Здесь мы представляем протокол для выделения, очистки и культуры первичных маргинальных клеток из мышиной stria vascularis, а также для установления in vitro моделей окислительного стресса и клеточного старения для изучения нарушений латеральной стенки кохлеарной стенки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение и культивирование первичных маргинальных клеток Stria vascularis у неонатальных мышей
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Строя васкулярис — ключевая структура внутреннего уха, отвечающая за генерацию и поддержание эндокохлеарного потенциала (ЭП), и её дисфункция тесно связана с различными формами потери слуха. Stria vascularis состоит из маргинальных клеток, промежуточных и базальных клеток, среди которых маргинальные клетки играют центральную роль в генерации и поддержании ЭП. Поэтому установление первичной модели культуры маргинальных клеток in vitro крайне важно для изучения биологических характеристик Stria vascularis и её участия в нарушениях, связанных с потерей слуха.
В этом исследовании мы успешно выделили и культивировали первичные маргинальные клетки из Stria vascularis у новорождённых мышей. Пробные ткани были получены методом микродиссекции, переварены коллагеназой типа II и очищены дифференциальной пластиной для удаления большинства фибробластов, при этом культивированные клетки достигали слияния более 80% к 7-му дню. Иммунофлуоресцентное окрашивание показало стабильную экспрессию цитокератина 18 (CK18) и подсемейства каналов с калиевым напряжением Q Member 1 (KCNQ1), подтверждая успешное выделение, высокую чистоту и сохранение физиологической функции маргинальных клеток.
На основе этой модели были установлены модели in vitro окислительного стресса и клеточного старения с использованием перекиси водорода (H 2O2) и D-галактозы соответственно. Обработанные клетки демонстрировали значительно повышенный уровень внутриклеточных реактивных видов кислорода (ROS) и положительную способность β-галактозидазы, ассоциированных с старением, (SA-β-gal), что свидетельствует о высокой чувствительности первичных маргинальных клеток к окислительному стрессу и стимулам, вызывающим старение. В совокупности это исследование устанавливает стабильную и воспроизводимую систему для культивирования и моделирования первичных маргинальных клеток мышей, предоставляя надёжную in vitro платформу для изучения дисфункции Stria vascularis и связанных с ней механизмов.
Введение
В слуховой системе различные ткани улитки работают вместе, преобразуя сложные звуковые волны в электрическиесигналы 1. Stria vascularis регулирует ионный состав эндолимфы и генерирует эндо-кохлеарный потенциал (EP), тем самым поддерживая гомеостаз кохлеарного тела и обеспечивая нормальное функционирование внутренних и внешних волосковых клеток. Он состоит из трёх различных типов клеток: маргинальных клеток, промежуточных и базальных клеток. Маргинальные клетки образуют поляризованный эпителиальный монослой, который непосредственно обращён к эндолимфе и запечатан плотными соединениями. Базолатеральная мембрана маргинальных клеток обогащается двумя ключевыми транспортерами калия — Na⁺/K⁺-АТФазой и NKCC1, которые участвуют в регулировании транспортировки ионов натрия и калия в Stria vascularis. Функция Na⁺/K⁺-АТФазы была напрямую связана с EP 2,3. Каналы KCNQ1/KCNE1 K⁺ расположены на апикальной мембране маргинальных клеток и генерируют дополнительный потенциал диффузии K⁺, способствующий формированиюEP4. Маргинальные клетки обогащаются несколькими белками, связанными с калием, и служат основной клеточной единицей, управляющей переработкой калия в кохлеарной эндолифхе. Таким образом, маргинальные клетки являются ключевыми клетками, отвечающими за генерацию и поддержание EP.
