Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка влияния тимохинона на сигнализацию Keap-1/NRF-2, окислительный стресс и поведение у крыс

252 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69924

⸱

13 марта 2026 г.

 , 
1Faculty of Medicine, Department of Physiology, Kirsehir Ahi Evran University, 2Faculty of Medicine, Department of Histology and Embryology, Kirsehir Ahi Evran University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол демонстрирует, как оценивать влияние тимохинона на путь Keap-1/NRF-2, биомаркеры окислительного стресса и поведенческие результаты в модели субхронического воздействия дельтаметрина у крыс.

Аннотация

Последние достижения в исследованиях воздействия пестицидов повысили интерес к антиоксидантным защитным стратегиям. Тимохинон (TQ), растительное биоактивное соединение, сообщается, что оказывает защитное действие против различных токсичных агентов. В данном исследовании описывается протокол оценки влияния TQ на параметры окислительного стресса, сигнальный путь Keap-1/NRF-2 и поведенческие результаты у крыс, подвергшихся воздействию низкой дозы дельтаметрина (DTM). Здесь 24 взрослых самца крыс Wistar Albinose (250 ± 20 g) были случайным образом распределены в четыре группы (n = 6/группа): контрольные, TQ, DTM и DTM+TQ. ДТМ (1,28 мг/кг) и ТК (10 мг/кг) вводились внутрижелудочно в течение 30 дней. Вес тела отслеживался на протяжении всего исследования. Локомоторная активность и поведение, похожее на тревогу, оценивались с помощью теста с открытым полем на 31-й день, а поведение, похожее на депрессию, — с помощью теста на принудительное плавание на 32-й день. В конце экспериментального периода были собраны плазменные и мозговые ткани для биохимических, гистопатологических и молекулярных анализов. В образцах плазмы и коры головного мозга измерялись маркеры оксида оксида азота, глутатиона и сульфгидриловых групп. Были проанализированы уровни экспрессии белка, ассоциированных с ECH 1 (Keap-1) и ядерного фактора эритроида 2 (Nrf-2), связанных с фактором 2 (Nrf-2). Этот протокол предоставляет комплексный и воспроизводимый подход к исследованию нейротоксичности, вызванной пестицидами, и модуляционного эффекта антиоксидантных соединений.

Введение

Инсектициды широко применяются в сельском хозяйстве и домашних условиях для борьбы с вредителями; однако хроническое воздействие низких доз может привести к загрязнению окружающей среды и негативным последствиям для здоровья как у людей, так и у животных. Такое воздействие, особенно через загрязнённую пищу и воду, связано с повышенным риском неврологических заболеваний и других системныхтоксичностей 1.

Пиретроиды в значительной степени вытеснили фосфороргано-фосфорные инсектициды из-за более строгих правил и относительно низкой токсичности для млекопитающих. DTM, пиретроид типа II, содержащий α-цианогруппу, является одним из самых часто используемых инсектицидов в мире и считается очень эффективным противнасекомых 2. Несмотря на это, экспериментальные исследования показали, что воздействие ДТМ вызывает окислительный стресс и нейротоксичность в животныхмоделях 3,4.

ДТМ — это высоколипофилное соединение, которое легко пересекает гематоэнцефалический барьер и нарушает работу нейронов, продлевая открытие натриевых каналов с ограничением напряжения. Этот эффект приводит к повторяющемуся воздействию нейронов, увеличению внутриклеточного притока натрия и усиленному образованию реактивных видов кислорода, что в конечном итоге приводит к окислительному повреждению, воспалению и поведенческим изменениям, особенно в уязвимых областях мозга, таких как гиппокамп и кораголовного мозга 1. Учитывая растущую обеспокоенность по поводу нейротоксичности, вызванной пестицидами, всё больше внимания уделяется антиоксидантным защитным стратегиям, полученным из природных источников. TQ, основной биоактивный компонент эфирного масла Nigella sativa, обладает мощными антиоксидантными, противовоспалительными и нейропротекторнымисвойствами 5. Несколько исследований продемонстрировали его благоприятное влияние на химически индуцированный окислительный стресс и нейродегенеративныепроцессы 5,6,7,8,9.

Одним из основных механизмов, лежащих в основе защитного эффекта TQ, является модуляция сигнального пути Keap-1/Nrf-2. Этот путь играет центральную роль в поддержании окс-гомеостаза клеток, регулируя экспрессию антиоксидантных и детоксикационных ферментов. При условиях окислительного стресса репрессия Nrf-2, опосредованная Keap-1, снижается, что позволяет Nrf-2 транслоциироваться в ядро и активировать экспрессию гена, зависящую от антиоксидантного ответа 9.

Поскольку воздействие ДТМ вызывает изменения на молекулярном, биохимическом, гистологическом и поведенческом уровнях, одного аналитического подхода недостаточно для полного охватения его нейротоксичных эффектов. Таким образом, этот протокол интегрирует поведенческие оценки, анализ биомаркеров окислительного стресса, гистопатологическую оценку и молекулярное исследование пути Keap-1/Nrf-2, чтобы предоставить комплексную и воспроизводимую основу для изучения нейротоксичности, индуцированной пестицидами, и модуляционных эффектов антиоксидантных соединений, таких как TQ.

