Методическая статья

Многоживотная магнитно-резонансная томография для измерения опухолей в моделях мышей с раком поджелудочной железы

1.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69927

⸱

3 февраля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Precision Health Program, Michigan State University, 2Department of Radiology, College of Human Medicine, Michigan State University, 3Veterinary Diagnostic Laboratory, College of Veterinary Medicine, Michigan State University, 4Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Biomedical Imaging, Advanced Molecular Imaging Facility, Michigan State University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол использует многокамерное ложо для параллельной магнитно-резонансной томографии (МРТ) до четырёх животных с целью выявления опухолей аденокарциномы поджелудочной железы в генетически модифицированных моделях мышей. Этот протокол многоживотного МРТ является быстрым и экономически эффективным для выявления и измерения опухолей, облегчая отбор животных для доклинических исследований и продольный мониторинг роста опухоли.

Аннотация

Продвинутые методы in vivo томографии, такие как магнитно-резонансная томография (МРТ), являются необходимыми исследовательскими инструментами для эффективного обнаружения опухолей в доклинических моделях мышей. МРТ предоставляет подробную анатомическую информацию о расположении и размере опухоли. Однако этот метод визуализации дорогой и занимает много времени. Чтобы преодолеть этот барьер доступа без ущерба качеству визуализации, был внедрён протокол МРТ с многократными животными. Этот протокол использует четырёхкамерную вкладку для получения высококачественных многоживотных анатомических МРТ за одну сессию сбора данных. Одновременное воображение нескольких мышей сокращает время и стоимость этой процедуры. Этот протокол описывает многоживотный процесс МРТ, направленный на повышение эффективности обнаружения опухолей и продольного мониторинга опухолей в генетически модифицированной модели мышей с удалением p53 (KPC) поджелудочной поджелудочной железы. Эта хорошо зарекомендовавшая себя клинически значимая модель KPC дала бесценное понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе канцерогенеза поджелудочной железы, прогрессирования опухолей и устойчивости к лечению. В качестве доказательства концепции этот протокол применяется для подтверждения терапевтической пользы стандартного химиотерапевтического препарата гемцитабина в модели KPC. Кратко обсуждаются будущие применения этого дизайна доклинического исследования под руководством МРТ для оценки терапевтической эффективности комбинированных методов.

Введение

Аденокарцинома протоков поджелудочной железы (PDAC) остаётся одним из самых опасных злокачественных опухолей. Несмотря на небольшие улучшения выживаемости за последние годы, уровень выживаемости за 5 лет всё ещё составляет всего 13%1. В большинстве случаев PDAC обнаруживается на поздней стадии, часто сопровождающейся локальной инвазией или дальними метастазами, что усложняет лечение. Заболевание биологически разнообразно и характеризуется высокоинвазивными опухоловыми клетками, плотной десмопластической стромой и плохой сосудистой 2,3,4. Эта сложная микросреда опухолей продолжает препятствовать усилиям по полной характеристике клеточных и неклеточных компонентов, влияющих на прогрессирование заболевания. Для решения этой проблемы необходимы эффективные доклинические модели, которые тесно имитируют прогрессирование человеческих заболеваний и десмоплазию.

Различные модели мышей могут использоваться для изучения биологии прогрессирования рака и оценки эффективности новыхтерапевтических средств 5,6. Генетически модифицированная мышиная модель (GEMM), управляемая KRas, спонтанно развивает опухоли поджелудочной железы, которые воспроизводят многие патофизиологические и молекулярные особенности человеческогоPDAC 3,7,8,9,10,11. В частности, модель KPC с приводом Kras, удалённая p53 (LSL-KrasG12D; p53lox/+; Pdx1-Cre) — хорошо охарактеризованный PDAC GEMM 7,8,9. Визуализация опухолей является важным компонентом доклинических исследований. Обнаружение опухолей и измерение размера опухоли позволяют отбирать животных для доклинических исследований, проводить продольный мониторинг роста опухоли и прогрессирования заболевания, а также оценивать ответ на лечение.

Современные методы in vivo визуализации, такие как ультразвуковая томография (США), биолюминесценция (BLI), компьютерная томография (КТ), флуоресцентная визуализация (FLI), позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) и магнитно-резонансная томография (МРТ), могут использоваться для томографирования опухолей в модели KPC и аналогичных моделяхPDAC 12,13,14,15,16 . Тем не менее, визуализация опухолей в модели KPC может быть сложной, и каждая из этих методов имеет свои сильные стороны и ограничения. Оптические технологии визуализации, такие как биолюминесценция (BLI) и ультразвуковая визуализация (США), являются неинвазивными и экономически эффективными. Однако их ограниченное пространственное разрешение, особенно для внутренних органов, может привести к плохой корреляции с объёмомопухоли 12,15,17,18. Биолюминесценция требует генетически модифицированных клеток, экспрессирующих сигнал люциферазы, который также зависит от доставки субстрата, кровотока и оксигенации тканей. Компьютерный томограф обеспечивает быструю визуализацию с минимальными артефактами движения, но с низким контрастом мягких тканей без контрастных агентов. Йодированный контраст может вызывать токсичность у мышей. Флуоресцентная визуализация требует контрастных веществ и флуоресцентных зондов, а аутофлуоресценция органов брюшной полости снижает чувствительность.

