Автоматические ультраразбавленные измерения самоассоциации для идентификации антител с благоприятными свойствами высококонцентрационного раствора

Краткое содержание

Здесь мы описываем адаптацию высокопроизводительной адаптации анализа коллоидной устойчивости антител в масштабах для генерации больших наборов данных и поддержки прогнозов разработки, готовых к ИИ/ML.

Аннотация

Одной из ключевых задач в инженерии антител является разработка аналитических методов скрининга для оценки коллоидной стабильности, обеспечивая пригодность биологических препаратов для высококонцентрационной формулировки и применения. Зарядово-стабилизированная спектроскопия самовзаимодействия наночастиц (CS-SINS), модифицированная версия традиционной спектроскопии наночастиц с захватом аффинитета и самовзаимодействием (AC-SINS), была адаптирована как надёжная оценка устойчивости коллоидов для прогнозирования поведения высококонцентрационных растворов. Этот метод позволяет принимать критически важные решения на ранних стадиях развития, выявляя проблемы со стабильностью коллоидов до того, как будут вложены значительные ресурсы, что значительно снижает уровень оттока на последующих этапах и ускоряет сроки отбора кандидатов. Это исследование демонстрирует, что анализ бесшовно интегрируется в существующие рабочие процессы обнаружения и может выполняться параллельно с типичными анализами на ранних стадиях благодаря минимальным требованиям к выборке, предоставляя ценные данные для прогнозирования поведения высокой концентрации без ущерба другим характеристикам. Показано, что рутинные измерения динамического рассеяния света (DLS), помимо смещения длины резонансного волны плазмона, могут повысить надёжность описанного здесь метода HTP. В совокупности ожидается, что перекрёстная валидация с использованием измерений DLS и автоматизированных программ анализа позволит надёжно отбирать кандидаты на антитела различных методов.

Введение

При разработке и формулировании терапевтических антител опалесценция и вязкость являются ключевыми факторами при разработке коммерческого продукта, ориентированного на^{пациента} 1,2,3,4,5,6,7,8. Классически, для прямого наблюдения этих свойств при высокой концентрации требуется большое количество белка, что эффективно препятствует оптимальной идентификации свинца на ранних стадиях обнаружения антител, когда доступность белка ограничена. Надёжная идентификация этих явлений крайне важна для оценки проявимости, чтобы смягчить плохое поведение высококонцентрационных растворов на^этапе 1,2,3,4,5,6,7,8. В связи с этим существует значительный интерес к методам с высокой пропускной способностью и низкой концентрацией, которые предсказывают плохое поведение раствора при высокой^{концентрации 9,10,11,12,13,14,15,16}. Один из таких методов, kD-DLS, доказал свою надёжность для прогнозирования свойств высокой концентрации, но не удовлетворяет требованиям низкого потребления белка и высокой пропускной способности, характерных для рабочих процессов^{на ранних стадиях 12,13}.

Недавно было показано, что анализ на основе наночастиц с ультранизким потреблением золота, известный как CS-SINS, имеет сильную корреляцию с результатами экспериментов kD-DLS и достаточно эффективен в прогнозировании плохих свойств раствора при высокой^{концентрации 16}. Эти характеристики делают CS-SINS идеальным кандидатом для разработки в качестве высокопроизводительного инструмента скрининга. Анализ CS-SINS использует захватывающее антитело, иммобилизуемое на поверхностях золотых наночастиц, для закрепления кандидатов в антителах через их Fc-области, оставляя руки Fab доступными для взаимодействия раствора. Эта конфигурация означает, что взаимодействия Fab-Fab доминируют в измеренном сигнале самоассоциации, что является преимуществом, поскольку исследования показывают, что домены Fab в основном вносят вклад в характеристики самоассоциации mAb, вероятно, благодаря свойствам поверхности областей, определяющих комплементарность (CDR⁾ 17,18,19,20,21,22,23 . Эта механистическая основа делает CS-SINS отлично подходящим для прогнозирования рисков устойчивости коллоидов, актуальных для высококонцентрационных формулировок. Альтернативные методы HTP, включая монослойную адсорбционную хроматографию (SMAC), столбцовую хроматографию с исключением размеров (SEC), имитирующую самоассоциацию с общей стационарной фазой, и кросс-взаимодействионную хроматографию (CIC), включают подготовку столбцов и требования к большим^{выборкам} 17,24,25,26,27.

