Растворяющиеся микроигольные пластыри, изготовленные методом литья растворителями, и важная характеристика микроигольных биомедицинских устройств

Summary

Настоящая работа направлена на то, чтобы служить практическим руководством, позволяющим исследователям подготовить собственные DMAP-устройства с использованием метода литья растворителем, также известного как микроформование, и выполнить базовую характеристику.

Abstract

Технологии на основе микроигл произвели революцию в области исследований кожной и трансдермальной доставки и сегодня считаются самым простым способом введения лекарств через кожу. Успех пластырей с микроигловым массивами (MAPs) в основном объясняется их способностью нейтрализовать кожный барьер, противодействующий проникновению наружно наносимых препаратов, безболезненно прокалывая слой роговицы . Растворяющиеся MAPs (DMAPs) выделяются среди других типов устройств на базе MAPs благодаря биосовместимости их составляющим материалам, возможности самовведения пациентами и отсутствию острых отходов, образующихся после использования. DMAP обычно изготавливаются из полимерных материалов, которые при введении в кожу при контакте с интерстициальными жидкостями, высвобождая свой груз. На уровне стенда DMAP обычно производятся методом литья растворителем, который включает использование негативных основных форм желаемой формы и длины MAP, на которые отливаются полимерные дисперсии, насыщенные лекарствами. Затем их заставляют заполнить полости формы с помощью центробежной силы или положительного давления. После высыхания DMAP становятся твёрдыми, снимаются с основных форм и регулярно проходят различные исследования характеристик перед использованием. Эти анализы обычно включают изучение механических свойств DMAPs, определение остаточного содержания воды, способность ex vivo проникать в структуру кожи, эффективность выбросов лекарств и in vitro оценку биосовместимости.

Introduction

Хотя местное и трансдермальное введение фармакологически активных веществ через кожу считается перспективной альтернативой пероральному введению лекарств, оно представляет серьёзные трудности из-за естественной функции кожного барьера, обеспечиваемой слоем роговицы . Это ограничение особенно касается крупных молекул, особенно тех, что имеют молекулярную массу >500 Da¹. Кроме того, пассивная диффузия через кожу других молекул с специфическими физико-химическими свойствами, такими как заметная гидрофильность или липофильность, также ограничена. Были предложены различные технологические стратегии для преодоления этого барьера, включая ионофорез, сонофорез, электропорация, использование химических усилителей, термические методы и наноразмерные системы. Тем не менее, пластыри с микроигловыми массивами (MAP) выделяются рядом преимуществ: высокой эффективностью в нейтрализации функции роговицы слоя , экономичностью, безболезненным опытом для пациентов и возможностью самостоятельного применения без необходимости медицинского^{персонала 2}.

MAP — это устройства, содержащие микро-игольчатые выступы, которые пробивают слой роговицы и обходят эпидермальный барьер. В литературе описаны несколько типов MAPs, а именно: твёрдые, покрытые, растворяющиеся, набухающие и полые MAPs. Растворяющиеся MAPs (DMAPs) состоят из водорастворимых полимерных материалов и используют стратегию «проколы и выпуски», что объясняет их более интересные особенности. В частности, они растворяются при вставлении в кожу при контакте с интерстициальными жидкостями, высвобождая своё содержимое. В сравнении со стратегией «прокот и пластырь», применяемой твердыми MAPs, где они используются для создания микроканалов внутри структуры кожи, позволяющих проходить впоследствии наносящейся местно наносящейся^{формулой 3,4}, подход «проколы и отпусти» не подвержены времени, пока микроканалы остаются открытыми. Стратегия «poke and flow» требует подготовки полых MAP, архитектура которых значительно сложнее и труднее в производстве. Дополнительное преимущество DMAP заключается в том, что они не образуют острых отходов после нанесения, что снижает риск уколов иглой и биологического загрязнения. Кроме того, их простое и минимально инвазивное применение позволяет пациентам осуществлять самообслуживание, поддерживая их использование в ограниченных ресурсах или географически удалённых условиях, где доступ к обученному медицинскому персоналу, медицинской инфраструктуре и безопасным системам утилизации острых^{предметов ограничен 2}. Научное сообщество, ориентированное на дермальную и трансдермальную доставку лекарств, всё чаще обращается к технологии MAPs, особенно DMAP, чтобы преодолеть ограничения вышеупомянутых стратегий. Хотя первая публикация по MAP датируется 1980-ми годами, в начале 2000-х технология пережила значительный всплеск. С тех пор количество публикаций выросло экспоненциально, достигнув примерно 500 статей в год, в настоящее^{время 5}.