Из-за ограничений, связанных с другими методами визуализации, магнитно-резонансная томография (МРТ) обычно считается самым надёжным методом оценки глубоко укоренившихся опухолей, обеспечивая превосходный контраст мягких тканей и молекулярную чувствительность для внутренних анатомическихструктур 13,14,15,19 . Однако стандартные доклинические протоколы МРТ связаны с высокими операционными затратами и длительными сроками приобретения и могут стать препятствием для многих исследовательских лабораторий. МРТ для многих животных может преодолеть этот барьер доступа, сокращая время подготовки животных до сканирования (анестезия), время сканирования и восстановление животных после сканирования. Этот протокол демонстрирует техническую осуществимость визуализации опухолей PDAC (рисунок 1, рисунок 2, рисунок 3 и рисунок 4) и использование находок изображений для привлечения животных к химиотерапевтическому лечению гемцитабином (рисунок 5). Опухоли PDAC демонстрируют множество врождённых механизмов, способствующих устойчивости к препаратам стандартной химиотерапии (SOC). например, гемцитабин, гемцитабин/наб-паклитаксел или FOLFIRINOX 2,3,4. Этот протокол предоставляет подходящую и надёжную платформу для оценки новых терапевтических препаратов и химиотерапии SOC, чтобы найти перспективныекомбинации 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, способные улучшить ответ на лечение у пациентов.

Протокол

Все описанные эксперименты проводились в соответствии с протоколами, одобренными Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Мичиганского государственного университета. Все процедуры, связанные с живыми животными, соответствуют установленным рекомендациям для обеспечения благополучия и гуманного обращения с ними. Этот протокол описывает использование и обработку мышиной модели PDAC KPC: LSL-K-Ras G12D (Krastm4Tyj); p53lox/lox (Trp53tm1Brn); Pdx1-Cre (Pdx1-cre6Tuv)9.

1. Подготовка животных до визуализации

  1. Обеспечьте правильную генотипизацию мышей KPC перед использованием. Транспортировать экспериментальных мышей из объекта для животных в центр визуализации.
  2. Анестезировать до четырёх мышей в предварительно нагретой герметичной индукционной камере с 1,5-2% изофлурана и 0,8-2 л/мин кислорода. Подтвердите анестезию, применяя ядовитый стимул (щипка пальцев).
  3. Нанесите офтальмологическую смазку на оба глаза каждой мыши, чтобы предотвратить высыхание роговицы.

2. Установка многоживотного МРТ-ложи

  1. Поместите двух анестезиированных мышей в вентральное положение на нижней части (слева и справа) 3D-печатной кровати, которая крепится к стандартному держателю для ПЭТ/МРТ, предоставленному поставщиком. Убедитесь, что животные расположены с прямыми позвоночниками и конечностями.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для печати вкладышей стола (Дополнительный файл 1 и Дополнительный файл 2) использовался 3D-принтер.
  2. Подключите воздуховход в кузове вендора с носовыми конусами с помощью трубок (внутренний диаметр 1/16", внешний диаметр 1/8") и фитингов люра (например, 7 x 1/16" — мужские, 2 x 1/16" разъёма, 2 разъёма женско-женские, 2 Т-гнезда к гнезду).
  3. Закрепите голову мыши в носовом конусе для поддержания анестезии (1,5-2% изофлуран, 0,8-2 л/мин кислорода). Накройте низ верхней частью 3D-печатных вставок (рисунок 2B).
  4. Поместите остальных двух анестезиированных мышей в вентральное положение на верхней части (слева и справа) 3D-печатной вставки для кровати.
  5. Закрепите голову мыши в носовом конусе для поддержания анестезии (1,5-2% изофлуран, 0,8-2 л/мин кислорода).
  6. Прикрепите дыхательную панель к верхнему левому углу мыши. Убедитесь, что мониторинговая панель находится на уровне брюшной полости, а не груди, чтобы измерять дыхание без сигнала от сердечного ритма.
  7. Установить уровень изофлурана так, чтобы дыхание составляло 30-40 ударов в минуту на протяжении всего сканирования, обычно 1,5-2%. Если следы дыхания не видны или амплитуда слишком мала, убедитесь, что колодка надёжно закреплена лентой и что все соединения в трубке плотно расположены.
  8. Накройте стол, чтобы завершить мультиживотную камеру МРТ (рисунок 2B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: ПЭТ/МРТ-койка для одной крысы, предоставляемая поставщиком, оснащена циркуляционным тёплым воздухом для поддержания температуры тела животных (~35-37 °C). Можно одновременно сканировать до четырёх мышей с помощью 3D-печатных вставок. Точные настройки температуры тёплой воды, а также скорости поступления и выбросов воздуха зависят от конфигурации на каждом месте, включая расстояние от диспетчерской до МРТ. Их можно установить на каждом объекте с помощью серии пилотных сканировок, где температура контролируется на протяжении всего этапа и затем стандартизируется для каждого исследования.

