Method Article

Тест на нейтрализацию флуоресценции вируса гепатита E для измерения титра антител

DOI:

10.3791/69892

⸱

May 22nd, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Virology Laboratory, Centre for Virus Research, Therapeutics and Vaccines, Translational Health Science and Technology Institute, 2Department of Gastroenterology, All India Institute of Medical Sciences, New Delhi

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Не существует стандартного теста на нейтрализацию вируса гепатита E (HEV), нецитопатического положительного РНК-вируса. Здесь описывается тест на нейтрализацию редукции флуоресценции (FRNT), основанный на количественной оценке флуоресцентного меченого вирусного капсидного белка, для оценки эффективности анти-HEV-антител.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ нейтрализации вируса измеряет нейтрализационный потенциал антитела или смеси антител против соответствующего вируса. Это ценный метод оценки эффективности кандидатов в вакцины и нейтрализующих антител, разработанных против вируса. Тест на нейтрализацию сокращения бляшек (PRNT) — популярный метод оценки титра вирусоспецифических нейтрализующих антител. Однако PRNT невозможна для нецитопатических вирусов. Вирус гепатита E (HEV) — это одноцепочечный РНК-вирус положительного смысла, относящийся к семейству Hepeviridae. Это одна из основных причин острого вирусного гепатита во всём мире. В культуре клеток млекопитающих он не проявляет цитопатического эффекта. Вакцина против HEV доступна в Китае. Однако вакцины или терапевтические антитела против HEV недоступны в большинстве стран мира. Несколько лабораторий работают над кандидатами в вакцины против HEV. Нейтрализационный тест для оценки эффективности вакцин HEV будет очень полезным инструментом для исследователей. Здесь мы описываем тест нейтрализации редукции флуоресценции (FRNT) для оценки 50% титра нейтрализации (NT 50) антител к HEV. Для заражения клеток Huh7 использовался анти-HEV ORF2, или кроликовый IgG-нейтрализованный HEV, после чего вирусный белок ORF2 был использован иммунофлуоресцентным окрашиванием. Флуоресцентно-положительные клетки были количественно оценены в приложении ImageJ, иNT 50 оценивался в размеры 2,1 x 103. Этот метод может быть применён для оценкиNT 50 антител к HEV, присутствующих в иммунизированных мышиных сыворотках, отдельных сыворотках, восстановленных HEV, а также лабораторно произведённых антител к HEV.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вирус гепатита E (HEV) — это положительный одноцепочечный РНК-вирус, относящийся к семейству Hepeviridae 1,2. Обычно он вызывает самоограничивающий острый гепатит, но может вызвать хронический гепатит у иммуносупрессированныхлюдей 3,4. Беременные женщины имеют высокий риск развития фульминантной печёночной недостаточности, при этом уровень смертности увеличивается до 30%5. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) сообщила о примерно 19,47 миллионах случаев острого гепатита E (AHE) и 3450 смертях, вызванных HEV, в 2021году 6. HEV передаётся в развивающихся странах главным образом через загрязнённую пищу и воду из-за плохой санитарии, тогда как спорадические профессиональные инфекции в развитых странах связаны с употреблением сырого или недожаренногомяса 6. HEV классифицируется на восемь генотипов. Генотип (g) 1 и g2-HEV заражают исключительно людей. G3- и G4-HEV имеют широкий спектр хозяев, таких как человек, кролик, свиньи, дикие кабаны и олени. G5- и G6-HEV заражают диких кабанов, а G7- и G8-HEV — верблюдов. Один случай передачи вируса g7-HEV был зарегистрирован на Ближнем Востоке через употребление верблюжьего мяса и молока 7,8. Заражение HEV чаще всего распространено в странах с низким и средним уровнем дохода. В эндемичных регионах Южной и Юго-Восточной Азии, Африки и Мексики было зарегистрировано несколько вспышек водного пути, в основном вызванных G1, а реже — инфекцией G2-HEV. Случаи профессиональных спорадических инфекций в развитых странах Европы и Восточной Азии в основном вызваны g3-HEV 6,7.