DMAP обычно изготавливаются методом литья растворителем или^{микроформования 6}. Эта технология производства основана на использовании негативных мастер-форм желаемой формы и длины MAP. После литья полимерных дисперсий, загруженных лекарствами или даже наноразмерными системами, применяется внешняя сила для заполнения микроигольчатых полостей главной формы. После высыхания DMAP можно аккуратно снять, снимая их или растворяя основную форму химическим веществом. Эти мастер-формы изготавливаются из различных материалов, при этом наиболее распространённым является полидиметилсилоксан (PDMS) благодаря своей гибкости и низкой адгезивности, что облегчает снятие формы DMAP. Подготовка мастер-форм обычно проводится литографическими методами; однако теперь доступны коммерческие формы PDMS различных форм, длин и плотности микроиголок.

Здесь приведено руководство по приготовлению DMAP с использованием техники литья растворителем. В этом случае процесс выполняется с использованием центробежной силы или приложения положительного давления. Это позволяет использовать эффективный и экономный протокол альтернативу дорогим методам производства биомедицинских устройств на базе MAPs, позволяя более широкой группе исследователей внедрять MAP в свои исследования, связанные с кожей. Кроме того, основные характеристики для академических и фундаментальных исследований, предшествующие тестированию in vivo , включают длину и геометрию иглы, механическую устойчивость к сжатию, эффективность введения ex vivo , загрузку и высвобождение препаратов, остаточное содержание воды, стабильность, экс-виво всасывание препарата и профиль безопасности in vitro .

Protocol

Реагенты и оборудование, использованные в этом исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Производство растворяющихся микроигольных массив с помощью центрифугирования

1. Подготовьте водную коллоидную дисперсию составляющих веществ DMAPs, растворив их в нужном объёме воды и интенсивно перемешивая. В зависимости от выбранных полимеров и концентрации время дисперсии может варьироваться. При необходимости прогрейте воду умеренно (40-45 °C), чтобы облегчить дисперсию полимера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наиболее распространённые полимеры, используемые для приготовления DMAPs, — это поли(винилпирролидон) (PVP), карая-камедь, гиалуроновая кислота (HA), поли(метилвинилэфир альт-малеиновая кислота) (PMVE-MA), поли(винилспирт) (PVA), карбоксиметилцеллюлоза (CMC), хитозан и др., однако может применяться любой другой водорастворимый материал с оптимальными свойствами. Для большинства формул типичная рабочая концентрация варьируется от 5% до 30% ватылой кислоты. Более низкие концентрации обычно дают быстрорастворяющиеся DMAP, а более высокие — медленно растворяющиеся устройства. Однако оптимальная концентрация должна определяться эмпирически, подготовляя различные прототипы DMAP, так как она зависит от молекулярной массы полимера, вязкости и желаемых механических свойств микроигл.
2. Дайте полимерам минимально перемешивать в течение ночи, чтобы достичь полного рассеяния, при этом удаляя пузырьки воздуха.
3. Центрифугуйте полимерную дисперсию, если сохраняются пузырьки воздуха (1000 x g; 5 min; 25 °C).
4. Добавьте груз (лекарство или частицу наноразмера) в нужной концентрации и умеренно перемешивайте, пока он не станет однородным, не добавляя новых пузырьков воздуха.
5. Убрать формы PDMS в пластины с 12 ямецами. Для этого вместите формы в колодцы с помощью моделирующей глины, зубного цемента или любого подобного материала.
6. Отлийте 50 мкл полимерной смеси, загруженной лекарством, на формы PDMS и центрифугу (3000 x г; 5 мин; 25 °C). Затем поверните пластины на 180° и повторите процесс центрифуга, чтобы обеспечить заполнение всех игольчатых полостей.
7. Аккуратно удалите избыток полимерной диверсии, насыщенной лекарствами. Используйте пипетку для передачи полимерной дисперсии, если она жидкая; Используйте лопатку, если она очень вязкая.
8. Повторите процесс двойного центрифугирования (шаг 1.6), чтобы вернуть в форму любую полимерную дисперсию, загруженную лекарствами, которая могла переполниться на предыдущем этапе.
9. Высушить полимерную дисперсию, загруженную лекарствами, в формах в вакууме (600 мБар; 30 мин; 25 °C).
10. Повторите протокол не менее двух раз на шагах 1.6–1.9, чтобы обеспечить правильное заполнение основных форм полимерной дисперсией с лекарствами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Центробежная сила может постепенно уменьшаться с помощью 500 x g (25 °C) при каждом повторении.
11. Подготовьте высококонцентрированную полимерную дисперсию без лекарств для создания базовой пластины устройства DMAPs. Это гарантирует, что препарат, присутствующий в дисперсии, заполненной в полости формы, не попадёт обратно в базовую пластину.
12. Отлийте 50 мкл свободной полимерной дисперсии на формы PDMS и распределите путём центрифугирования дважды, включая средние пластины, при повороте 180° (500 x г; 5 мин; 25 °C; 2x). После центрифугирования добавьте 100 мкл дисперсии в каждую форму, а затем дополнительно 50 мкл к основной плите через 12 часов.
13. Оставьте DMAP в формах PDMS сушиться 3-5 дней при комнатной температуре в сухом уплотнении.
14. Аккуратно отключите DMAP от PDMS щипцами или снимите их с помощью целлюлозной скотча (рисунок 1).
15. Охарактеризуйте произведенные DMAP (см. шаг 3).

