Тест на нейтрализацию флуоресценции вируса гепатита E для измерения титра антител

Summary

Не существует стандартного теста на нейтрализацию вируса гепатита E (HEV), нецитопатического положительного РНК-вируса. Здесь описывается тест на нейтрализацию редукции флуоресценции (FRNT), основанный на количественной оценке флуоресцентного меченого вирусного капсидного белка, для оценки эффективности анти-HEV-антител.

Abstract

Анализ нейтрализации вируса измеряет нейтрализационный потенциал антитела или смеси антител против соответствующего вируса. Это ценный метод оценки эффективности кандидатов в вакцины и нейтрализующих антител, разработанных против вируса. Тест на нейтрализацию сокращения бляшек (PRNT) — популярный метод оценки титра вирусоспецифических нейтрализующих антител. Однако PRNT невозможна для нецитопатических вирусов. Вирус гепатита E (HEV) — это одноцепочечный РНК-вирус положительного смысла, относящийся к семейству Hepeviridae. Это одна из основных причин острого вирусного гепатита во всём мире. В культуре клеток млекопитающих он не проявляет цитопатического эффекта. Вакцина против HEV доступна в Китае. Однако вакцины или терапевтические антитела против HEV недоступны в большинстве стран мира. Несколько лабораторий работают над кандидатами в вакцины против HEV. Нейтрализационный тест для оценки эффективности вакцин HEV будет очень полезным инструментом для исследователей. Здесь мы описываем тест нейтрализации редукции флуоресценции (FRNT) для оценки 50% титра нейтрализации (_{NT 50}) антител к HEV. Для заражения клеток Huh7 использовался анти-HEV ORF2, или кроликовый IgG-нейтрализованный HEV, после чего вирусный белок ORF2 был использован иммунофлуоресцентным окрашиванием. Флуоресцентно-положительные клетки были количественно оценены в приложении ImageJ, и_{NT 50} оценивался в размеры 2,1 x 10³. Этот метод может быть применён для оценки_{NT 50} антител к HEV, присутствующих в иммунизированных мышиных сыворотках, отдельных сыворотках, восстановленных HEV, а также лабораторно произведённых антител к HEV.

Introduction

Вирус гепатита E (HEV) — это положительный одноцепочечный РНК-вирус, относящийся к семейству Hepeviridae ^1,2. Обычно он вызывает самоограничивающий острый гепатит, но может вызвать хронический гепатит у иммуносупрессированных^{людей 3,4}. Беременные женщины имеют высокий риск развития фульминантной печёночной недостаточности, при этом уровень смертности увеличивается до 30^%5. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) сообщила о примерно 19,47 миллионах случаев острого гепатита E (AHE) и ....

Protocol

Было получено одобрение институционального этического комитета (IEC) на сбор образца кала у пациента, инфицированного HEV, госпитализированного в отделение гастроэнтерологии AIIMS, Нью-Дели. Информированное согласие было получено от участвующих в исследовании пациентов. Детали реактивов и используемого оборудования приведены в Таблице материалов.

1. Изоляция и количественная оценка вирусов

1. С информированным согласием получите образец кала у пациента, инфицированного HEV, для очистки вируса.
2. Повторно суспензировать образец фекалия в фосфатно-буферном фи....

Results

Инфекция клеток Huh7 g1-HEV и характеристика вируса

G1-HEV был выделен из образца фекалий с помощью серии шагов, как показано (рисунок 1A). Количество геномной копии очищенного g1-HEV оценивалось с помощью RT-qPCR, за которым следовало хранение при -80 °C. Для подтверждения вирусной инфекции и репликации клетки Huh7 были инфицированы 1,8 × 10 эквивалентами копий⁴ генома очищенного g1-HEV запаса в течен.......

Discussion

FRNT — это метод на основе иммунного окрашивания для оценки нейтрализующего потенциала антител. Он использовался для оценки значения NT₅₀ антител против множества вирусов, включая вирус денге (DENV), тяжелый острый респираторный синдром коронавирус-2 (SARS-CoV-2) и вирус японского энцефалита (JEV⁾23,24,25. В этом методе вирус инкубируется тестовым антителом (или сывороткой), после чег.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Микрофужные трубки объемом 1,5 мл	Axygen	MCT-150-C
12-ячественная клеткавая культурная чаша	Корнинг	3512
Шейкер инкубатора под углом 37 градусов	Thermo Scientific	50163013
4′,6-диамидино-2-фенилиндол	Abcam	AB104139	DAPI
Центрифугная трубка объемом 50 мл	Falcon	352070
Чашка для культивирования клеток с 6 лунками	Corning	3516
Вторичное антитело IgG из муки Alexa 594	Thermo Scientific	A-11012
Антитела к анти-ORF2	Genscript	NA	Индивидуально синтезировано Genscript и охарактеризовано в нашей лаборатории14
Антитела IgG против кроликов	Genscript	NA
Бычий сывороточный альбумин	HIMEDIA	MB083	BSA
Конфокальный микроскоп	Олимп	FV3000
DMEM, высокий уровень глюкозы	HIMEDIA	AL007A
Сыворотка плода для быка	GIBCO	16000-044	FBS
ImageJ 1.54g	ImageJ.org (Уэйн Расбанд и авторы, NIH, США)
Обычная козья сыворотка	HIMEDIA	RM-10701
Параформальдегид	HIMEDIA	GRN3660	PFA
pH солевого раствора с фосфатным буфером 7,4	HIMEDIA	TL1006	PBS
Полиэтиленгликоль 6000	SIGMA	81255	PEG6000
SOLIScript 1-step Probe Kit	СОЛИС БИОДАЙН	08-57-00250
Реагент TRI	Молекулярный исследовательский центр	TR118
Triton X100	SIGMA	X100
Trypsin-EDTA	GIBCO	25300-54