Показано, что стрия васкулярис (СВ) играет ключевую роль в патогенезе множества расстройств, связанных с сенсоневральной потерей слуха (СНХЛ), включая возрастную потерю слуха (АРХЛ), вызванную шумом (NIHL), наследственную потерю слуха (HHL) и потерю слуха, вызванную лекарствами (DIHL). Кроме того, ряд других нарушений слуха, таких как аутоиммунное заболевание внутреннего уха (AIED), аутовоспалительное заболевание внутриго уха (AID) и болезнь Меньера (MD), хотя и этиологически различаются, недавние исследования также показали участие SV в своих патогенныхмеханизмах 5,6. Поэтому крайне важно создать надёжные клеточные модели для изучения патогенеза потери слуха. Исследования показали, что снижение маргинальной плотности клеток служит сильным предиктором EP на протяжении всей жизни мыши, тогда как атрофия Stria vascularis представляет собой раннее характерное поражение при ARHL 7,8. Культура маргинальных клеток in vitro может стать надёжной моделью для изучения патогенеза ARHL и поиска потенциальных терапевтических целей. Помимо ARHL, недавние исследования выявили высокую корреляцию и возможную основную связь между stria vascularis и другими слуховыми нарушениями, что предполагает возможность более широкого применения моделей маргинальных клеток in vitro 5,9,10.
В данном исследовании описывается протокол рассечения и культивирования Stria vascularis из неонатальных мышиных улитков, за которым следует очистка маргинальных клеток с помощью дифференциального покрытия, что обеспечивает надёжную клеточную модель для исследований патологий, связанных с stria vascularis.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Новорождённые мыши (P0-3) были предоставлены компанией Biont. Все экспериментальные процедуры соответствовали Руководящим принципам по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованным Национальным институтом здоровья США (публикация NIH, пересмотренная 2011 года) и утвержденными Комитетом по этике животных больницы Жэньминь Университета Уханя (WDRM202400019).
1. Стерилизация и подготовка материалов
- Подготовьте инструменты для вскрытия, включая две пары щипцов для микродиссекции, одну пару стандартных щипцов, одну пару хирургических ножниц и одну пару ножниц для микродиссекции. Стерилизуйте все инструменты с помощью автоклава и сушите их в духовке при температуре 60 °C в течение 4 часов.
- Подготовьте 100 мл среды эпителиальной клетки среднего животного (EpiCM-a) согласно инструкциям производителя. Добавьте в базальную среду сыворотку плода (FBS), добавку для роста эпителиальных клеток (EpiCGS-a) и раствор пенициллина/стрептомицина для достижения конечной концентрации 2% FBS, 1% EpiCGS-a и 1% пенициллина/стрептомицина.
- Продезинфицируйте стадию и корпус стереомикроскопа 75% этанола. Затем поместите автоклавные инструменты для вскрытия и дезинфицированный микроскоп в биологический защитный шкаф. Подвергите все предметы ультрафиолетовому излучению в течение 30 минут, чтобы обеспечить полную стерильность перед началом процедуры вскрытия.
2. Вскрытие и изоляция височной кости для сбора слухового эпителия
- Усыпить новорождённых мышей (P0-3) после 4% анестезии изофлураном, продезинфицировать 75% этанолом и провести обезглавливание на льду. При необходимости используйте другие этически одобренные методы.
- Обездвижите голову, откройте кожу головы вдоль сагиттального шва с помощью микродисекционных ножниц, разделите кожу головы в двусторонние стороны и удалите её.
- Разрезайте голову новорождённой мыши по средней линии с помощью ножниц для микродиссекции. Удалять ткань мозга щипцем, чтобы обнажить височные кости (рисунок 1A).
- Наблюдайте двусторонние височные кости у основания черепа, удаляйте другие ненужные кости и сохраняйте височную костную ткань, содержащую улитку (рисунок 1B).
- Переместите одну височную кость в стерильную чашу диаметром 35 мм с свежим раствором сбалансированной соли Хэнка (HBSS) на льду.
- Переместите другую височную кость под микроскоп, закрепите височную костную ткань одной парой щипцов, а другую пару проведите тупое вскрытие поверхностной мышечной ткани, пока не станет видно белое полукруглое кольцо (рисунок 1C). После подтверждения положения улитки продолжайте тупую диссекцию вниз, пока не появятся прозрачные кохлеарные ткани (рисунок 1D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 2.6–2.7 следует выполнять на льду. - С помощью микродиссекционных щипцов аккуратно удалите небольшой кусочек костной стенки на апикальном повороте улитки, аккуратно введите одну сторону щипца в улитку и отделите костную стенку от мембранного лабиринта. Удалите костную стенку и удлините мембранную лабиринтную ткань в свежем сбалансированном солевом растворе Хэнка (HBSS) (рисунок 1E).