2. Изготовление растворяющихся микроигольных решеток с помощью положительного давления

1. Продолжайте аналогичным образом, как описано в предыдущем разделе, до шага 1.5.
2. Отлийте 150 мкл полимерной смеси, загруженной лекарством, на формы PDMS и поместите их в резервуар с давлением.
3. Наполните бак воздухом, пока давление не достигнет 3-4 бара минимум 15 минут.
4. Аккуратно удалите избыток полимерной диверсии, насыщенной лекарствами. Для этого, если полимерная дисперсия жидкая, используйте пипетку, а если она сильно вязкая — удаляйте её лопаткой.
5. Повторное применение давления (шаги 2.2-2.3), чтобы вернуть в форму любую полимерную дисперсию, нагруженную лекарствами, которая могла переполниться на предыдущем этапе.
6. Высушить полимерную дисперсию, насыщенную препаратами, в формах в вакууме (600 мбар; 30 мин; 25 °C).
7. Подготовьте высококонцентрированную полимерную дисперсию без лекарств для создания базовой пластины устройства DMAPs. Это гарантирует, что препарат, присутствующий в дисперсии, заполненной в полости формы, не попадёт обратно в базовую пластину.
8. Отлийте 0,2 г свободной полимерной дисперсии на формы PDMS и приложите положительное давление, как описано в шаге 2.3.
9. Действуйте аналогично, как описано в предыдущем разделе, начиная с шага 1.13.

3. Характеристика DMAP

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе методы, связанные с использованием человеческих и/или животных кожных тканей, были выполнены в соответствии с институциональными рекомендациями. Кроме того, методы использования образцов кожи животных проводились в соответствии с принципом 3Rs для экспериментов на животных.

1. Визуализируйте DMAP с помощью микрокамеры с соответствующим увеличением, чтобы различать игольчатые^{проекции 7}.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если они были загружены цветным препаратом или красителем, необходимо наблюдать другой цвет между кончиками и основанием.
2. Прикрепите DMAP к вспомогательному устройству и визуализуйте морфологию и длину микроигольчатых проекций с помощью оптической микроскопии. Необходимо наблюдать структуру острого наконечника. Запишите длину микроигольчатых проекций с помощью соответствующего программного обеспечения для вашего оптического микроскопа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы измерить длину микроиглы с помощью оптической микроскопии, MAP должны отображаться перпендикулярно объективам. Измерения длины и форма микроигольчатых проекций должны быть подтверждены с помощью сканирующей электронной микроскопии.
3. Оцените механические свойства DMAP относительно деформации микроигл после сжатия на твёрдую поверхность. Для этого поместите устройство DMAPs в коммерчески доступный аппликатор DMAPs и сжимайте его на плоской поверхности из нержавеющей стали в течение 30 секунд. После сжатия запишите длину микроигольчатых проекций и вычислите процент деформации, сравнив её с начальной длиной согласно следующему^{уравнению 7}:
   