Геном HEV — это 7,2 кб плюс-цепочечная РНК, содержащая 7-метилгуаниновую крышку на 5′-конце с тремя открытыми рамками считывания (ORF), за которыми следует полиаденилированный 3'-конец. ORF1 кодирует неструктурный полипротеин, состоящий из семи различных доменов: метилтрансферазы (Met), Y-домена, папаин-подобной цистеиновой протеазы (PCP), V-домена, макродомена (X-домена), геликаза (Hel) и РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp). ORF2 кодирует белок капсида, отвечающий за формирование вирусного капсида. ORF3 кодирует фосфопротеин, который действует как виропорин и способствует вирусномувыходу 9. В g1-HEV присутствует дополнительная открытая рамка считывания, ORF4, которая транслируется с помощью механизма, независимого от конденсатора, с использованием внутреннего элемента, похожого на входящий участок рибосомы, расположенного внутри ORF1. Экспрессия ORF4 усиливается эндоплазматическими ретикулярными соединениями, вызывающими стресс. ORF4 был предложен для продвижения сборки комплекса репликации g1-HEV10.

Хотя HEV не размножается эффективно in vitro, некоторые штаммы вируса, выделенные у пациентов с гепатитом E, были успешно распространены в гепатоцитах, линии лёгких и эпителиальнойклеточной линии 11. Однако устойчивое распространение вируса в культивируемых клетках сложно. Для экстракорпоральных исследований использовался инфекционный клон cДНК g1-HEV (штамм Sar55), однако эффективное производство и размножение штаммов g1-HEV в культивированных клетках пока не достигнуто. Некоторые штаммы g3- и g4-HEV лучше растут в культивированныхклетках 12. Тем не менее, очищенный вирус, полученный из клеток, трансфицированных с помощью in vitro транскрибованной и закрытой p6 геномной РНК HEV, недостаточен для множественных анализов. Кроме того, все частицы HEV, полученные в клеточной культуре, имеют квази-оболочку, что влияет на их инфекционность. В отличие от этого, HEV, обнаруженный в загрязнённой пище и воде, не покрыт оболочкой и обладает высокой инфекцией. HEV, присутствующий в фекалиях пациента, не покрыт оболочкой и является частым источником естественной инфекции. Поэтому использование HEV, очищенного из экскрементов пациента, обеспечивает эффективное заражение в системе культуры млекопитающих. Наши ранние исследования показали надёжность очищенных фекалиями пациента g1-HEV в количественной оценке вирусной репликации в клетках гепатомы человека (Huh7). Очищенный вирус, хранящийся при -80 °C, сохраняет инфекционность в течение нескольких лет и использовался в нескольких независимых исследованиях для оценки репликациивирусов 10,13,14,15. В этом исследовании был разработан анализ нейтрализации HEV, используя очищенный g1-HEV, полученный от пациента. Вирус был очищен, титрирован, охарактеризован и хранён в аликвотах при температуре -80 °C для будущего использования в нейтрализационных анализах. Поскольку HEV не является цитопатической, традиционный метод PRNT не полезен для оценки потенциала нейтрализации вируса антител к HEV. Было проведено несколько попыток разработать нейтрализационные анализы для HEV, включая анализ нейтрализации на основе цитометрии потока, анализ на основе антигенного ELISA для обнаружения pORF2, секретируемого в клеточных супернатантах, бинтационный анализ на основе ELISA, анализ на основе RT-PCR и анализ на основе флуоресценции 16,17,18,19,20. Анализ на основе ELISA косвенно обнаруживает связывание антител для оценки функциональной нейтрализации вируса, но не может измерить реальную инфекцию. Метод проточной цитометрии обычно измеряет процент заражённых клеток с помощью псевдовируса. Метод нейтрализации на основе RT-ПЦР более сложный, чем FRNT; Следовательно, вероятность ошибки обработки выше. С другой стороны, описанный здесь метод FRNT ограничен доступностью высокотитровых инфекционных вирусов и возможностей визуализации. Тем не менее, это эффективный метод измеренияNT 50 антител к HEV.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Было получено одобрение институционального этического комитета (IEC) на сбор образца кала у пациента, инфицированного HEV, госпитализированного в отделение гастроэнтерологии AIIMS, Нью-Дели. Информированное согласие было получено от участвующих в исследовании пациентов. Детали реактивов и используемого оборудования приведены в Таблице материалов.

