Рамановский спектральный анализ серотонин-чувствительного наносенсора ssDNA-SWCNT с помощью машинного обучения для улучшения селективности против дофамина

Summary

Протокол описывает рамановский спектральный анализ наносенсора SWCNT, обёрнутого ssDNA, что позволяет улучшить селективное измерение серотонина по сравнению с дофамином с помощью модели машинного обучения.

Abstract

Серотонин (5-гидрокситриптамин, 5-ГТ) играет ключевую роль в нейромодуляции, однако современные методы обнаружения испытывают трудности с обеспечением реального времени с высокой чувствительностью и селективностью в реальном времени. Ранее мы разработали наносенсор серотонина в ближнем инфракрасном диапазоне (nIRHT), который состоит из одностенных углеродных нанотрубок, обёрнутых SSDNA, чувствительно обнаружующих 5-HT. Однако флуоресцентный ответ nIRHT не может отличить 5HT от дофамина (DA), что ограничивает его практическое применение. В этом исследовании рамановская спектроскопия в сочетании с машинным обучением преодолевает эту проблему селективности. Спектральные особенности G-диапазона выявили чёткие сигнатуры для 5HT против DA связывания с nIRHT, при этом DA вызывает более сильное подавление G-диапазона. Мы применили дифференциальный метод Рамана (ΔRaman) для выделения специфических для анализа спектральных изменений и обучали три модели машинного обучения для классификации. Модель случайного леса с ΔRaman достигла оптимальной точности 95,8%, значительно превосходя модели с необработанными рамановскими спектрами. Этот подход показал улучшенную специфичность, с незначительными ответами на ацетилхолин, ГАМК и глутамат, и достиг предела обнаружения 0,1 мкм, подходящего для физиологических применений. Этот подход на основе Рамана превращает неселективный nIRHT флуоресцентный сенсор в платформу, способную к надёжной дискриминации нейромедиаторов, преодолевая проблемы селективности в молекулярном сенсоре на основе одностенных углеродных нанотрубок (SWCNT).

Introduction

Серотонин (5-гидрокситриптамин, 5-ГТ) — это критически важный нейромедиатор, регулирующий настроение, когнитивные функции, сон и аппетит, при этом дисфункция связана с депрессией, тревожностью и другими нейропсихиатрическими^{расстройствами. 1}. Мониторинг динамики серотонина в биологических системах в реальном времени остаётся сложным из-за миллисекундного временного масштаба синаптической передачи и сложной химической среды нервной^{ткани 2}. Несмотря на значительные достижения в технологиях обнаружения нейромедиаторов, достижение как высокой чувствительности, так и молекулярной селективности серотонина по-прежнему представляет значительные аналитические задачи.

Современные методы обнаружения серотонина охватывают от традиционных аналитических методов до новых платформ наносенсоров. Высокоэффективная жидкостная хроматография с электрохимическим обнаружением (HPLC-ED) остаётся золотым стандартом, достигая пределов обнаружения 0,056 нМ с отличной^{воспроизводимостью 3}. Однако ВЭЖХ требует длительной подготовки образцов и 15-30 минут анализа, что исключает мониторинг в реальном^{времени 4}. Циклическая вольтамметрия быстрого сканирования (FSCV) обеспечивает временное разрешение субсекунды на микроэлектродах из углеродного волокна, но страдает от загрязнения электродов и ограниченной селективности между структурно похожими^{нейромедиаторами 5,6}. Недавние разработки в области генетически кодируемых флуоресцентных сенсоров, включая iSeroSnFR⁷ и GRAB-5HT⁸, достигают значительной чувствительности и динамического диапазона, но требуют генетической модификации целевых тканей, что ограничивает клиническую трансляцию.