3. Настройка Prescan и калибровка изображения

  1. Убедитесь, что мыши находятся в центре катушки МРТ вдоль, выровняя красный лазер с центром многокамерного стола перед тем, как отправить держатель в ствол.
  2. Назначьте метку сканированию с помощью идентификатора мыши и даты сканирования в следующем формате: Strain, Mouse ID, Scan Date.
  3. Настройте взвешенное FLASH-сканирование T1 с одним осевым срезом, двумя корональными срезами и двумя сагиттальными срезами, чтобы визуализировать мышей в четырёхкамерном слое и определить область изображения с помощью следующих параметров: TR/TE 50/2,4 мс, 2 средних, угол переворота 20°, разрешение 0,313 мм, толщина среза 1 мм, время сканирования 13 с.
  4. Проверьте, что всё тело мыши находится в поле зрения и мыши прямые. Если нет, повторяйте шаги по позиционированию мыши и/или перемещайте её внутрь или из канала ствола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры были основаны на спецификациях используемой системы МРТ. Эти параметры можно корректировать по мере необходимости для оптимизации получения изображений в соответствии с экспериментальными требованиями и/или возможностями системы МРТ.

4. Многоживотная магнитно-резонансная томография

  1. Настройте T2-взвешенную последовательность быстрого спин-эха со следующими параметрами: время повторения (TR): 3 200 мс, время эха: 46 мс, количество средних показателей: 10, разрешение в плоскости: 300 x 300 мкм, количество корональных срезов: 14, зазор внутри среза: 0,3 - 0,7 мм, подавление жира: включено, редкий фактор: 8, пакеты срезов: 2, общее время получения изображения: 14 мин.
  2. Нажмите на центр (перевод) и край (вращение) жёлтого и зелёного окна на изображении локализатора, чтобы отрегулировать положение упаковки срезов по мере необходимости и оптимизировать покрытие области поджелудочной железы и других органов брюшной полости для верхней и нижней группы животных.
  3. Убедитесь, что все четыре мыши правильно выровнены в многоживотной грядке, прежде чем приступать к сканированию.
  4. Следите за дыханием на протяжении всех последовательностей визуализации и при необходимости корректируйте уровень изофлурана.
  5. После завершения МРТ проверьте адекватное качество изображения. Ищите артефакт движения, который отображается как размытый, если мышь двигалась во время сканирования. Проверьте полное покрытие брюшной полости. Если нужно, переместите мышей и повторите сканирование.

5. Восстановление мыши

  1. После завершения и подтверждения сканирования вынимите стол из системы МРТ.
  2. Откройте верхнюю часть многокамерной платформы. Снимите респираторный монитор с верхнего левого угла мыши и перенесите животных с верхней и нижней части 3D-печатных вставок в клетку для восстановления.
  3. Поместите животных в клетку для восстановления поверх грелки при температуре 37 °C для восстановления после наркоза.
  4. Следите за частотой дыхания и движениями, чтобы обеспечить полное восстановление после наркоза перед возвращением мышей в домашние клетки. Признаки восстановления включают нормальное дыхание и движение (ходьбу).

6. Обработка и анализ файлов магнитно-резонансной томографии

  1. Экспортировать изображения DICOM из МРТ-программы в программу для анализа изображений, чтобы обрезать изображения с одного изображения с четырьмя мышами на одно изображение для каждой отдельной мыши.
  2. В программном обеспечении откройте изображение верхнего набора животных в модуле View . Автоматические настройки окна/уровней достаточны, но при необходимости можно отрегулировать в общей вкладке управления изображением , чтобы мыши были видны. Во вкладке VOI вручную нарисуйте большой квадрат вокруг правого верхнего угла мыши с помощью аналитического объекта куба; затем обрезайте изображение вокруг этого блока со вкладки операций маскировки и контурирования . При сохранении нового файла отредактируйте метаданные и имя файла DICOM на правильный идентификатор мыши; затем повторите для верхнего левого угла, используя то же изображение, откройте изображение для нижней группы мышей и повторите обрезку и сохранение возврата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: VOI не обязан быть точным.
  3. Используйте программное обеспечение для просмотра МРТ для анализа изображений, хранящихся в файлах DICOM.
  4. Анализируйте срезы визуализации от дорсального к вентральному или вентральному к дорсальному. Определите селезёнку и желудок, чтобы создать подходящий контекст для выявления опухолей поджелудочной железы и/или поджелудочной железы.
  5. Определите «область интереса» (ROI), проведя линию на границе опухоли и выполнив полуавтоматическую сегментацию для расчёта объёма опухоли. Обратите внимание на жидкостные кисты и другие гиперхроматические признаки (рисунок 3 и рисунок 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа файлов DICOM следует использовать просмотрщик МРТ.