1. Изоляция и количественная оценка вирусов

  1. С информированным согласием получите образец кала у пациента, инфицированного HEV, для очистки вируса.
  2. Повторно суспензировать образец фекалия в фосфатно-буферном физиологическом растворе Дульбекко (DPBS) при 10% конечной концентрации (w/v) и центрифуге при 7800 x г в течение 1 часа при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с образцами фекалий HEV используйте перчатки и очищайте рабочую зону 70% этанолом после работы (выполняйте все этапы внутри шкафа с биобезопасностью).
  3. Соберите супернатант и пропустите его через фильтр 0,45 мкм.
  4. Добавьте 8% PEG6000 в 0,4 млн NaCl в вирусный супернатант и инкубировать 16 часов при 0 °C.
  5. Центрифугуйте образец при 18 000 x g в течение 30 минут при 4 °C.
  6. Удалите супернатант и снова суспензируйте гранулу в 40 мл Modified Eagle Medium (DMEM) от Dulbecco.
  7. Концентрируйте суспензию до объёма 5 мл с помощью тангенциальной фильтрации (TFF) с помощью мембранного картриджа на 30 кДа. Фильтруйте через фильтр 0,2 мкм внутри шкафа для биобезопасности, производите аликвоты и храните при -80 °C. Используйте один аликвот для выделения полной РНК и проведения RT-qPCR.
  8. Используйте многократные разбавления плазмиды pSK-HEV2 [pBluscript-вектор, содержащий кДНК инфекционного клона g1-HEV (Genbank ID: AF444002.1)] (от 1 ng до 0,000001 ng ДНК/реакция при 10-кратном последовательном разбавлении) для построения стандарта количественной оценки вирусной РНК.
  9. Постройте график с количеством ДНК pSK-HEV2 по оси X и соответствующими значениями Ct по оси Y. Экстраполировать концентрацию вирусной РНК из стандартного графика.
  10. Количественно определите уровень геномной РНК HEV по стандартному графику и вычислите количество копии вируса по следующей формуле: количество копий = ng*(число/моль) / основания *(ng/g)*(g/моль оснований).

2. Заражение клеток Huh7 g1-HEV

  1. Возьмите термофлягу T75 с элементами Huh7. Проверьте под микроскопом, совпадают ли клетки и здоровы.
  2. Удалять носитель с помощью аспиратора (выполняйте все этапы в шкафу биобезопасности). Добавьте 10 мл DPBS, переверните и удалите.
  3. Добавьте 1 мл раствора трипсина с 0,05%, чтобы равномерно распределиться по поверхности.
  4. Инкубировать внутри инкубатора сCO2 в течение 30–60 секунд, пока клетки не отсоединятся на 90%.
  5. Добавьте 5 мл полной среды, равномерно распределите её по всей поверхности T75 и несколько раз пипеткой, чтобы получить единородную популяцию из одной клетки, свободную от агрегатов.
  6. Перенесите подвеску элемента в коническую трубку объёмом 50 мл, центрифугу при 200 x g в течение 5 минут при комнатной температуре.
  7. Аспирировать культурную среду из конической трубки внутри шкафа биобезопасности.
  8. Добавьте 5 мл полного материала в трубку и подвесите ячейки до равномерного подвеса с помощью мягкой пипетки.
  9. Возьмите 10 мкл суспензии клеток и поставьте его на стекло ячейки. Посчитайте ячейки в 4 квадрантах, вычислите среднее значение/мл.
  10. Семена 0,5 x 106 клеток/колодец пластины с 6 лунками в 2 мл DMEM (дополненно 10% FBS).
  11. На следующий день удалите среду, промывайте в 1 мл DPBS и добавляйте 50 мкл вируса g1-HEV (эквивалент 4,5 × 104геномных копий очищенного g1-HEV) в 1 мл безсывороточной среде (SFM).
  12. Инкубировать клетки в инкубаторе с 5%CO2 при 37 °C в течение 1 часа.
  13. Промыйте клетки 500 мкл DPBS, затем добавьте 2 мл полного материала (DMEM с добавлением 2% FBS).
  14. Инкубировать клетки в течение 72 часов в инкубаторе с 5%CO2 при 37 °C.
  15. Переходите к следующим анализам.