- Закрепите базилярную мембрану одной парой щипцов и аккуратно отделите сосудистую стрию другой парой щипцов. Перенесите его в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл, содержащую 1 мл раствора коллагеназы II типа II, помещённую на лёд (рисунок 1F).
- Повторяйте вышеуказанные шаги, чтобы собрать stria vascularis с другой стороны.
3. Ферментативная дезагрегация для получения маргинальных клеток Stria vascularis
- Инкубировать микроцентрифугную трубку, содержащую собранную ткань, в растворе коллагеназы типа II 1 мг/мл при 37 °C в течение 30 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор коллагеназы типа II был приготовлен путём разбавления коллагеназы типа II в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS; 2,7 мМ KCl, 2,0 мМ KH₂PO₄, 137 мМ NaCl, 10 мМ Na2HPO 4). - Центрифугуйте трубку при 300 × г на 8 минут.
- Аккуратно удалите супернатант. Добавьте 1 мл культурной среды для прекращения пищеварения, аккуратно тритурируйте для восстановления суспензии клеток и снова центрифугуйте при 300 × г в течение 8 минут.
- Аспирируйте супернатант и добавьте 1 мл свежей культуры. Тритуратуйте для получения суспензии с одной ячейкой, перенесите подвеску в коническую трубку объёмом 15 мл и добавьте дополнительную среду для регулировки общего объёма до 10 мл.
- Тщательно перемешайте суспензию ячейки с помощью многократного пипетирования, затем передайте по 1 мл суспензии в каждую скважину пластины с 6 ячеями. Культивировать клетки в 2 мл DMEM с добавлением 2% FBS, 1% EpiCGS-a и 1% раствора пенициллина/стрептомицина при 37 °C в инкубаторе с 5%CO2 .
- Заменяйте среднюю жидкость ежедневно и следите за состоянием ячейки. Кластерный рост маргинальных клеток обычно наблюдается через 2 дня после покрытия.
4. Очистка маргинальных клеток
- На третий день культуры наблюдайте появление многочисленных фибробластов в форме веретена, окружающих булыжные кластеры маргинальных клеток (рисунок 2B).
- Используя различия в скорости адгезии, аккуратно пипетируйте для частичного удаления веретенообразных фибробластов. Используя пипетку объемом 1 мл, аккуратно промывайте сбалансированный соляный раствор D-Hanks на больших площадях в каждом из четырёх квадрантов. Контролируйте очистку клетки под микроскопом и соответственно регулируйте силу и направление пипетирования. Обычно промывка на большой площади проводится дважды. После каждого круга микроскопически изучайте плотность фибробластов; Основываясь на этих наблюдениях, применяйте локализованное мягкое пипетирование к густонаселённым фибробластным участкам для достижения разрежённого и равномерного распределения по культурной тарелке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сохранилась соответствующая плотность фибробластов, так как полное удаление или чрезмерная очистка могут ограничить рост первичных клеток. Рекомендуем поддерживать примерно соотношение маргинальных клеток к фибробластам примерно 2:1. - Прекращают очистку, когда фибробласты выглядят редко распределенными между маргинальными клеточными кластерами при микроскопическом исследовании. Удалите супернатант и добавьте 2 мл свежей культурной среды для продолжения культивации.
5. Иммунофлуоресцентное окрашивание
- На второй день после очистки изучайте морфологию клеток под микроскопом. При наблюдении достаточного образования клеточных кластеров и соответствующей плотности аспирируете культурную среду и трижды промывайте клетки фосфатно-буферным солевым раствором (PBS, pH 7.4).
- Зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом на 15 минут при комнатной температуре. После удаления фиксирующего раствора промывайте клетки три раза с помощью PBS (5 минут за одну стирку).
- Пермеабилизуйте клетки с 0,5% Triton X-100 в течение 15 минут. Удалите раствор и промывайте ячейки три раза PBS (по 5 минут на одну стирку).