В совокупности приведенные выше данные подчёркивают необходимость интегрированного экспериментального подхода для уточнения механизмов, лежащих в основе нейротоксичности, вызванной ДТМ, и оценки потенциальных защитных вмешательств. Сочетая поведенческие оценки с биохимическими, гистопатологическими и молекулярными анализами пути Keap-1/Nrf-2, данный протокол позволяет проводить многомерную оценку повреждения нейронов, связанных с окислительным стрессом. Интерпретация экспериментальных результатов в рамках этой механистической структуры подчеркивает, как TQ модулирует редокс-сигнализацию, ослабляет повреждения тканей и улучшает поведенческие результаты в контексте субхронического воздействия DTM.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Местный этический комитет по институциональным экспериментам на животных одобрил экспериментальный протокол под регистрационным номером 68429034/35. Общая продолжительность исследования составила 32 дня. До проведения экспериментов животных акклиматизировали к стандартным лабораторным условиям. Все экспериментальные процедуры проводились в строгом соответствии с институциональными и международными рекомендациями по этике в области животных. Экспериментальные материалы, используемые в этом протоколе, перечислены в Таблице материалов.

ПРИМЕЧАНИЕ: Химические и биологические отходы утилизировались в соответствии с рекомендациями учреждения по безопасности лаборатории и управлению отходами. Кислоты, щелочности и органические растворители собирались в отдельные маркированные контейнеры и доставлялись в отдельный отдел опасных отходов. Биологические материалы и загрязнённые расходные материалы собирались в контейнеры для биологической опасности, стерилизовались и перевезены в соответствующее учреждение для окончательной утилизации.

1. Экспериментальная конструкция

  1. Получите 24 взрослых самцов крыс-альбиносов Wistar весом 250 ± 20 г из Лаборатории экспериментов на животных. Каждую крысу по отдельности содержат в клетках при температуре 24 ± 2 °C в 12-часовом цикле свет/темнота, с импровированным доступом к стандартной крысиной и водопроводной воде.
  2. Случайным образом разделите животных на четыре группы (n = 6 на группу): Группа 1: Контроль (C), Группа 2: TQ, Группа 3: DTM, Группа 4: DTM + TQ.
  3. Растворить DTM (98% чистоты) в кукурузном масле и ввести в дозе 1,28 мг/кг через внутрижелудочный гаваж в течение 30 дней.
  4. Растворить TQ в дозе 10 мг/кг в кукурузном масле и ввести через внутрижелудочный раствор в течение 30 дней. Готовьте все препараты свежими ежедневно и вводите их в общим объёме 1 мл/кг.
  5. В группе комбинированного лечения назначают TQ сразу после ДТМ. Вводите только кукурузное масло в контрольную группу для учёта стресса, связанного с гаваджем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Доза DTM была выбрана на основе предыдущей литературы для индуцирования окислительного стресса без заболеваемости и соответствует примерно 1/100 LD501.

2. Измерение массы тела

  1. Измерьте массу тела на 1, 10, 20 и 30 днях исследования (рисунок 1).

3. Поведенческие параметры

  1. Проводите все поведенческие тесты в стандартизированных условиях для обеспечения согласованности. Записывайте как тест принудительного плавания (FST), так и тест на открытом поле (OFT) с помощью верхней камеры, обеспечивающей полный обзор тестового оборудования. Поддерживайте освещение примерно на уровне 100–150 люкс. Определите неподвижность как отсутствие активного движения, за исключением минимальных движений, необходимых для поддержания осанки и дыхания. Очистите все тестовые площадки с помощью 70% этанола между животными, чтобы предотвратить обонятельные влияния.
  2. FST
    1. Проведите ФСТ на 32-й день, чтобы оценить поведение, похожее на депрессию. Проведите 15-минутную предтестовую сессию за 24 часа до 5-минутной тестовой сессии, чтобы привыкнуть животных к водной среде и минимизировать стресс, вызванный новизной. Не проводите поведенческую оценку во время предварительной сессии.
    2. По отдельности помещайте крыс в цилиндрические контейнеры (диаметр: 35 см, высота: 50 см), содержащие 30 см воды, поддерживаемые при температуре 25 ± 1 °C в течение 5 минут.
    3. Записывайте время плавания, скалолазания и неподвижности с помощью видеокамеры. Количественно определите параметры поведения за секунды повидеозаписям 10.
    4. Определим поведение следующим образом:
      Неподвижность: Представьте животное неподвижным, когда оно остаётся плавающим без активных движений, делая лишь минимальные движения, чтобы удержать голову над водой.
      Плавание: Определите плавание как активное горизонтальное движение по цилиндру с координированными движениями всех четырёх лап.
      Лазание: Определите лазание как энергичные движения передних лап вверх по стенке цилиндра, пока животное остаётся в вертикальном положении.
    5. Если животное остаётся полностью неподвижным, оценивайте поведение как неподвижность согласно заранее заданным критериям.
    6. Не применяйте внешнюю стимуляцию или коррекцию курса во время сессии теста. Позвольте животному вести себя свободно в течение всех 5 минут, если не требуется вмешательство по соображениям безопасности (например, риск утопления).
  3. OFT
    1. Проведите ОФТ на 31-й день, чтобы оценить локомоторную активность и тревожное поведение11. Записывайте индивидуальные движения в течение 5 минут в арене размером 90 x 35 см, разделённой на 24 равных единицы чёрными линиями.
    2. Количественно определите следующие поведенческие параметры по видеозаписям, сделанным исследователем, ослеплённым к распределению групп:
      Количество пересечений всеми четырьмя лапами (двигательная активность)
      Время, проведённое в центральной и периферической зонах (поведение, похожее на тревожность)
    3. Если животное остаётся полностью неподвижным, запишите это поведение как неподвижность и не назначьте ни одного пересечения на этот период.
    4. Не применяйте внешнюю стимуляцию, перестановку или коррекцию курса во время сессии теста.
    5. Позвольте животному вести себя свободно в течение всех 5 минут, если не требуется вмешательство по соображениям безопасности.
    6. Очистите арену 70% этанола между животными, чтобы устранить обонятельные сигналы.