3. RT-qPCR анализ

  1. Удалите почвенную среду с пластины с 6 лунками (начиная с шага 2.15) и промывайте клетки 1 мл DPBS.
  2. Добавьте 1 мл реагента TRI непосредственно на пластину с 6 лунками для лизирования клеток. Несколько раз пипетируйте лизат вверх и вниз, затем перенесите в микроцентрифугную трубку объемом 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Реагент TRI токсичен при вдыхании, проглатывании или контакте с кожей. Используйте защитные перчатки во время использования реагента и избегайте дыхательных паров. Желательно использовать внутри химической вытяжки. Вся пластиковая посуда должна быть не содержащей РНК.
  3. Инкубировать образцы при комнатной температуре в течение 5 минут. Добавить 0,2 мл хлороформа, надёжно закрыть пробирку, затем провести вихрь на 10–15 секунд (хлороформ опасен и токсичен; обрабатывается с надлежащей СИЗ). Инкубировать в течение 2–3 минут.
  4. Центрифугуйте образцы в течение 15 минут при 12 000 × г при 4 °C. Перенесите водную фазу в новую микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл. Добавьте 0,5 мл изопропанола в водную фазу и хорошо перемешайте, несколько раз перевернув трубку.
  5. Инкубировать 10 минут при комнатной температуре.
  6. Центрифуга в течение 10 минут при 12 000 × г при 4 °C. Отбросьте супернатант.
  7. Повторно суспензировать гранулу в 1 мл 75% этанола. Центрифуга на 5 минут при 7500 × г при 4 °C. Отбросьте супернатант.
  8. Сушите РНК-гранулу на воздухе в течение 5–10 минут.
  9. Суспензировать гранулу в воде без нуклеазы 50 мкл (NFW), инкубировать при 55 °C в течение 10 минут, смешивать вручную и измерять концентрацию РНК с помощью спектрофотометрии.
  10. Выполните одноступенчатое RT-qPCR на базе зонда TaqMan, используя следующие праймеры:
    FP g1-HEV: 5′TATACTCGAGGGTGCCGATCGGTCCC3′;
    g1-HEV RP: 5′TATACCATGGCATCTGGCAGCAAGCTCAG3′;
    зонд g1-HEV: 5′[FAM] TTGACGCCTGGGAGCGGAATCACC [BHQ1]3′; Рибонуклеаза P (RP) FP: 5′AGATTTGGACCTGCGAGCG3′;
    RP: 5′GAGCGGCTGTCTCCACAAGT3′;
    RP зонд: 5′[FAM]TTCTGACCTGAAGGCTCTCTGCGCCG[BHQ1]3′.
  11. Рассчитайте относительную количественную оценку РНК g1-HEV с помощью метода 2−ΔΔCT .

4. Иммунофлуоресцентный анализ (IFA)