Одностенные углеродные нанотрубки (SWCNT) оптические сенсоры стали перспективными платформами для обнаружения нейротрансмиттеров без меток⁹. ДНК-функционализированные SWCNT проявляют модуляцию флуоресценции в ближнем инфракрасном диапазоне (nIR) при связывании с анализом, что позволяет обнаруживать их в тканевом прозрачном окне (900-1400 нм)^10,11. Группа Лэндри разработала сенсор nIRHT путём систематической эволюции лигандов путём экспоненциального обогащения (SELEC), скринингуя ~¹⁰ уникальных последовательностей ssDNA для выявления конструктов, чувствительных к серотонине^{, 12}. Этот сенсор достигает чувствительности к микромолярной с усилением флуоресценции на 200% при связывании серотонина, действуя независимо от окисления дофамина или серотонина. Чтобы исключить окислительные помехи, наше предыдущее исследование подтвердило стабильность этих растворов нейротрансмиттеров; Анализы УФ-ВИС и ЯМР не выявили окисляющих изменений или новых пиков по сравнению с чистым^{5HT 12}. Кроме того, короткое время инкубации и нейтральные условия pH, используемые в системе, предотвращают значительное образование хинона. Аналогично, группа Strano впервые разработала молекулярное распознавание коронофазы (CoPhMoRe), показав, что SWCNT, обёрнутые (GT)₁₅, обёрнутые (GT)₁₅, обнаживают дофамин при концентрациях 11^{нМ 13}. Наша группа недавно продвинула эту область с помощью оптимизации с помощью машинного обучения, достигнув улучшения чувствительности в 2,5 раза с помощью высокопроизводительного скрининга систематически мутировавшихся^{последовательностей 14}.

Несмотря на эти достижения, существует фундаментальное ограничение в недостаточной селективности между серотонином и дофамином. Оба нейромедиатора содержат ароматические кольца и этиламиновые цепи, отличаясь только одной гидроксильной^{группой 15}. Современные флуоресцентные сенсоры SWCNT обычно достигают селективных соотношений ниже 5:1, что недостаточно для различия совместно высвобождаемых нейротрансмиттеров в синаптических^{условиях 16}. Этот вызов избирательности особенно критичен, учитывая, что серотонин и дофамин часто соотносятся в областях мозга, определяющих вознаграждение и^{мотивацию 17}.

Рамановская спектроскопия предоставляет дополнительную химическую информацию посредством колебательного анализа комплекса^{SWCNT-аналитов 18}. G-диапазон (~1580 см⁻¹) SWCNTs делится на компоненты G⁺ и G⁻, с частотами, чувствительными к молекулярной адсорбции и электронному^{легированию 19}. Предыдущее исследование показало, что нековалентные поверхностно-активные вещества на SWCNT вызывают выраженные рамановские спектральные изменения в области^{G-диапазона 20}.

В этой работе мы демонстрируем рамановский спектральный анализ датчика nIRHT с помощью машинного обучения для достижения повышенной селективности между серотонином и дофамином. Мы систематически охарактеризовали концентрационно-зависимые рамановские ответы от 0,01 до 100 мкм, выявив отдельные спектральные отпечатки пальцев для каждого нейромедиатора. Три модели машинного обучения — сверточная нейронная сеть (CNN), опорная векторная машина (SVM) и случайный лес (RF) — были обучены на спектральных наборах данных для классификации идентичности анализа. Критически важно, мы вводим дифференциальную рамановскую обработку, которая удаляет базовые сигналы для выделения специфических к анализу признаков. Оптимизированная RF-модель с обработкой DR достигает точности классификации 95,8%, что является значительным прогрессом в молекулярной дискриминации. Этот мультимодальный подход, сочетающий чувствительность к nIR флуоресценции с химической специфичностью Рамана, открывает путь к селективному мониторингу серотонина в реальном времени в сложных биологических условиях.

Protocol

1. изготовление наносенсоров SWCNT nIRHT с помощью ssDNA-функционализации

1. Объедините 1 мг одностенных углеродных нанотрубок (SWCNTs), 100 мкл 1 мМ E6#9 ssDNA и 900 мкл 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) в пробирке объемом 1,5 мл.
   ВНИМАНИЕ: Сухой порошок SWCNT представляет потенциальную опасность ингаляции. Помещайте порошок в сертифицированный капляр для химических выбросов и носите соответствующие средства индивидуальной защиты, включая маску и перчатки.
2. Распределите смесь с помощью соникатора для ванны на 5 минут. Соникизуйте смесь с помощью наконечного соникатора с датчиком 3 мм с амплитудой 50% в течение 30 минут в ледяной ванне.
3. Центрифугуйте соничный раствор при 21 500 x g в течение 1 часа для осадки недисперсных SWCNT. Аккуратно соберите 850 мкл супернатанта и переместите его в новую трубку.
4. Измерьте поглощение собранной суспензии SWCNT на длине волны 632 нм. Вычислите концентрацию с использованием коэффициента вымирания SWCNT 0,036 (мг/л)⁻¹ см⁻¹. Последнюю раствор датчика nIRHT храните при 4 °C до дальнейшего использования.