7. Лечение гемцитабином

  1. Проводите МРТ животных с KPC еженедельно до тех пор, пока опухоль не начнёт формироваться и не будет обнаружена (объём ≥20мм 3). Перед сканированием убедитесь, что мыши в хорошем здоровье (нет чрезмерной потери веса или признаков дискомфорта, затруднённого дыхания и/или задыха).
  2. Разработайте схему лечения после выполнения критериев по опухоли.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обработанной группы гемцитабин вводили внутрибрюшинно (i.p.) с дозой 100 мг/кг дважды в неделю.
    ВНИМАНИЕ: Гемцитабин — цитотоксическое химиотерапевтическое средство. Обращайтесь с соответствующими средствами индивидуальной защиты (СИЗ), включая перчатки и лабораторный халат. Утилизировать загрязнённые шприцы и материалы в соответствии с институциональными протоколами по опасным отходам.
  3. Проводите МРТ (следуя разделам 1-6) раз в неделю для мониторинга ответа опухоли на гемцитабин.
  4. Жертвоприношение животных, если опухоль соответствует критериям эвтаназии на основе измерений объёма МРТ (раздел 6) и/или других симптомов.
  5. При МРТ-сканировании леченных мышей устанавливайте защитный барьер, чтобы предотвратить возможный перенос химиотерапевтического вещества через выделения. Во время и после работы с гемцитабином соблюдайте соблюдение личной гигиены. Утилизируйте использованные пустые шприцы в контейнер для химиотерапевтических острых предметов.
  6. После завершения работы распылите все анестезиологические аппараты, кровать для МРТ и все рабочие поверхности 70% этанола. Поместите химически загрязнённые защитные барьеры и перчатки, используемые при съёмке, в пластиковый пакет, завяжите пакет и поместите его в волокнистую бочку для сжигания.
  7. Запишитесь на сеансы визуализации перед следующим этапом лечения, чтобы минимизировать воздействие химиотерапевтического препарата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Частота МРТ раз в две недели может рассматриваться в зависимости от скорости роста опухоли и схемы лечения. Ответы на лечение кинетикой опухолей можно оценить с помощью продольной визуализации (см. рисунок 5).

Результаты

У животных с KPC развиваются опухоли поджелудочной железы после 12 недельв возрасте 9 лет. С помощью многокамерной МРТ-койки в 10 недель был начат опухолевой скрининг мышей KPC. Это позволило привлекать животных с опухолями примерно 200мм 3 для доклинического исследования с помощью гемцитабина. Наблюдались различия в кинетике опухолей и вариации в её проявлении. Большинство опухолей KPC демонстрировали солидный рост с одним или преобладающим фокусом (рисунок 4A), что способствовало привлечению животных для лечения и оценке объёма опухоли. Однако также наблюдались животные с множеством мелких солидных опухолей, распространяющихся по всей поджелудочной железе (рисунок 4A). В некоторых случаях PDAC также могут наблюдаться внутриопухолевые кистозные поражения, заполненные жидкостью, сопровождающиеся перитухоловыми неопуховыми кистозными поражениями и задержкой жидкости в результате проточечной закупорки желчного пузыря и/или поджелудочной железы. (Рисунок 4A).

После набора животных случайным образом распределяли на две экспериментальные группы: контрольную группу, которая не получала лечения, и группу, получившую внутрибрюшинное (i.p.) введение гемцитабина в дозе 100 мг/кг дважды в неделю. Из общего числа 23 подходящих животных 4 самки и 7 самцов были распределены в контрольную группу, а 6 самок и 6 самцов — в обработанную группу. Еженедельные МРТ-сканирования проводились с использованием многоживотной системы (рисунок 5A), что позволило нам непрерывно отслеживать изменения в кинетике роста опухолей как в контрольной, так и в лечебной группе (рисунок 5B).