4. Оценка маркеров окислительного стресса

  1. Выполняйте все процедуры на 32-й день. Глубоко анестезируйте крыс внутримышечным ксилазином (5 мг/кг) и кетамином (45 мг/кг). Подтвердите глубокую анестезию по отсутствию рефлектора отмены педалей. Соберите примерно 3–5 мл крови с помощью сердечной пункции в трубки, покрытые ЭДТА.
  2. Завершение эвтаназии путем экссангинации под глубокой анестезией и подтверждение смерти до сбора тканей. Анализы крови с центрифугой в концентрации 3000 г в течение 10–15 минут при 4 °C. Аккуратно собирайте плазму, не нарушая шерсть баффи, и храните аликвоты при −80 °C. Быстро вскрытие мозга на льду. Отделить левое полушарие головного мозга и гиппокамп для биохимического анализа и быстро заморозить в жидком азоте (при −80 °C). Зафиксировать правое полушарие головного мозга в 10% нейтральном буферном формалине для гистологической оценки.
  3. Анализ окислительного стресса плазмы
    1. Перекисление липидов плазмы (анализ TBARS)
      1. Центрифугные образцы плазмы (3 000 x г, 10 мин, 4 °C). Смешать плазму объёмом 0,5 мл с 1 мл реагента TCA–TBA–HCl (15% трихлоруксусной кислоты (TCA), 0,375% тиобарбитуровой кислоты (TBA), 0,25 N соляной кислоты (HCl)). Центрифугите при 1000 г в течение 10 минут и перенесите супернатант в стеклянные трубки. Добавьте 50 мкл 0,02% бутилированного гидрокситолуола (BHT) для предотвращения искусственного окисления.
      2. Нагрейте при 100 °C в течение 15 минут, затем охладите до комнатной температуры, центрифугите при 1000 x g в течение 10 минут и измерите поглощение на уровне 532 нм10. Рассчитайте концентрацию MDA с помощью закона Бира–Ламберта
        ε = 1,56 × 105 м⁻1 см⁻1, l = 1 см и экспрессируются в виде плазмы нмоль/мл.
    2. Уровни тиола в плазме (RSH)
      1. Смешайте 0,5 мл плазмы с буфером Tris-HCl (100 мМ, pH 8,2), содержащим 1% натрия додецилсульфата (SDS) и 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA). Инкубировать 5 минут при 25 °C и использовать центрифугу (3 000 x g, 10 мин, 4 °C). Используйте супернатант для анализа.
      2. Добавьте 0,3 мМ 5,5′-дитиобис-(2-нитробензойную кислоту) (DTNB) и инкубировать при 37 °C в течение 15 минут. Измерьте поглощение при 412нм 10. Вычислите концентрации RSH с помощью ε = 13 600 М⁻1 см⁻1 и экспрессируйте в плазме μмоль/л.
    3. Уровни NOx в плазме (реакция Грисса)
      1. Депротеинизируйте плазму с помощью 0,3 млн гидроксида натрия (NaOH) и 5% сульфата цинка (ZnSO₄). Центрифугуйте при 20 000 x g в течение 5 минут и соберите супернатант.
      2. Подготовьте растворы нитратного запаса (100, 10 и 1 ммоль/л) и получите стандартную кривую (1–100 мкмоль/л). Загрузите 100 мкл супернатанта (дублирующих ямок) в микропластину.
      3. Добавьте 100 мкл хлорида ванадия (III) (VCl₃), затем 50 мкл сульфаниламида и 50 мкл N-(1-нафтил) этилендиамина. Инкубировать 30–45 минут при комнатной температуре и измерять поглощение на 540нм 10. Определите концентрации NOx по стандартной кривой и экспрессируйте в виде микромоль/л плазмы.
  4. Анализ окислительного стресса тканей
    1. Для всех биохимических анализов используйте примерно 100 мг ткани левого полушария головного мозга.
    2. Перекисление липидов тканей (TBARS Assay)
      1. Гомогенизировать ткань (1:10 w/v) в ледяной температуре 10% TCA. Добавьте равный объём 0,67% TBA и нагрейте при 100 °C в течение 15 минут. Охладить и центрифугировать (3 000 x g, 10 минут, 4 °C)10. Измерьте поглощение супернатантов на 535 нм. Вычислите MDA с помощью ε = 1,56 × 105 M⁻1 см⁻1 и экспрессируйте в виде nmol/g влажной ткани.
    3. Уровни глутатиона в тканях (GSH)
      1. Гомогенизировать ткань в 10% TCA (1:10 w/v) и центрифугу (3 000 x g, 10 мин, 4 °C). Смешайте 0,5 мл супернатанта с 2 мл раствора DTNB (0,4 мг/мл в 1% цитрата натрия)10. Измерьте поглощение при 412 нм немедленно. Вычислите GSH с помощью ε = 13 600 M⁻1 см⁻1 и экспрессируйте в виде влажной ткани в виде μмоль/г.
    4. Уровень NOx в тканях (реакция Грисса)
      1. Гомогенизировать ткань в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) (1:5 w/v) и центрифуге (2 000 x g, 5 мин). Депротеинизировать супернатант с 0,3 млн NaOH и 5% ZnSO₄. Центрифугу (3 000 x g, 20 мин) и соберите прозрачный супернатант.
      2. Подготовьте стандарты нитратов (1–100 мкмоль/л). Загрузить 100 мкл супернатанта в дублирующиеся скважины. Добавьте реагенты VCl₃ и Griess, как описано выше. Инкубировать 45 минут при 37 °C и измерять поглощение на расстоянии 540нм 10. Определите концентрации по стандартной кривой и экспрессируйте в виде мкмоль/г ткани.
        ВНИМАНИЕ: Процедуры, связанные с опасными химикатами, включая TCA, HCl, NaOH и органические растворители, проводились в сертифицированной химической вытяжке. Во всех экспериментах использовались соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), такие как лабораторные халаты, перчатки, защитные очки, защитные очки и, при необходимости, защитные щитки. Все химикаты обрабатывались в соответствии с институциональными рекомендациями по безопасности и соответствующими техническими данными по безопасности материалов (MSDS).