- Блокируйте клетки с PBS, содержащие 10% козью сыворотку, в течение 30 минут при комнатной температуре.
- Инкубировать клетки с помощью моноклонального антитела CK18 против мышей (разбавленного 1:300 в PBS, содержащем 3% козьей сыворотки) или антитела KCNQ1 (G-8) (разбавленный 1:100 в PBS с 3% козьей сывороткой) на ночь при 4 °C.
- Промывайте клетки три раза с помощью PBS (по 10 минут на одну стирку). Инкубировать с соответствующим вторичным антителом (разбавленной 1:300 в PBS с 3% козьей сывороткой) в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Удаляйте вторичные антитела и клетки для промывания три раза с помощью PBS (10 минут на одну стирку).
- Нанесите 1-2 капли монтажной среды против фейда с DAPI на стеклы, установите накладки и осмотрите образцы с помощью конфокальной лазерной системы сканирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: За исключением этапов промывания, все инкубационные растворы, включая антитела, были добавлены в объёмах, достаточных для полного покрытия клеток.
6. Обработка H2O2 и окрашивание ROS
- После 7 дней культуры, когда маргинальные клетки образовали слияющийся монослой, индуцировать окислительный стресс с помощью обработки 1 мМН 2О2. Подготовьте рабочий раствор объемом 1 мм, разбавляя 30% H2O2стандартный раствор 1:10000 в эпителиальной ячейке. Инкубировать экспериментальные группы с помощью этого рабочего раствора, одновременно обрабатывая контрольные группы только эпителиальной клеточной средой.
- После 16 часов обработки аккуратно снимите среду и промыйте клетки с помощью PBS. Оценить внутриклеточные уровни ROS в маргинальных клетках с помощью реактивного теста кислородных видов в соответствии с протоколом производителя.
- Удалите культурную среду, затем добавьте разбавленный MitoTracker Red CMXRos (митохондриально-селективный краситель) и DCFH-DA в клетки, и инкубировать при 37 °C в инкубаторе клеточной культуры в течение 30 минут.
- Промыйте клетки трижды PBS (по 5 минут каждая), установите накладки и осмотрите образцы с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа.
7. Обработка D-галактозой и окрашивание SA-β-гал
- После 7 дней культуры, когда маргинальные клетки образуют слияющийся монослой, D-галактозный порошок растворялся в среде EpiCM для получения рабочего раствора D-гал концентрацией 40 мг/мл. Инкубировать экспериментальные группы с этим раствором (2 мл на одну лунку пластины с 6 лунками, 48 часов, при 37 °C) для индуцирования клеточного старения, при этом контрольные группы используют одинаковый объём эпи-среды самостоятельно.
- После 48 часов обработки аккуратно удалите среду и промываете клетки с помощью PBS. Оценивайте клеточную старение в маргинальных клетках с помощью набора для окрашивания SA-β-gal согласно инструкциям производителя.
- Фиксируйте клетки фиксационным раствором на 15 минут при комнатной температуре. После снятия фиксирующего средства промывайте клетки три раза с помощью PBS (5 минут на одну стирку).
- Инкубировать клетки с рабочим раствором окрашивания SA-β-гал, содержащим 5% X-Gal (1 мл на лунку пластины с 6 лунками) на ночь при 37 °C в увлажнённом инкубаторе безCO2.
- Зафиксировать изображения окрашивания SA-β-гал при ярком освещении с помощью микроскопа.
8. Статистический анализ
- Для сравнения средней интенсивности иммунофлуоресценции окрашивания ROS, обработанной H₂O₂, и контрольных групп, обработанных D-галактозой, и контрольных групп по доле SA-β-гал-положительных клеток применяйте t-тесты после оценки нормальности и логарифмической нормы.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рост и морфологические особенности культивируемых клеток
Используя этот протокол, мы успешно установили первичные культуры маргинальных клеток, выделенных из мышиной улитки. На второй день культуры световая микроскопия показала, что клетки прилипли к субстрату и начали формировать скопленные колонии (рисунок 2Aa). На третий день мы очистили клетки (рисунок 2B). Последующие наблюдения в последующие дни показал...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Десятилетиями исследования потери слуха в основном сосредоточены на роли сенсорных волосковых клеток и их синаптических связях с нейронами спиральныхганглиев. Многочисленные опубликованные исследования посвящены созданию и оптимизации моделей культуры волосковых клеток in vitro, которые сыграли незаменимую роль в изучении повреждения, регенерации волосковых клеток и эффектов ототоксичныхпрепаратов 12,13...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что исследование не имеет коммерческих или финансовых конфликтов интересов.