Обработанные данные визуализации показывают, что опухоли в модели KPC, обработанной гемцитабином, имели более медленный рост по сравнению с нелеченной контрольной группой (рисунок 5C), что было связано со статистически значимым (тест ранга Log, p = 0,04) увеличением общей выживаемости осмотренной когорты (рисунок 5D). Медианная выживаемость нелеченных KPC составила 20 недель, тогда как у лечённой группы медианная выживаемость продлилась более 23 недель (рисунок 5D).

Рисунок 1
Рисунок 1: Рабочий процесс многоживотной магнитно-резонансной томографии, обработки и анализа изображений. Ключевые этапы протокола многоживотного МРТ выделены — от подготовки к предсканированию до доклинических исследований с визуализированным руководством. До 4 животных анестезируются в индукционной камере (подготовка по предварительному сканированию) и готовятся к размещению в многоживотной койке (многоживотное МРТ-ложа). Прескан животных в конфигурации 2 x 2 (2 в верхнем отсеке, 2 в нижнем отсеке), после чего проводится магнитно-резонансное сканирование (МР). Данные изображения каждого животного сохраняются как отдельные файлы и анализируются независимо (анализ изображений). Поиск изображений и размер опухоли используются для отбора животных для доклинических исследований и мониторинга ответа на лечение (доклинические испытания). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2: Ключевые шаги для многоживотного МРТ от установки до сканирования. (A) Верхняя панель, сборка индивидуальной мультиживотной МРТ-платформы. Специально разработанные 3D-печатные вкладыши с интегрированными анестезиологическими портами помещаются в стандартный держатель для ПЭТ/МРТ для одной крысы. Нижняя панель, эти 3D-печатные вставки делят стол на две камеры, позволяя одновременно снимать до четырёх животных: животных 1 и 2 поверх верхней вставки и животных 3 и 4 поверх нижнего вставка. Показаны поперечная плоскость и фронтальная модифицированная плоскость вставок для 3D-принтера из STL-просмотра. (B) Последовательное размещение мышей в многокамерном МРТ-ложе (сверху вниз). Верхнее изображение — два животных, расположенные в вентральной позиции на нижней части (слева и справа) 3D-печатного вставка, который находится внутри ПЭТ/МРТ-койки, предоставленной поставщиком. Среднее изображение — две другие мыши расположены в вентральной положении в верхней части (слева и справа) 3D-напечатанной вставки; Мышь, расположенная слева от верхней вставки, оснащена респираторным монитором. Нижнее изображение: завершённая сборка четырёх животных, установленная крышкой сверху. У всех животных головы закреплены в носовом конусе для поддержания анестезии (1,5-2% изофлуран, 0,8-2 л/мин кислорода). Окончательное размещение всех четырёх животных в держателе для МРТ с подачей анестезии, теплым водонагревателем и системой мониторинга жизненных показателей, чтобы позволить сканирование МРТ и сбор данных всех животных за одну сессию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Сбор и обработка данных с помощью многоживотных МРТ. (A) Репрезентативный вид (медиальная плоскость) начального МРТ-сканирования всех четырёх животных. (B) МРТ-сканирование (дорсальная плоскость) всех четырёх мышей в многокамерной платформе: две мыши расположены снизу (3, 4) и две мыши сверху (1, 2) 3D-печатных вкладышей. (C) Финальный файл МРТ высокого разрешения каждого отдельного сканирования мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: Разнообразные проявления опухолей PDAC: интегрированный МРТ и гистологический анализ. (A) Репрезентативное изображение МРТ (дорсальная плоскость), иллюстрирующее анатомическую изменчивость опухолей PDAC (слева