5. Определение уровней Keap-1 и Nrf-2 с помощью анализа западных блотов

  1. Разрежьте ткань гиппокампа на части по 50 мг и поместите в пробирки с 500 мкл буфера RIPA с добавлением коктейля с ингибиторами протеазы.
  2. Добавьте соответствующее количество магнитных шариков и гомогенизуйте при 1000 x g в течение двух циклов. Центрифуга при 14 000 x g в течение 10 минут при 4 °C.
  3. Перенесите супернатант в чистые микроцентрифугные трубки и снова центрифугуйте при тех же условиях. Храните образцы на льду и определяйте концентрацию белка.
  4. Измеряйте концентрацию белка с помощью флюорометра с помощью Protein BR Assay Kit, следуя инструкциям производителя.
  5. Подготовьте гели 10% SDS–PAGE для электрофореза. Отрегулируйте концентрацию белка до 30 мкг/мкл.
  6. Добавьте 4 буфера Laemmli в соотношении 3:1 и добавьте 10% β-меркаптоэтанола. Нагревание при 95 °C в течение 5 минут, затем кратковременное центрифуга.
  7. Загрузите 5 мкл белкового маркера и 30 мкг белка на каждый канал. Используйте гели при 110 В в течение 60–90 минут.
  8. Активировать мембраны PVDF в 100% метаноле в течение 3–5 минут, затем уравновесить за 1× буфер переноса в течение 10 минут при комнатной температуре перед переносом.
  9. Влажные фильтрующие бумаги и губки с буфером для переноса и аккуратно собирайте сэндвич для переноса, обеспечивая полное удаление воздушных пузырьков. Провести перенос белка с помощью влажной системы при 100 В в течение 90 минут при 4 °C (постоянное напряжение).
  10. Блокировать мембраны в 3% сывороточном альбумине крупного рогатого скота (BSA) в течение 1 часа при комнатной температуре на орбитальном шейкере. Инкубировать мембраны ночью при 4 °C с первичными антителами, разбавлёнными 3% BSA (Keap-1 и Nrf-2, 1:3 000; β-актин, 1:1 000).
  11. Промывайте мембраны 5 раз в течение 5 минут с помощью 1 × Tris-буферного физиологического раствора с 0,1% моющего средства Tween 20 (TBS-T). Инкубировать с вторичным антителом (1:15 000) в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте.
  12. Промывайте мембраны как описано и инкубируете с помощью усовершенствованного хемилюминесцентного (ECL) субстрата (например, субстрата HRP на основе люминола) согласно инструкции производителя (смешивая равные объемы реагентов A и B непосредственно перед использованием). Нанесите достаточно субстрата, чтобы полностью покрыть поверхность мембраны (примерно 1 мл на мембрану) и инкубировать 1–2 минуты при комнатной температуре.
  13. Обнаружение хемилюминесцентных сигналов с помощью цифровой системы визуализации, оснащённой для обнаружения хемилюминесценции (не требуется определённая длина волны возбуждения, так как излучение света происходит в результате реакции HRP–люминола). Получайте изображения с помощью автоматических настроек экспозиции, при этом обеспечивая ненасыщенные полосы. Сохраняйте одинаковые параметры экспозиции для всех образцов в одном пятне.
  14. Провести денситометрический анализ с помощью программного обеспечения для анализа изображений при одинаковых параметрах выбора ROI, фоновых вычитаний и нормализации. Нормализовать интенсивность зон Keap-1 и Nrf-2 до соответствующего белка β-актина. Экспортировать нормализованные значения в виде .csv файлов для статистического анализа.