   Где h_o и_{h f} обозначают длину микроигл до и после сжатия соответственно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если доступно, использование анализатора текстур стандартизирует силу сжатия. В таком случае сила 32 Н/массив имитирует среднюю силу большого пальца, которую пациенты применяют при самовводе DMAP-устройств.
4. Определите предварительную способность вводить DMAP методом суррогатной искусственной кожи на основе термопластиковых листов из олефинового^{типа материала 8}. Для этого сжать устройство DMAP к восьми переплетённым листам, следуя условиям, описанным в шаге 3.4. Количество отверстий, созданных в каждом слое, наблюдается с помощью оптической микроскопии или с помощью микроскопической камеры, а также рассчитывается процент проникновения на разные глубины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерчески доступные термопластиковые листы обычно имеют толщину 127 мкм.
5. Определите способность экс-виво вставлять DMAP с использованием эксплантов из кожи человека, свиной или грызуна, ранее вырезанных и аккуратно подстриженных. Очистите кожу с большим количеством воды, замочив в воде 1-2 минуты, а затем положите на пену, обёрнутую алюминиевой фольгой, так, чтобы сторона роговицы была обращена вверх.
   1. Приступайте к вставке в условиях, описанных в шаге 3.4. Оставьте DMAP введёнными в кожу до растворения кончиков микроиглы. Если DMAP насыщены красителем или цветным препаратом, окрашивание внутренней и внешней сторон кожи показывает успешное введение DMAP⁹. Кроме того, микроканалы можно обнаружить гистологическим анализом срезов кожи⁷.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап, включающий ex vivo человеческую или животную кожу, был проведён в соответствии с руководящими принципами и одобрением Комитета по этике исследований человека и животных Университета Валенсии. По возможности было получено информированное согласие, и все эксперименты соответствовали институциональным и европейским этическим стандартам использования тканей человека и животных в биомедицинских исследованиях.
6. Определите остаточное содержание воды с помощью термогравиметрического анализа. Потеря веса, наблюдаемая до 100-110 °C, объясняется остаточной^{водой 10}.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от источника литературы, допустимое максимальное остаточное содержание воды составляет 5%–10% от общего веса для обеспечения оптимальной сушки DMAP.
7. Количественно оценить нагрузку груза, погружая DMAP в 5-10 мл воды (или, альтернативно, в соответствующую водную среду для анализируемого препарата) при температуре 32-37 °C и количественно определив количество груза с помощью оптимального аналитического метода.
   ПРИМЕЧАНИЕ: UV-Vis спектрофотометрия обычно используется для анализа малых молекул. Для соединений с низкими пределами обнаружения и количественной оценки настоятельно рекомендуется высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) в сочетании с УФ-Vis, флуоресцентным или электрохимическим обнаружением. ВЭЖХ в сочетании с масс-спектрометрией могут использоваться при необходимости исключительной чувствительности и специфичности. Аналитическое определение белковых и антител обычно проводится с помощью анализов на бицинхониновую кислоту (BCA) и иммуноанализов, таких как ферментно-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA) или вестерн-блоттинг соответственно. Профили высвобождения препарата получаются путём отбора проб (0,2–1 мл) в заранее определённые временные моменты из водной среды^{выпуска 11}. После каждой точки отбора пробы вычитаемый объём заменяется тем же объёмом темперированного высвобождающего материала, чтобы избежать ошибок, связанных с автоконцентрацией образцов.
8. Оцените устойчивость DMAP, повторяя вышеупомянутые тесты характеристик, чтобы гарантировать, что характеристики DMAP остаются постоянными в течение периода хранения в заранее заданных условиях.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если груз термостабилен, DMAP обычно хранятся при комнатной температуре (25 °C). Для термочувствительных активных веществ DMAP хранятся при 4 °C. Относительная влажность должна оставаться ниже 30%. Стабильность DMAP регулярно контролируется в течение шести месяцев.
9. Определите экс-виво накопление и всасывание кожи через кожу с помощью системы диффузионной клетки Франца (FDC). Для этого подготовьте кожу как описано и вводите DMAP в структуру кожи в течение 30 секунд, как описано в шаге 3.6.
   1. После этого приклейте донорскую камеру FDC к коже соответствующим количеством цианоакрилата. После высыхания комплекс кожно-донорской камеры соединяют с рецепторной камерой с помощью соответствующих^{зажимов 12}. Наконец, приступайте к протоколу выборки, как описано в подразделе 3.5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап, включающий ex vivo человеческую или животную кожу, был проведён в соответствии с руководящими принципами и одобрением Комитета по этике исследований человека и животных Университета Валенсии. По возможности было получено информированное согласие, и все эксперименты соответствовали институциональным и европейским этическим стандартам использования тканей человека и животных в биомедицинских исследованиях. Если DMAP растворяются медленно, закрепляйте их на коже хирургическими клейкими лентами, чтобы предотвратить самовыделение из структуры кожи.
10. Оценивайте биосовместимость in vitro с помощью метаболических тестов активности, таких как анализы на основе тетразолия и резазурина, или тестов на пролиферацию, включая анализы 5-бромо-2'-дезоксиуридина (BrdU), согласно инструкции производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительные клеточные линии — кератиноциты, фибробласти или меланоциты. Клетки, не подвергшиеся воздействию DMAP, обычно используются в качестве отрицательных контролей, тогда как клетки, обработанные 1% додецилсульфатом натрия (SDS), служат положительными контролями. Оценка биосовместимости зависит от профиля растворения DMAP. Для быстрорастворяющихся DMAP (растворяющихся в течение 24 часов) используется метод на основе экстракта, при котором устройство растворяется до воздействия клетки. Для медленно растворяющихся DMAP применяется метод прямого контакта, при этом устройство добавляется непосредственно к засеянным скважинам. Согласно международным стандартам ISO 10993, результаты жизнеспособности клеток >70% считаются нетоксичными.