2. Измерение спектров Рамана

1. Загрузите 90 мкл дисперсии 10 мг/л nIRHT в пластину на 96 лунок. Измерьте рамановский спектр датчика в буфере PBS с помощью источника возбуждения лазера диаметром 532 нм. Установите этот записанный спектр в качестве базовой линии.
   ВНИМАНИЕ: Крайне важно строго поддерживать мощность лазера на уровне 10 мВт и длину волны на 532 нм при исследовании живых биологических образцов. Более высокая мощность лазера может вызвать сильную фототоксичность и снизить жизнеспособность клеток. Лазер 532 нм при мощности 10 мВт, используемый в этом протоколе, хорошо зарекомендовал себя как безопасный и неразрушительный для анализа живых клеток, сохраняя чувствительные^{органеллы 21} и электрофизиологическую активность первичных^{нейронов 22} , при этом обеспечивая надёжное приём рамановского сигнала.
2. Спайковать каждую 90 мкл сенсорного раствора (10 мг/л) с 10 мкл раствора анализа, чтобы достичь конечных концентраций 0,01, 0,1, 1, 5, 10, 50 и 100 мкм. Подождите 5 минут после добавления анализа, чтобы обеспечить достаточное количество инкубации.
3. Измерьте рамановские спектры инкубированных образцов. Подготовьте образцы в трёх экземплярах для каждой концентрации и повторите шаги 2.1–2.2 для обеспечения воспроизводимости.

3. Анализ данных на основе машинного обучения

1. Постройте набор данных из общего числа 208 рамановских спектров, включающих 77 дофаминовых (DA) ответов, 76 серотониновых (5HT) ответов и 47 контрольных (PBS) групповых ответов.
2. Выполните фоновый вычитание области G-диапазона спектральных данных. Нормализуйте фоновые данные, вычитаемые на основе пика диапазона G+.
3. Примените медианный фильтр для уменьшения шума в нормализованных спектрах. Изолировать спектральные изменения (ΔRaman), вычитая нормализованный контрольный спектр из каждого спектра, обработанного анализом.
4. Разработать модель сверточной нейронной сети (CNN), случайного леса (RF) и машины опорного вектора (SVM) для тройной классификации 5HT, DA или управления.
5. Разделите весь набор данных на обучающие, валидационные и тестовые наборы в соотношении 6:2:2.
6. Конфигурировать архитектуру CNN с тремя одномерными слоями свёртки с использованием функции активации ReLU и максимального размера пула 2, за которыми следуют два полностью связанных слоя.
7. Настройте SVM с помощью ядра радиальной базисной функции (RBF) для нелинейной классификации.
8. Настройте RF-модель с использованием стандартных гиперпараметров.
9. Обучайте построенные модели с помощью пятикратной кросс-валидации. Рассчитайте средние показатели эффективности по всем пяти этапам для обеспечения статистической надёжности.
10. Выберите модель, которая даст наивысшую точность валидационных данных для окончательного анализа.
11. Оцените выбранную модель на тестовом наборе для проверки её возможности обобщения.
12. Определите косвенный предел обнаружения (LOD), последовательно исключая данные из обучающего набора, которые ниже порога концентрации 0,1 мкм.
13. Проверьте обученную модель по всему диапазону концентраций, включая концентрации ниже критериев, чтобы определить окончательный LOD.

Results

Функционализированный наносенсор SWCNT (nIRHT) на основе SSDNA E6#9, ранее разработанный по методологии SELEC, демонстрирует обратимое усиление nIR флуоресценции при связывании 5HT, позволяя осуществлять в реальном времени 5HT изображения in vitro и ex vivo¹². Последовательность E6#9 (5'-CCCCCCAGCACCACACACACCCCC-3') обвивает SWCNT, создавая сайты связывания для 5HT. Однако этому датчику не хватает специфичности: и 5-HT, и DA приводят к сопоставим...

Discussion

Рамановский спектроскопический анализ значительно повысил специфичность датчика nIRHT, что невозможно с его традиционным флуоресцентным ответом. Мы наблюдали, что DA вызывает более выраженное подавление G⁻-диапазона (1570 ^см-1) по сравнению с 5HT. Эти дифференциальные сигнатуры, вероятно, возникают из-за различных молекулярных ориентаций и геометрий связывания на поверхности SWCNT. В частности, катехольная часть DA, вероятно, формирует более сильные π-π взаимодействия с поверх...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HiPCo raw	Nanointegris
iDus1.7 InGaAs	АНДОР	DU490A-1,9
Рамантуш	Нанофотон
Vibra Cell 130	SONICS