6. Гистопатологический анализ

  1. Зафиксируйте правое полушарие головного мозга в 10% нейтральном формалине на 72 часа. Дегидрировать с помощью серии градированного этанола (70–100%), внедрить в парафин и разрезать с размером 5 мкм.
    Получите корональные срезы мозга на уровнях гиппокампальной и энторинальной коры согласно стереотаксичным координатам, определённым в книге Paxinos & Watson, The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (Academic Press). Используйте интерактивный просмотрщик атласа мозга крыс (https://labs.gaidi.ca/rat-brain-atlas для проверки и уточнения анатомической локализации11.
  2. Подготовьте четыре последовательных корональных сечения (толщиной 5 мкм) из мозговой ткани, вложенной в парафин, с использованием стандартных гистологических процедур. Окрашивайте срезы гематоксилином и эозином (H&E) согласно обычнымпротоколам 12. Осмотрите все стекли под световым микроскопом при увеличении 200×. Убедитесь, что гистологическая оценка проводится слепым исследователем, чтобы минимизировать смещениенаблюдателя 13.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура обеспечивала согласованное анатомическое сравнение между группами.
  3. Полуколичественно оценивайте потерю нейронов, клеточный отёк, ядерный пикноз, воспалительную инфильтрацию и сосудистую перегруженность в 10 случайных полях на секцию.
  4. Рассчитайте средние баллы для каждого параметра по группе. Критерии оценки были следующими: 0 (отсутствует, <5%), 1 (лёгкий, <33%), 2 (умеренный, 33–66%) и 3 (тяжёлый, >66%; Таблица 1).

7. Иммуногистохимический анализ реактивности Nrf-2 и Keap-1 в гиппокампе и энторинальной коре

  1. Подготовьте срезы толщиной 5 мкм от гиппокампа и энторинальной коры и установите их на стеклянные слайды.
  2. Депарафинизируйте и увлажняйте участки, затем промывайте в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) комнатной температуры.
  3. Инкубировать секции с 3% перекисью водорода в течение 5 минут для блокировки активности эндогенной пероксидазы. Секции для мойки с PBS
  4. Проведите получение антигена, нагревая препараты в буфере цитратного натрия (pH 6,0) в течение 10–15 минут. Дайте стеклам остыть 30 минут, затем стирайте с помощью PBS.
  5. Снова инкубировать секции с 3% перекисью водорода в течение 15 минут, чтобы обеспечить полное подавление пероксидазы. Промывайте секции с помощью PBS.
  6. Примените блокирующее раствор на 10 минут, чтобы уменьшить неспецифическое связывание. Инкубировать секции ночью при 4 °C с первичными антителами против Nrf-2 (разбавление 1:100) и Keap-1 (разбавление 1:200). После инкубации промывайте секции PBS.
  7. Инкубировать срезы с подходящим вторичным антителом в течение 30 минут при комнатной температуре. Промывайте секции с помощью PBS.
  8. Нанесите стрептавидин-пероксидазу на срезы и инкубируете 20 минут при комнатной температуре в увлажнённой камере (поддерживайте относительную влажность 95–100% с помощью герметичного инкубационного ящика с увлажненной фильтрующей бумагой). После инкубации промывайте секции PBS.
  9. Наносите хромоген DAB и контролируйте развитие цвета под световым микроскопом при увеличении 100×. Остановите реакцию, промывая слайды водопроводной водой.
  10. Окрашивайте секции гематоксилином, разбавлённым 1:9 в течение 5 минут при комнатной температуре. Тщательно прополосните с PBS и дистиллированной водой. Крепите секции с помощью постоянного монтажного материала.
  11. Осмотрите окрашенные участки под световым микроскопом. Зафиксировать фотомикрофотографии с увеличением ×400 из 16 представительных полей на секцию.
  12. Количественно оценить иммунореактивность Nrf-2 и Keap-1 с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Записывайте и анализируйте количественно оценённые данные для дальнейшей статистической оценки.
  13. Для иммуногистохимического анализа откройте изображения в ImageJ и откалибруйте с помощью инструмента Set Scale. Преобразуйте все изображения в 8-битные оттенки серого для стандартизации измерений интенсивности. Вручную определите интересующие области (ROI) для положительно окрашенных областей и соседних фоновых областей и сохраняйте их в ROI Manager.
  14. Количественно измерить интенсивность окрашивания с помощью согласованной деконволюции цвета H-DAB, а также одинаковых пороговых параметров для всех образцов. Измерьте среднее значение серого, оптическую плотность и процент положительной площади.
  15. Для анализа на основе клеток сегментируйте пороговые изображения с помощью инструмента Watershed и количественно оценивайте положительные клетки с помощью Analyze Particles. Все данные экспортировались в виде .csv файлов для статистического анализа.