  1. Разделите ячейки Huh7, как описано в предыдущих шагах.
  2. Поместите стеклянный покров микроскопического класса в пластину на 12 лунок и засейте 0,2 × 106 клеток/скважина в полной среде объёмом 1 мл (DMEM с добавлением 10% FBS).
  3. Инфицировать клетки 1,8 × 10 копиями4 генома очищенного g1-HEV в 500 мкл SFM. Инкубировать клетки в инкубаторе с 5%CO2 при 37 °C в течение 1 часа.
  4. Промой клетки три раза 500 мкл DPBS.
  5. Добавьте 2 мл полного материала (DMEM с добавлением 2% FBS).
  6. Инкубировать клетки в течение 72 часов в инкубаторе с 5%CO2 , 37 °C.
  7. Промывайте клетки три раза с 500 мкл DPBS, инкубируя 5 минут при комнатной температуре между каждым промывкой.
  8. Добавьте 500 мкл 4% ПФА (параформальдегида) в клетки и инкубировать 20 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 4% PFA вреден при вдыхании, вызывает раздражение кожи и глаз, а также может вызвать аллергическую кожную реакцию. Для безопасности при использовании реагента надевайте защитные перчатки и защитные глаза и избегайте дыхательных паров.
  9. Промыйте клетки с 500 мкл DPBS, три раза по 5 минут каждая, и инкубуйте в DPBS 30 минут.
  10. Добавьте в клетки блокирующий раствор 250 мкл (5% нормальной козьей сыворотки, 0,5% BSA, 0,3% тритон X-100 в DPBS) и инкубировать 1 час при комнатной температуре (RT).
  11. Удалите блокирующий раствор, промыйте один раз 500 мкл DPBS и инкубируют клетки первичным антителом 250 мкл (DPBS, 0,3% тритон X-100, 5% BSA, 0,5% нормальной козьей сыворотки, разбавление антитела против ORF2 1:500 или кроличьего IgG) на ночь при 4 °C.
  12. Промой клетки 500 мкл DPBS три раза по 5 минут каждая.
  13. Инкубировать клетки вторичными антителами (DPBS, 0,3% Triton X-100, 5% BSA, 0,5% Normal Goat Serum, разбавление 1:1000 козьего антитела Alexa Fluor 594) в течение 1 часа при RT.
  14. Промой клетки три раза с помощью DPBS по 5 минут каждая. Добавьте 10 мкл реагента Prolong gold Antifade с раствором DAPI (4′,6-диамидино-2-фенилиндол) в стеклянное стекло. На стеклянных стеклянных стеклах установите ячейки с прикрытием, содержащие приспособление к раствору DAPI, избегая воздушных пузырьков.
  15. Запечатайте накладку краской ногтей.
  16. Получайте флуоресцентные изображения в конфокальном микроскопе с объективом 60x.
  17. Настраивайте микроскоп на визуализацию и получение флуоресцентных сигналов.
  18. Сначала сфокусируйте ядра в затворе, соответствующие имитационным клеткам (неинфицированным), при увеличении в 60 раз. Отрегулируйте пороговое напряжение и лазер так, чтобы фоновый флуоресцентный сигнал не был виден. Проверьте контрольный антител (кроликовый IgG) слайд и убедитесь, что фоновый флуоресцентный сигнал не виден.
  19. Визуализировать слайды клеток, инфицированных HEV, без изменения вышеуказанных параметров. Получите изображения в размере 1028 x 1028 пикселей.

5. Тест нейтрализации редукции флуоресценции (FRNT)

  1. Нейтрализация вируса и инфекция клеток Huh7
    1. Разделите ячейки Huh7, как описано в предыдущих шагах. Поместите накладку в 12-ядровую пластину и посадите 0,2 × 106 ячеек/скважины в полном среде объёмом 1 мл (DMEM + 10% FBS).
    2. На следующий день приготовьте 10-кратное серийное разбавление антител (анти-ORF2 и кроличий IgG) в SFM с начальной концентрацией антител 25 мкг/мл в шагах 1:10 до разбавления 1:105 . Конечный объём разбавления должен составлять 100 мкл.
    3. Добавьте 1,8 x 104 геномных копий, эквивалентных очищенному g1-HEV, к каждому разбавлению антител.
    4. Инкубировать смесь антител и вируса при 5%CO2 инкубатора, 37 °C в течение 1 часа.
    5. Удалите пластину с 12 лунками, содержащую элементы Huh7 (засеянную накануне), и промыйте клетки 500 мкл DPBS.
    6. Добавьте смесь антитела и вируса в клетки и поместите пластину в инкубатор с 5%CO2 при 37 °C на 1 час.
    7. Промывайте ячейки с 500 мкл DPBS.
    8. Добавьте DMEM + 2% FBS-среды в клетки и инкубируете пластину в инкубаторе с 5%CO2 при 37 °C в течение 72 часов.
    9. Выполните IFA, как указано в разделе 4 (шаг 4.7 и далее).
    10. Получите флуоресцентные изображения 5 случайных полей с помощью 10-кратного объектива с разрешением 1028 x 1028 пикселей.
    11. Сохраняйте изображения в формате JPEG/TIFF. Количественно определите количество флуоресцентных пятен с помощью анализа ImageJ, как описано ниже.
    12. Для анализа изображения в ImageJ преобразите RGB-изображение в 8-битное. Нажмите на изображение > введите > 8-бит.
    13. Отрегулируйте порог изображения. Нажмите на изображение > отрегулировать > порог. Выберите нижний порог 40, верхний — 255.
    14. Для подсчёта выберите Анализировать> Анализировать частицы. Выберите отображение результатов, очистку результатов, суммирование, исключение по краям и композитные ROI. Снимите опцию Add to manager, включите дыры и наложите. Нажмите OK, и появится счётчик люминесцентных пятен.
  2. ОценкаNT 50
    1. Вычислите % нейтрализации каждого разбавления по следующей формуле:
      % нейтрализации = 100-[((ORF2-положительные клетки в разбавлении)⁄(ORF2-положительные клетки в контроле вирусов)) X 100]
    2. ВычислимNT 50 по следующей формуле:
      log10(NT 50) = log10D1+(50-N1 ⁄ N2-N1) X (log10D2-log10D1)
      где D1 = разбавление, при котором % нейтрализации ниже 50
      D2 = Разбавление, при котором % нейтрализации выше 50
      N1= % Нейтрализация ниже 50
      N2= % нейтрализации выше 50
    3. Вычислите антилогаритм логарифма10 NT 50 с помощью формулы:
      NT 50= 10log10(NT 50)
    4. Постройте график (среднего±SD) всех полей.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инфекция клеток Huh7 g1-HEV и характеристика вируса