Благодарности
Мы выражаем благодарность кафедре отоларингологии — хирургии головы и шеи Уханского университета Жэньминь (Ухань, Китай) и Исследовательского института отоларингологии и хирургии головы и шеи при больнице Уханьского университета Жэньминь (Ухань, Китай) за их щедрую поддержку и поощрение. Эта работа была поддержана Фондом строительства и инкубации Национального центра здравоохранения Китая (ZX0000000037), Национальным фондом естественных наук Китая (81700916, 82301294), Фондом естественных наук провинции Хубэй (2017CFB242) и Научно-исследовательским проектом Комиссии здравоохранения провинции Хубэй (WJ2017Q005).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Центрифуга на 15 мл | Servicebio | EP-1501-J | Использование для культуры |
| 35-мм антенна для клеточной культуры | NEST | 706001 | Использование для вскрытия |
| 4% параформальдегид | Servicebio | G1101 | Иммунофлуоресцентное окрашивание |
| Пластина с 6 колодцями | Servicebio | CCP-6H | Использование для культуры |
| Alexa Fluor 488-конъюгированное козье антитело против кроликов | Proteintech | SA00013-2 | Иммунофлуоресцентное окрашивание |
| Медиум для монтажа антифейда с DAPI | Абсин | abs9235 | Иммунофлуоресцентное окрашивание |
| Набор для подсчёта клеток 8 | Beyotime | C0037 | Использование для подсчёта ячеек |
| Коллагеназа типа II | Biosharp | BS164 | Использование для культуры |
| Система конфокального лазерного сканирования | Olympus | FV1200 | Иммунофлуоресцентное окрашивание |
| DCFH-DA | Инвитроген | C2938 | Окрашивание ROS |
| Д-гал | Solarbio | D8310 | Использование для моделирования клеток |
| Среда EpiCM-a | Sciencell | 4131 | Использование для культуры |
| Тонкие щипцы | Задний привод | F11020-11 | Использование для вскрытия |
| Козья сыворотка | Beyotime | C0265 | Иммунофлуоресцентное окрашивание |
| H2O2 | Mkbio | MM0707 | Использование для моделирования клеток |
| Сбалансированный сольный раствор Хэнка (HBSS) | Biosharp | BL561A | Использование для культуры |
| Изофлуран | Задний привод | R510-22-10 | Использование для вскрытия |
| Антитела к KCNQ1 (G-8) | Санта-Крус | SC-365186 | Иммунофлуоресцентное окрашивание |
| Микроскоп | Olympus | SZX7-1063 | Использование для вскрытия |
| Микроскоп | Olympus | IX71 | Используется для наблюдения результатов иммунофлуоресцентного окрашивания |
| MitoTracker Red CMXRos | Инвитроген | M7512 | Окрашивание ROS |
| Неонатальные мышиные щенки (P0-P3) | предоставлено BIONT | ||
| PBS | Servicebio | G4202 | Иммунофлуоресцентное окрашивание |
| Моноклональное антитело Rabbit Anti-Mouse CK18 | Proteintech | 10830-1-AP | Иммунофлуоресцентное окрашивание |
| Набор для окрашивания старения и бета;-галактозидазы | Beyotime | C0602 | Старение окрашиваний |
| Triton X-100 | Сигма-Олдрич | X100 | Иммунофлуоресцентное окрашивание |
Ссылки
- Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60 (5-6), 397-422 (2003).
- Bovee, S., et al. The stria vascularis: Renewed attention on a key player in age-related hearing loss. Int J Mol Sci. 25 (10), 5391(2024).