8. Статистический анализ

  1. Проведите статистический анализ с использованием версии SPSS 29.0. Введите сырые данные во вкладку «Просмотр данных», где каждая строка представляет отдельное животное и переменные, определённые во вкладке «Просмотр переменных»; экспериментальная группа была закодирована как категориальная переменная (Control, TQ, DTM и DTM+TQ).
  2. Оцените нормальность данных с помощью теста Шапиро–Уилка, выбрав Analyze > Descriptive Statistics > Explore, назначайте переменные исхода в Зависимый список и группу в Факторный список, а также включив графики нормальности с помощью тестов. Для нормально распределённых переменных проводите сравнения групп с использованием одностороннего анализа дисперсии (ANOVA) с помощью Analyze > Compare Average > One-Way ANOVA, при этом описательная статистика и тест Левена на однородность дисперсий включены в разделе Options.
  3. Когда обнаружен значительный основной эффект, применяйте пост-хок тест Тьюки через меню Post Hoc для выявления парных групповых различий. Используйте результаты тестов Левена для подтверждения однородности дисперсии (p > 0,05).
  4. Для гистопатологических оценочных данных, не соответствующих параметрическим предположениям, проведите непараметрический анализ с помощью теста Крускаля–Уоллиса, выбрав Анализ > непараметрические тесты > Legacy Dialogs > K Independent Samples, затем пост-хок тест Данна с коррекцией Бонферрони с использованием непараметрического тестового модуля Independent Samples.
  5. Экспортируя статистические результаты и сводные таблицы в виде .xls или .csv файлов, результаты выражались как среднее ± стандартное отклонение (SD), а p-значение < 0,05 считалось статистически значимым.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Измерения массы тела
Масса тела фиксировалась на 1, 10, 20 и 30 дня. Крысы из групп C и TQ демонстрировали прогрессивный рост массы тела в течение экспериментального периода, при этом на 30-й день существенных различий между этими группами не было. В отличие от этого, крысы, подвергшиеся воздействию ДТМ, демонстрировали значительное снижение массы тела по сравнению с контрольными группами. Совместное введение TQ снижало потерю веса, связанную с DTM. В период исследова...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Это исследование показывает, что субхроническое пероральное воздействие ДТМ вызывает последовательные поведенческие, биохимические, молекулярные и гистопатологические изменения у крыс, и что ТК эффективно смягчает эти эффекты при одновременном введении. Интегрируя стандартизированные поведенческие тесты с профилированием окислительного стресса, анализом на уровне путей сигнализации Keap-1/Nrf-2 и гистопатологической оценкой, протокол предоставляет надёжную и воспроизводимую основу для оц...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтов интересов или конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Это исследование не получило внешнего финансирования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
5,5'-дитиобис (2-нитробензойная кислота)Thermo Scientific   69-78-3 
Настольная центрифуга NF048Nü ve43560
Beta_Actin ThermoFisher Scientific, США7D2C10
Решение BSA  Proteintech, США)66201-1-Ig
Бутилированный гидрокситолуолСигма Олдрич128-37-0
Dijital Homojenizatö r Дайхан Сайентификhttps://www.artlaboratuv
arcihazlari.com/urun/dai
han-hg-15d-dijital-homoje
nizator-set-a?srsltid=Afm
BOorx_az06ulcHpSzKZs
uP8-47Za4BkvLOM22Xh
p00tgwWhJ-86Vc
DTM   Bayer TR01426058O
Гематоксилин&ндаш; eosin Bio OpticaW01030708
Соляная кислотаMerck7647-01-0
Image J программное обеспечение NIH; Вашингтон, США.https://imagej.net/ij/
Набор для иммуногистохимического окрашивания;Lab VisionTM UltraVisionTM Large Volume Detection System: антиполивалентнаяHRP, TA-125-HL
Leica Autocut 14051956472Германияhttps://www.leicabiosystems
.com/histology-equipment/mi
crotomes/histocore-autocut/
Световой микроскоп и bbsp;Nikon, Eclipse Ни-У, 940728
N-(1-нафтил)этилендиаминThermo Scientific 1465-25-4
Считыватель нано-микропластинBMG LABTECHSPECTROstar Nano
фосфатно-буферный физиологический раствор  MerckP4417
Первичные антитела Keap-1 ProteintechКат No 10503-2-AP, 1:200
Первичные антитела Nrf-2 ProteintechCat No 16396-1-AP, 1/100
Кубитный белок BR Assay Kit ThermoFisher Scientific-INVITROGENQ33211
цитрат натрияMerck03-04-6132
Сульфат натрия додецилThermo Scientific 151-21-3
гидроксид натрияMerck1310-73-2
Селитра натрияMerck7631-99-4
Стрептавидин пероксидаза Thermo Scientific SHRP248-B
СульфаниламидThermo Scientific   63-74-1 
тиобарбитуровая кислота Merck504-17-6
TQ CAYMAN 490-91-5
Трикарбонная кислота, 99%Thermo Scientific Chemicals  139360500
Трихлоруксусная кислотаThermo Scientific Chemicals76-03-9
Tris-HClThermo Scientific   1185-53-1 
Хлорид ванадия(III)Сигма Олдрич7718-98-1
Хемилюминесцентный субстрат West Pico PLUS и iBright 750 Научная система Thermo Fisherhttps://www.clinxsci.com/product
/mini_chemiluminescence_imagi
ng_system?gad_source=1& gad
_campaignid=16224184202& gbr
aid=0AAAAAoN6UOOtoB8UD0d
eumBAMD8Xi-1l-& gclid=CjwKCAj
wgeLHBhBuEiwAL5gNEXtK2CNS
LS1GqllMuNgkrFYDaW7yK585njQ
jFja485Fkwj9lRUEKDBoCgLoQA
vD_BwE
Раствор сульфата цинкаMerck7733-02-0