направо): нормальная поджелудочная железа, мультифокальные опухоли с кистозными поражениями, заполненными жидкостью, и твердая опухолевая масса. Анатомические органы имеют цветовые кодировки следующим образом: желудок (жёлтый), селезёнка (зелёный), опухоль (фиолетовый), накопление жидкости из-за закупорки протоков (синий). Белая чешуя = 1 см. (B) Гистологические срезы опухолей, окрашенных H&E, вместе с классами клеток на основе компьютерно обученных наложений классификаторов, подчёркивающих гистопатологические особенности опухолей, соответствующих результатам МРТ. Область опухоли (Т) выделена чёрным цветом для всех образцов, когда опухоль присутствует. Классы клеток показаны цветом: нормальная поджелудочная ткань (серый), опухоль (красный) и иммунные клетки (жёлтый). Черная шкала = 0,5 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5: Применение многоживотного МРТ для привлечения животных и мониторинга роста опухолей во время лечения гемцитабином. (A) Хронология экспериментального проекта: Животные (14+ недель) были привлечены после того, как МРТ обнаружила опухоль ≥ 200мм 3. Мыши из обработанной группы получали гемцитабин (100 мг/кг, i.p., b.i.w.) до достижения критериев эвтаназии. В ходе эксперимента проводились многоживотные МРТ-сканирования для всех животных с целью мониторинга кинетики роста опухоли. (B) Репрезентативные изображения МРТ (дорсальная плоскость), показывающие прогрессирование опухоли у одного животного из нелечённой и одного из обработанной группы с 0-го дня до последнего дня эксперимента (конечная точка выживаемости). Белая чешуя = 1 см. (C,D) Графики, иллюстрирующие кинетику роста опухолей (C, n = 4 [2 F, 2 M] против 4 [2 F, 2 M]) и общую выживаемость (D, n = 11 [4 F, 7 M] против 12 [6 F, 6 M]) в контрольной группе без лечения и лечения. Статистическая значимость кривых выживаемости Каплана-Майера определялась с помощью теста Log-rank (Мантел-Кокс) (* p < 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Дополнительный файл 1: STL-файл для 3D-печати нижней вставки с интегрированными анестезиологическими портами, который помещается в стандартный держатель для ПЭТ/МРТ для одной крысы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 2: STL-файл для 3D-печати верхней вставки с интегрированными анестезиологическими портами, который помещается в стандартный держатель для одной крысы для ПЭТ/МРТ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Этот протокол использует стандартную ПЭТ/МРТ-кровать, предоставленную поставщиком, с использованием специально изготовленных 3D-печатных вставок, которые позволяют одновременно сканировать до четырёх мышей (см. рисунок 1). Такая многоживотная конфигурация значительно сокращает не только дорогостоящее время МРТ, но и общую длительность процедуры. Она позволяет проводить параллельную подготовку (анестезия, положение в постель и загрузку в постель), сканирование и восстановление четырёх животных за одну сессию, по сравнению с дополнительным временем, необходимым для индивидуальной подготовки, сканирования и восстановления каждого животного в четырёх отдельных сессиях. Система также включает индивидуальные носовые колбочки для контролируемой анестезии каждому животному, специальный мониторинг жизненного организма для одного животного и интегрированные системы нагрева для поддержания температуры тела у всех сканируемых мышей (см. рисунок 2). 3D-печатные вставки обеспечивают равномерное выравнивание животных и улучшают последовательность сегментации. Респираторный мониторинг в реальном времени позволяет непрерывно оценивать и корректировать анестезию во время сканирования, минимизируя артефакты движения.