- Schulte, B. A., Schmiedt, R. A. Lateral wall Na,K-ATPase and endocochlear potentials decline with age in quiet-reared gerbils. Hear Res. 61 (1-2), 35-46 (1992).
- Hibino, H., et al. How is the highly positive endocochlear potential formed? The specific architecture of the stria vascularis and the roles of the ion-transport apparatus. Pflugers Arch. 459 (4), 521-533 (2010).
- Johns, J. D., et al. The role of the stria vascularis in neglected otologic disease. Hear Res. 428, 108682(2023).
- Yu, W., et al. Role of the stria vascularis in the pathogenesis of sensorineural hearing loss: A narrative review. Front Neurosci. 15, 774585(2021).
- Ohlemiller, K. K., et al. Cellular correlates of age-related endocochlear potential reduction in a mouse model. Hear Res. 220 (1-2), 10-26 (2006).
- Mahendrasingam, S., et al. Relative time course of degeneration of different cochlear structures in the CD/1 mouse model of accelerated aging. J Assoc Res Otolaryngol. 12 (4), 437-453 (2011).
- Lee, J. E., et al. Mechanisms of apoptosis induced by cisplatin in marginal cells in mouse stria vascularis. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 66 (3), 111-118 (2004).
- Ohlemiller, K. K., et al. The endocochlear potential as an indicator of reticular lamina integrity after noise exposure in mice. Hear Res. 361, 138-151 (2018).
- Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms. Hear Res. 349, 138-147 (2017).
- Levano, S., et al. Whole neonatal cochlear explants as an in vitro model. J Vis Exp. (197), e65160(2023).
- Wu, K. Y., et al. Isolation and culture of primary cochlear hair cells from neonatal mice. J Vis Exp. (199), e65687(2023).
- Schmiedt, R. A., et al. Effects of furosemide applied chronically to the round window: A model of metabolic presbyacusis. J Neurosci. 22 (21), 9643-9650 (2002).
- Kurata, N., et al. Histopathologic evaluation of vascular findings in the cochlea in patients with presbycusis. JAMA Otolaryngol Head Neck Surg. 142 (2), 173-178 (2016).
- Wangemann, P., et al. Loss of KCNJ10 protein expression abolishes endocochlear potential and causes deafness in Pendred syndrome mouse model. BMC Med. 2, 30(2004).
- Ding, L., Wang, J. miR-106a facilitates the sensorineural hearing loss induced by oxidative stress by targeting connexin-43. Bioengineered. 13 (6), 14080-14093 (2022).
- Wan, H., et al. PARP1 inhibition prevents oxidative stress in age-related hearing loss via PAR-Ca(2+)-AIF axis in cochlear strial marginal cells. Free Radic Biol Med. 220, 222-235 (2024).
- Zhang, Y., et al. Decreased poly(ADP-ribose) polymerase 1 expression attenuates glucose oxidase-induced damage in rat cochlear marginal strial cells. Mol Neurobiol. 53 (9), 5971-5984 (2016).
- Fetoni, A. R., et al. Pathogenesis of presbycusis in animal models: A review. Exp Gerontol. 46 (6), 413-425 (2011).
- Marie, A., et al. Senescence-accelerated mouse prone 8 (SAMP8) as a model of age-related hearing loss. Neurosci Lett. 656, 138-143 (2017).
- Li, W., et al. Rodent models in sensorineural hearing loss research: A comprehensive review. Life Sci. 358, 123156(2024).
- Bommakanti, K., et al. Cochlear histopathology in human genetic hearing loss: State of the science and future prospects. Hear Res. 382, 107785(2019).
- Nicolson, T. Navigating hereditary hearing loss: Pathology of the inner ear. Front Cell Neurosci. 15, 660812(2021).
- Liu, W., et al. Applications and challenges of CRISPR-Cas gene-editing to disease treatment in clinics. Precis Clin Med. 4 (3), 179-191 (2021).
- Guo, D., et al. Establishment methods and research progress of livestock and poultry immortalized cell lines: A review. Front Vet Sci. 9, 956357(2022).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