Ссылки

  1. Ogut, E., et al. Protective effects of syringic acid on neurobehavioral deficits and hippocampal tissue damages induced by sub-chronic deltamethrin exposure. Neurotoxicol. Teratol. 76, 106839(2019).
  2. Souza, M. F., et al. anxiety-like behavioral impairments associated with brain-derived neurotrophic factor and dopaminergic imbalance after inhalational exposure to deltamethrin. Brain Res Bull. 181, 55-64 (2022).
  3. Chandra, N., Jain, N. K., Sondhia, S., Srivastava, A. B. Deltamethrin induced toxicity and ameliorative effect of alpha-tocopherol in broilers. Bull Environ Contam Toxicol. 90 (6), 673-678 (2013).
  4. Sharma, P., Jan, M., Singh, R. Deltamethrin toxicity. Int J Biol Stud Res. 2 (2), 91-107 (2013).
  5. Abdulbaki, H., Al-Deeb, M. A. Neuroprotective effects of ferulic acid and thymoquinone against deltamethrin-induced neurotoxicity in Drosophila melanogaster. Adv Life Sci. 10 (2), 289-297 (2023).
  6. Ince, S., Kucukkurt, I., Demirel, H. H., Turkmen, R., Sever, E. Thymoquinone attenuates cypermethrin induced oxidative stress in Swiss albino mice. Pestic Biochem Physiol. 104, 229-235 (2012).
  7. Hafez, E., El-Atrash, A., Massoud, A., Attia, M. The impact of the organophosphate insecticide "Malathion" on rat and the possible ameliorating role of "Thymoquinone". Egypt J Exp Biol (Zool.). 13 (2), 309-318 (2017).
  8. Imam, A. L., et al. Orally administered Thymoquinone mitigates cypermethrin-induced dentate gyrus oxidative stress, preventing GABAergic interneuron degeneration and memory impairment in rats via the Nrf2/ARE pathway. Mol Neurobiol. 61, 20(2024).
  9. Dong, J., et al. Thymoquinone Prevents Dopaminergic Neurodegeneration by Attenuating Oxidative Stress Via the Nrf2/ARE Pathway. Front Pharmacol. 14 (11), 615598(2021).
  10. Kuzay, D., Dileköz, E., Özer, Ç Effects of thymoquinone in a rat model of reserpine-induced depression. Braz J Pharm Sci. 58, e19847(2022).
  11. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , 7th ed, Academic Press. (2013).
  12. Bancroft, J. D., Gamble, M. Theory and Practice of Histological Techniques. , 7th ed, Churchill Livingstone. (2013).
  13. Klopfleisch, R. Multiparametric and semiquantitative scoring systems for the evaluation of mouse model histopathology. BMC Vet Res. 9, 123(2013).
  14. Brocardo, P. S., et al. Anxiety- and depression-like behaviors are accompanied by an increase in oxidative stress in a rat model of fetal alcohol spectrum disorders: Protective effects of voluntary physical exercise. Neuropharmacology. 62, 1607-1618 (2012).
  15. Arora, D., et al. Evaluation and physiological correlation of plasma proteomic fingerprints for deltamethrin-induced hepatotoxicity in Wistar rats. Life Sci. 160, 72-83 (2016).
  16. Zaki, S. M., Algaleel, W. A. A., Imam, R. A., Soliman, G. A., Ghoneim, F. M. Nano curcumin versus curcumin in amelioration of deltamethrin induced hippocampal damage. Histochem Cell Biol. 154, 157-175 (2020).
  17. Zhang, J., et al. Exposure to deltamethrin in adolescent mice induced thyroid dysfunction and behavioral disorders. Chemosphere. 241, 125118(2020).
  18. Ahmed, W. M. S., Abdel-Azeem, N. M., Ibrahim, M. A., Helmy, N. A., Radi, A. M. Neuromodulatory effect of cinnamon oil on behavioural disturbance, CYP1A1, İnos transcripts and neurochemical alterations induced by deltamethrin in rat brain. Ecotoxicol Environ Saf. 209, 111820(2021).
  19. Khalifa, A. G., et al. Deltamethrin and Its Nanoformulations Induce Behavioral Alteration and Toxicity in Rat Brain through Oxidative Stress and JAK2/STAT3 Signaling Pathway. Toxics. 10, 303(2022).