Results

Изготовленные DMAP должны обозначать однородный вид с успешным формированием микроигольчатых выступов, как показано на рисунке 2A. Когда цветной груз загружается только в структуру микроиглы, небольшое количество препарата может загрязнить базовую пластину DMAP из-за перелива препарата из наконечников или неполной очистки перед отливом свободного полимерного дисперсии. Однако между этими двумя структурами наблюдается явное различие. При визуализации с помощь...

Discussion

Описанный здесь протокол позволяет готовить DMAP. Однако универсальность и широкий спектр полимерных материалов, которые можно использовать для производства DMAP, позволяют создавать растворяющие устройства с разными характеристиками. Представленные результаты соответствуют быстрорастворяющим DMAP, так как они были получены с использованием PVP — полимера с высокой вододисперсионной концентрацией. Время растворения DMAP можно легко настроить, просто заменив составляющий полимер или измен...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Клеточная культура 12-луночной пластины	Н/Д	Н/Д	Нет технических характеристик. Подходит любая коммерческая пластина с 12-ячелинной культурой клеток
Центрифуга	Эппендорф	Центрифуга 5810 G	Можно заменить любой другой центрифугой, адаптированной к пластинам клеточной культуры
Метиленовый синий	Сигма Олдрич	66720	CAS 122965-43-9. Можно заменить любым другим красителем или брендом
Моделирование глины	Н/Д	Н/Д	Нет технических характеристик. Любая коммерческая моделирующая глина подойдёт
Термопластиковые листы олефинового типа	Амкор	PM996	Parafilm M
Поли (виниловый спирт) (PVA) МВт: 9-10 кДа	Сигма Олдрич	363146	CAS 9002-89-5. Можно заменить любым другим брендом
Поли(винилпиролидон) (PVP) MW: 40 кДа	Сигма Олдрич	PVP40	CAS 9003-39-8. Можно заменить любым другим брендом
Формы для полидиметилсилоксана (PDMS)	Технологии Micropoint	ST-06	Распределение стрелок массива: 15 x 15; Высота 600 и микро; m; Base 200 и микро; m; Шаг иглы 500 и микром. Можно заменить любой другой формой PDMS с другой формой и длиной полости
Резервуар с давлением	Protrima	AT-10HT	Можно заменить любым другим напорным баком, поддерживающим давление 4 бар