G1-HEV был выделен из образца фекалий с помощью серии шагов, как показано (рисунок 1A). Количество геномной копии очищенного g1-HEV оценивалось с помощью RT-qPCR, за которым следовало хранение при -80 °C. Для подтверждения вирусной инфекции и репликации клетки Huh7 были инфицированы 1,8 × 10 эквивалентами копий4 генома очищенного g1-HEV запаса в течен...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FRNT — это метод на основе иммунного окрашивания для оценки нейтрализующего потенциала антител. Он использовался для оценки значения NT50 антител против множества вирусов, включая вирус денге (DENV), тяжелый острый респираторный синдром коронавирус-2 (SARS-CoV-2) и вирус японского энцефалита (JEV)23,24,25. В этом методе вирус инкубируется тестовым антителом (или сывороткой), после чег...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о конкурирующих интересах.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование частично финансировалось грантом Совета по содействию исследованиям биотехнологической индустрии Департамента биотехнологий правительства Индии, присуждённым MS, S и BN. Исследования в лаборатории MS поддерживаются основным грантом Института трансляционных наук и технологий здравоохранения. SA поддерживается должностью научного сотрудника проекта, финансируемой Индийским советом по медицинским исследованиям правительства Индии. UB поддерживается старшей научной стипендией Департамента биотехнологий правительства Индии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 мл микрофужные пробиркиAxygenMCT-150-C
12-лунковая культуральная чашаCorning3512
Инкубатор-качалка 37 градусовThermo Scientific50163013
4',6-диамидино-2-фенилиндолAbcamAB104139DAPI
50 мл центрифугальная пробиркаFalcon352070
6-лунковая культуральная чашаCorning3516
Алекса флуор 594 вторичное IgG антителоThermo ScientificA-11012
Анти-ORF2 антителоGenscriptNAКастомное синтезированное Genscript и характеризованное в нашей лаборатории14
Анти-кроликовое IgG антителоGenscriptNA
Бычий сывороточный альбуминHIMEDIAMB083BSA
Конфокальный микроскопOlympusFV3000
DMEM, высокий глюкозHIMEDIAAL007A
Фетальный бычий сывороточный альбуминGIBCO16000-044FBS
ImageJ 1.54gImageJ.org (Wayne Rasband и соавторы, NIH, США)
Нормальная козлиная сывороткаHIMEDIARM-10701
ПараформальдегидHIMEDIAGRN3660PFA
Фосфатный буферный раствор солевого раствора pH 7.4HIMEDIATL1006PBS
Полиэтиленгликоль 6000SIGMA81255PEG6000
SOLIScript 1-step Probe KitSOLIS BIODYNE08-57-00250
TRI реагентMolecular Research CentreTR118
Тритон X100SIGMAX100
Трипсин-ЭДТАGIBCO25300-54

