требуется ортогональная валидация. Будущие исследования должны учитывать эти ограничения с помощью одноклеточной транскриптомики, больших и независимых когорт, ортогональной валидации белков.

В заключение, настоящие результаты подчеркнули важную роль воспалительных факторов в патофизиологическом процессе АП. Кроме того, мы выявили центральные гены CCL3, CCL4 и CXCL1, которые могут образовывать координированную хемокиновую сеть, вызывающую атеросклероз, способствуя накоплению макрофагов M0, подавляя защитные Т-клетки и изменяя состояния активации NK-клеток и тучных клеток. В целом, эти результаты подчёркивают три хемокина как критически важные регуляторы иммунной микросреды бляшек и потенциальные терапевтические цели.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
ТРИзол	Инвитроген	15596026CN	Экстракция РНК
Спектрофотометр Nanodrop ND-2000;	Термо Фишер Сайентифик	ND2000	Обнаружение концентрации РНК
Биоанализатор Agilent 2100	Agilent	G2939BA	Контроль качества РНК
Illumina HiSeq TM 2000	Illumina	HiSeq 2000	Секвенирование транскриптома
Магнитные шарики Oligo D (T)	New England Biolabs	S1550S	Обогащение РНК