Этот протокол использовался для выявления и продольного мониторинга прогрессирования опухоли поджелудочной железы в модели KPC (рисунок 5A-C), обработанной химиотерапевтическим препаратом гемцитабин, служа доказательством концепции доклинического исследования. Гемцитабин, как самостоятельно, так и в комбинации, является препаратом первой или второй линии для пациентов с местным или метастатическим ракомподжелудочной железы 28,29,30. Эти результаты у животных, обработанных гемцитабином, соответствуют предыдущим отчетам, которые также показывали преимущество длявыживаемости 31. Что ещё важнее, этот протокол предоставляет подходящую и надёжную платформу для изучения комбинированных терапий новых терапевтических препаратов и химиотерапии SOC в модели KPC или аналогичных моделях PDAC. Эти комбинированные терапии могут включать ингибиторы малых молекул, иммунотерапию, siRNA, модуляторы активности микроРНК и другие терапевтические олигонуклеотиды против ключевых молекулярныхмишень 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27. Эти комбинированные терапии также могут включать генетически модифицированные мишени для понимания их взаимодействия с химиотерапией SOC или другими методами терапии на ранней стадии развития 9,20,32.

Хотя основное внимание этого протокола уделяется визуализации поджелудочной железы и других органов брюшной полости, этот многоживотный протокол и описанные последовательности МРТ могут применяться для анатомической характеристики других мышиных моделей рака, таких как рак молочной железы и глиобластома, а также для других заболеваний, связанных с почками и/илипеченью 33. Нам известны другие протоколы, описывающие многоживотноеМРТ-сканирование 18,34. Например, Дазай и др. описали нейроанатомическое МРТ-сканирование до семимышей 18. Хотя такая система позволяет снимать мозг семи животных, она не даёт индивидуального контроля анестезии и температуры каждой мыши. Их камера рассчитана на мышей весом менее примерно 32 г; В отличие от этого, наша многокамерная платформа поддерживает более широкий диапазон размеров корпуса мышей. В зависимости от предполагаемого органа, времени сканирования и разрешения, протокол Дазая и др. может дать некоторые преимущества по сравнению с описанным здесь.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтов интересов, которые нужно раскрывать.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана грантом Национального института рака R01 CA258314 и грантом MSU Tetrad Initiative for Interdisciplinary Research 2024 года для LFS. Мы благодарны Центру анализа тканей Программы прецизионного здравоохранения MSU, Институту количественной медицинской науки и инженерии/Программы прецизионного здравоохранения/Продвинутому молекулярному центру визуализации MSU, Animal Resources кампуса MSU, ветеринарной диагностической лаборатории MSU и Центру количественного анализа и картирования биоэлементов (QBEAM) MSU за техническую помощь.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
3D-принтер  StratasysJ750 Для многоживотных вставок для МРТ-ложе
Гемцитабин HClApexBioA1402-500Для ip-инъекций 
ХОРОСХОРОСhttps://horosproject.org/Для анализа МРТ
ИзофлуранКоветрус11695067772Для анестезии у мышей
Испаритель с изофлураномSOMNI ScientificVS6002Для анестезии у мышей
Инсулиновые шприцы с низкой дозой U-100BD14-826-79Для ip-инъекций 
Муфты Luer Lock Tube, нейлоновые прямые заглушки, зазубренные для 1/16" трубного ID x7МакМастер51525K521Для сборки многоживотного МРТ-стола
Замковые трубочные муфты Luer, вилка, для 1/16" Bardbed Tube ID x2МакМастер7466N11Для сборки многоживотного МРТ-стола
Разъём Люр X2 от мужского к мужскомуSAIMMLДля сборки многоживотного МРТ-стола
Совместимая с MR система мониторинга и гейтинга мелких животныхSAIIМодель 1030Монитор животных во время МРТ
Адаптер МРТ-платформыBrukerT150743Компонент МРТ, предоставленный поставщиком
Катушка МРТ, диаметр 72 ммBrukerT20209V3МРТ-катушка, предоставленная производителем
Мультимодальный средний крыс с колыбельюBrukerT151629МРТ-койка, предоставленная поставщиком
офтальмологическая смазка Коветрус75848Для использования во время анестезии
Программное обеспечение ParaVision 360Brukerhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/preclinical-imaging/paravision-360.htmlДля анализа МРТ
PMOD 4.2Brukerhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/preclinical-imaging/pmod.htmlДля анализа МРТ
доклиническую систему МРТ и МРТ;BrukerBioSpec 70/30Для МРТ
Stratasys Vero Clear смолаStratasysRGD810Для изготовления многоживотных МРТ-платформ
Разъёмы для разъёма тройника, Luer Lock Tube x2МакМастер51525K443Для многоживотного МРТ-ложе и bbsp;
Трубка (внутренний диаметр 1/16", внешний диаметр 1/8")BrukerT12330Для сборки многоживотного МРТ-стола