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, D. B., et al. International Committee on Taxonomy of Viruses Hepeviridae Study Group. Consensus proposals for classification of the family Hepeviridae. J Gen Virol. 95 (Pt 10), 2223-2232 (2014).
  2. Nan, Y., Zhang, Y. J. Molecular biology and infection of hepatitis E virus. Front Microbiol. 7, 1419(2016).
  3. Kamar, N., et al. Hepatitis E virus and chronic hepatitis in organ-transplant recipients. N Engl J Med. 358 (8), 811-817 (2008).
  4. Purcell, R. H., Emerson, S. U. Hepatitis E: An emerging awareness of an old disease. J Hepatol. 48 (3), 494-503 (2008).
  5. Nimgaonkar, I., Ding, Q., Schwartz, R. E., Ploss, A. Hepatitis E virus: Advances and challenges. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 15 (2), 96-110 (2018).
  6. Hepatitis E. , WHO. Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/hepatitis-e (2025).
  7. Songtanin, B., et al. Hepatitis E virus infections: Epidemiology, genetic diversity, and clinical considerations. Viruses. 15 (6), 1389(2023).
  8. Lee, G. H., et al. Chronic infection with camelid hepatitis E virus in a liver transplant recipient who regularly consumes camel meat and milk. Gastroenterology. 150 (2), 355-357 (2016).
  9. Zhou, Z., Xie, Y., Wu, C., Nan, Y. The hepatitis E virus open reading frame 2 protein: Beyond viral capsid. Front Microbiol. 12, 739124(2021).
  10. Nair, V. P., et al. Endoplasmic reticulum stress induced synthesis of a novel viral factor mediates efficient replication of genotype-1 hepatitis E virus. PLoS Pathog. 12 (4), e1005521(2016).
  11. Meister, T. L., et al. Cell culture systems for the study of hepatitis E virus. Antiviral Res. 163, 34-49 (2019).
  12. Fu, R. M., Decker, C. C., Dao Thi, V. L. Cell culture models for hepatitis E virus. Viruses. 11 (7), 608(2019).
  13. Kaushik, N., et al. Zinc salts block hepatitis E virus replication by inhibiting the activity of viral RNA-dependent RNA polymerase. J Virol. 91 (21), 10-1128 (2017).
  14. Gupta, J., et al. Antiviral activity of zinc oxide nanoparticles and tetrapods against the Hepatitis E and Hepatitis C viruses. Front Microbiol. 13, 881595(2022).
  15. Ansari, S., et al. Network controllability analysis reveals the antiviral potential of Etravirine against hepatitis E virus infection. mSystems. 10 (9), e00438-25(2025).
  16. Gremmel, N., et al. Hepatitis E virus neutralization by porcine serum antibodies. J Clin Microbiol. 61 (11), e00373-23(2023).
  17. Cai, W., et al. A high-throughput neutralizing assay for antibodies and sera against hepatitis E virus. Sci Rep. 6 (1), 25141(2016).
  18. Liu, C., et al. An optimized high-throughput neutralization assay for hepatitis E virus (HEV) involving detection of secreted Porf2. Viruses. 11 (1), 64(2019).
  19. Meng, J., Dubreuil, P., Pillot, J. A new PCR-based seroneutralization assay in cell culture for diagnosis of hepatitis E. J Clin Microbiol. 35 (6), 1373-1377 (1997).
  20. Emerson, S. U., et al. Putative neutralization epitopes and broad cross-genotype neutralization of Hepatitis E virus confirmed by a quantitative cell-culture assay. J Gen Virol. 87 (3), 697-704 (2006).
  21. Deshmukh, T. M., et al. Immunogenicity of candidate hepatitis E virus DNA vaccine expressing complete and truncated ORF2 in mice. Vaccine. 25 (22), 4350-4360 (2007).
  22. Gupta, J., et al. Expression, purification and characterization of the hepatitis E virus like-particles in the Pichia pastoris. Front Microbiol. 11, 141(2020).
  23. Guo, J., et al. Fluorescence Reduction Neutralization Test: A novel, rapid, and efficient method for characterizing the neutralizing activity of antibodies against dengue virus. Curr Issues Mol Biol. 47 (3), 140(2025).
  24. Bewley, K. R., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by wild-type plaque reduction neutralization, microneutralization and pseudotyped virus neutralization assays. Nat Protoc. 16 (6), 3114-3140 (2021).
  25. Islam, M. D., et al. Neutralizing antibodies against the Japanese encephalitis virus are produced by a 12ákDa E coli expressed envelope protein domain III (EDIII) tagged with a solubility-controlling peptide. Vaccine. 56, 127143(2025).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hepatitis E VirusNeutralization AssayFluorescence ReductionNeutralizing Antibody TitersVirus NeutralizationAntibody EfficacyVaccine EvaluationImmunofluorescent StainingORF2 ProteinHuh7 Cells

Related Articles