  20. Khalil, H. M. A., et al. Selenium nanoparticles impart robust neuroprotection against deltamethrin-induced neurotoxicity in male rats by reversing behavioral alterations, oxidative damage, apoptosis, and neuronal loss. Neurotoxicology. 91, 329-339 (2022).
  21. Lazarinia, C. A., Florioa, J. C., Lemonicab, I. P., Bernardi, M. M. Effects of prenatal exposure to deltamethrin on forced swimming behavior, motor activity, and striatal dopamine levels in male and female rats. Neurotoxicol. Teratol. 23, 665-673 (2001).
  22. Takasaki, I., et al. Type II pyrethroid deltamethrin produces antidepressant-like effects in mice. Behav Brain Res. 257, 182-188 (2013).
  23. Ramachandran, S., Thangarajan, S. A novel therapeutic application of solid lipid nanoparticles encapsulated thymoquinone (TQ-SLNs) on 3-nitroproponic acid induced Huntington’s disease-like symptoms in wistar rats. Chem Biol Interact. 256, 25-36 (2016).
  24. Ramachandran, S., Thangarajan, S. Thymoquinone loaded solid lipid nanoparticles counteracts 3-Nitropropionic acid induced motor impairments and neuroinflammation in rat model of Huntington’s disease. Metab Brain Dis. 33, 1459-1470 (2018).
  25. Firdaus, F., Zafeer, M. F., Ahmad, M., Afzal, M. Anxiolytic and antiinflammatory role of thymoquinone in arsenicinduced hippocampal toxicity in Wistar rats. Heliyon. 4, e00650(2018).
  26. Abu-Elfotuh, K., et al. The protective effect of thymoquinone or/and thymol against monosodium glutamate-induced attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD)-like behavior in rats: Modulation of Nrf2/HO-1, TLR4/NF-?B/NLRP3/caspase-1 and Wnt/?-Catenin signaling pathways in rat model. Biomed. Pharmacother. 155, 113799(2022).
  27. Eker, A., Eraslan, G. Single and combined effect of chrysin and N-acetylcysteine against deltamethrin exposure in rats. Food Chem. Toxicol. 196, 115191(2025).
  28. Tekeli, M. Y., Eraslan, G., Bayram, L. Ç, Sarıca, Z. S. Effect of diosmin on lipid peoxidation and organ damage against subacute deltamethrin exposure in rats. Environ Sci Pollut Res Int. 28, 15890-15908 (2021).
  29. Armstrong, L. E., et al. Effects of Developmental Deltamethrin Exposure on White Adipose Tissue Gene Expression. J Biochem Mol Toxicol. 27 (2), 165-171 (2013).
  30. Shi, W., Zhang, D., Wang, L., Sreeharsha, N., Ning, Y. Curcumin synergistically potentiates the protective effect of sitagliptin against chronic deltamethrin nephrotoxicity in rats: Impact on pro-inflammatory cytokines and Nrf2/Ho-1pathway. J Biochem Mol Toxicol. 33, e22386(2019).
  31. Li, M., et al. Protective effects of thymol on deltamethrin-induced toxicity of Channa argus in association with the NF-κB/Nrf2/p53 pathway. Aquaculture. 559, 738429(2022).
  32. Li, H., Shi, N., Wu, S., Huang, X. Effect of deltamethrin on production of free radical and transcription factor Nrf2 in rats' brain tissue. Chin. J. Ind. Hyg. Occup. Dis. 27 (10), 593-596 (2009).
  33. Li, H. Y., Wu, S. Y., Ma, Q., Shi, N. The pesticide deltamethrin increases free radical production and promotes nuclear translocation of the stress response transcription factor Nrf2 in rat brain. Toxicol Ind Health. 27 (7), 579-590 (2011).
  34. Aboubakr, M., et al. Antioxidant and Anti-Inflammatory Potential of Thymoquinone and Lycopene Mitigate the Chlorpyrifos-Induced Toxic Neuropathy. Pharmaceuticals (Basel). 14, 940(2021).
  35. Abdel-Daim, M. M., et al. Thymoquinone and diallyl sulfide protect against fipronil-induced oxidative injury in rats. Environ Sci Pollut Res Int. 25, 23909-23916 (2018).
  36. Qadri, M. M., et al. Thymoquinone Ameliorates Carfilzomib-Induced Renal Impairment by Modulating Oxidative Stress Markers, Inflammatory/Apoptotic Mediators, and Augmenting Nrf2 in Rats. Int J Mol Sci. 24, 10621(2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.