Ссылки

  1. Siegel, R. L., Giaquinto, A. N., Jemal, A. Cancer statistics, 2024. CA Cancer J Clin. 74 (1), 12-49 (2024).
  2. Lafaro, K. J., Melstrom, L. G. The paradoxical web of pancreatic cancer tumor microenvironment. Am J Pathol. 189 (1), 44-57 (2019).
  3. Kleeff, J., et al. Pancreatic cancer. Nat Rev Dis Primers. 2, 16022(2016).
  4. Collisson, E. A., Bailey, P., Chang, D. K., Biankin, A. V. Molecular subtypes of pancreatic cancer. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (4), 207-220 (2019).
  5. Grimm, J., Potthast, A., Wunder, A., Moore, A. Magnetic resonance imaging of the pancreas and pancreatic tumors in a mouse orthotopic model of human cancer. Int J Cancer. 106 (5), 806-811 (2003).
  6. Ireson, C. R., Alavijeh, M. S., Palmer, A. M., Fowler, E. R., Jones, H. J. The role of mouse tumour models in the discovery and development of anticancer drugs. Br J Cancer. 121 (2), 101-108 (2019).
  7. Westphalen, C. B., Olive, K. P. Genetically engineered mouse models of pancreatic cancer. Cancer J. 18 (6), 502-510 (2012).
  8. Cook, N., Olive, K. P., Frese, K., Tuveson, D. A. K-ras-driven pancreatic cancer mouse model for anticancer inhibitor analyses. Methods Enzymol. 439, 73-85 (2008).
  9. Schipper, J., et al. Loss of microRNA-21 leads to profound stromal remodeling and short survival in K-ras-driven mouse models of pancreatic cancer. Int J Cancer. 147 (8), 2265-2278 (2020).
  10. Uprety, D., Adjei, A. A. KRAS: from undruggable to a druggable cancer target. Cancer Treat Rev. 89, 102070(2020).
  11. Buscail, L., Bournet, B., Cordelier, P. Role of oncogenic KRAS in the diagnosis, prognosis and treatment of pancreatic cancer. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 17 (3), 153-168 (2020).
  12. Snyder, C. S., et al. Complementarity of ultrasound and fluorescence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer. BMC Cancer. 9, 106(2009).
  13. Farr, N., et al. Noninvasive characterization of pancreatic tumor mouse models using magnetic resonance imaging. Cancer Med. 6 (5), 1082-1090 (2017).
  14. Yin, T., Liu, Y., Peeters, R., Feng, Y., Ni, Y. Pancreatic imaging: current status of clinical practices and small animal studies. World J Methodol. 7 (3), 101-107 (2017).
  15. Rojas, J. D., et al. Validation of a combined ultrasound and bioluminescence imaging system with magnetic resonance imaging in orthotopic pancreatic murine tumors. Sci Rep. 12 (1), 102(2022).
  16. Vohra, R., et al. Evaluation of pancreatic tumor development in KPC mice using multiparametric MRI. Cancer Imaging. 18 (1), 41(2018).
  17. Serkova, N. J., et al. Preclinical applications of multi-platform imaging in animal models of cancer. Cancer Res. 81 (5), 1189-1200 (2021).
  18. Dazai, J., Spring, S., Cahill, L. S., Henkelman, R. M. Multiple-mouse neuroanatomical magnetic resonance imaging. J Vis Exp. (48), e2497(2011).
  19. Iwano, S., et al. Single-cell bioluminescence imaging of deep tissue in freely moving animals. Science. 359 (6378), 935-939 (2018).
  20. Sempere, L. F., Powell, K., Rana, J., Brock, A. A., Schmittgen, T. D. Role of non-coding RNAs in tumor progression and metastasis in pancreatic cancer. Cancer Metastasis Rev. 40 (1), 1-20 (2021).
  21. Smith, E. S., et al. Clinical applications of short non-coding RNA-based therapies in the era of precision medicine. Cancers (Basel). 14 (6), 1588(2022).
  22. Sempere, L. F., Keto, J., Fabbri, M. Exosomal microRNAs in breast cancer towards diagnostic and therapeutic applications. Cancers (Basel). 9 (7), 71(2017).
  23. Sempere, L. F., Azmi, A. S., Moore, A. MicroRNA-based diagnostic and therapeutic applications in cancer medicine. Wiley Interdiscip Rev RNA. 12, e1662(2021).
  24. Nakisa, A., et al. Tumor-associated carbohydrate antigen 19-9 (CA 19-9), a promising target for antibody-based detection, diagnosis, and immunotherapy of cancer. ChemMedChem. 19 (24), e202400491(2024).
  25. Miller, A. L., Garcia, P. L., Yoon, K. J. Developing effective combination therapy for pancreatic cancer: an overview. Pharmacol Res. 155, 104740(2020).
  26. Dreyer, S. B., Beer, P., Hingorani, S. R., Biankin, A. V. Improving outcomes of patients with pancreatic cancer. Nat Rev Clin Oncol. 22 (6), 439-456 (2025).
  27. Nevala-Plagemann, C., Hidalgo, M., Garrido-Laguna, I. From state-of-the-art treatments to novel therapies for advanced-stage pancreatic cancer. Nat Rev Clin Oncol. 17 (2), 108-123 (2020).
  28. Koltai, T., et al. Resistance to gemcitabine in pancreatic ductal adenocarcinoma: a physiopathologic and pharmacologic review. Cancers (Basel). 14 (10), 2486(2022).
  29. Casper, E. S., et al. Phase II trial of gemcitabine (2,2′-difluorodeoxycytidine) in patients with adenocarcinoma of the pancreas. Invest New Drugs. 12 (1), 29-34 (1994).
  30. Moore, M. Activity of gemcitabine in patients with advanced pancreatic carcinoma: a review. Cancer. 78 (3 Suppl), 633-638 (1996).
  31. Ho, T. T. B., et al. Combination of gemcitabine and anti-PD-1 antibody enhances the anticancer effect of M1 macrophages and the Th1 response in a murine model of pancreatic cancer liver metastasis. J Immunother Cancer. 8 (2), e001367(2020).
  32. Kempinska, K., et al. Genetic ablation of microRNA-10b improves treatment outcomes in mouse models of pancreatic cancer. Cancer Res. 84 (6 Suppl), Abstract 467 (2024).
  33. Fan, J., et al. Species-specific hepatic uptake of [64Cu]Cu-EOB-NOTA, a newly designed hepatospecific PET agent. Mol Imaging Biol. 27 (3), 305-312 (2025).
  34. Ramirez, M. S., Esparza-Coss, E., Bankson, J. A. Multiple-mouse MRI with multiple arrays of receive coils. Magn Reson Med. 63 (3), 803-810 (2010).

Перепечатки и разрешения

Теги

МРТ нескольких животныхмодели рака поджелудочной железыизмерение опухолимодель мышей KPCдоклини setNameвизуализациямониторинг опухолилечение гемцитабиноманатомическая визуализацияоценка объема опухоли
Многоживотная магнитно-резонансная томография для измерения опухолей в моделях мышей с раком поджелудочной железы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.