Описанный здесь метод, подробно описывает валидационную схему теста CS-SINS и позволяет проводить HTP-скрининг с помощью лабораторной автоматизации и анализа, объединяя преимущества существующих методов и повышая надёжность результатов. Это исследование также демонстрирует, как различные типы образцов дают высококачественные результаты благодаря характеру обогащения самовзаимодействия в анализе, что подтверждает, что метод не зависит от источников белка. Кроме того, мы рассматриваем, как более ранняя передача коллоидных свойств проектным командам может дополнительно поддерживать стратегическую разработку многоспецифических антител^{28, 29, 30, 31, 32, 33, 34}.

Изучение свойств высококонцентрационных растворов обычно проводится последнее, в ходе многовидовых кампаний по отбору кандидатов, после отбора лида и завершения инженерной работы (см. рисунок 1A). Раннее предсказание этих свойств стало возможным с помощью таких методов, как CS-SINS, требующих нескольких микрограммов образца, что позволяет предсказать риски устойчивости коллоидов с помощью ультраразбавленных^{измерений 16}. Внедрение раннего скрининга способности проявления (рисунок 1A), когда пул кандидатов большой, а также параллельные кампании по генерации данных для моноспецифических и многоспецифических форматов могли бы лучше информировать процесс открытия^{лекарств 31,32}. HTP CS-SINS вписывается в существующую парадигму скрининга молекул параллельно с связыванием и определением функций, тем самым расширяя информационный пакет без нарушения и задержки существующих рабочих процессов. Выбор ведущего кандидата с акцентом на благоприятные коллоидные свойства повлияет на прогрессию отбора, как показано на рисунке 1B.

В предложенном процессе раннего скрининга способности проявления идентификация лидов учитывает полную картину благоприятных свойств лекарств, включая производство и доступ пациентов, что упрощает дальнейшую^{разработку 34}. Свойства биологических препаратов с высокой концентрацией могут определять их способ введения: внутривенные инъекции, требующие посещения больницы, или подкожные инъекции, которые пациент может вводить дома, но часто требуют препарата с высокой^{концентрацией 35,36}. Развиваемые mAb с низкой самоассоциацией часто формулируются при >100 мг/^{мл 5,35}. Оптимизация формулировки с использованием дополнительных компонентов, таких как виско-редуцирующие агенты, может преодолеть риски коллоидной стабильности для желаемых кандидатов с плохими свойствами раствора на стадиях разработки^{CMC 34,35}. Однако это создаёт проблемы в дальнейшем производстве биофармацевтических препаратов и увеличивает сроки успешного одобрения^{лекарств 36}. Эксципиенты, известные снижением вязкости (такие как соли и аминокислоты), также могут влиять на стабильность белка, изменяя ранее очерченные профили развиваемости и усложняя процесс^{ещё больше 36,37}. Кроме того, чрезмерное количество дополнительных веществ может ограничить численность пациентов из-за соображений иммуногенности, различных соображений по безопасности, или повлиять на соблюдение лечения, что может привести к новым вызовам в производственной^{сфере 38, 39, 40}. Старр и соавт. впервые опубликовали метод CS-SINS, описав оптимальную массовую долю PLL и IgG равную 0,03 и подтвердив стабилизацию наночастиц с помощью измерений зета-потенциала для самоассоциации mAb в гистидиновых^{формулах 16}. Примечательно, что добавление слишком большого количества PLL приводит к гиперстабилизации анализа и препятствует наблюдению самовзаимодействия mAb (улучшение стабильности золотых наночастиц с помощью PLL показано на дополнительном рисунке 1). Использование составов гистидина без соли минимизирует электростатический скрининг (увеличивая длину Дебая), что расширяет диапазон межмолекулярных взаимодействий, тем самым усиливая слабые сигналы самоассоциации и имитируя поведение высокой концентрации там, где антитела находятся ближе друг к другу. В целом, для формул с высокой концентрацией, где не наблюдается самосвязь с низкой ионной силой, предпочтительнее.

Крупные полимеры PLL предотвращают заполнение большего количества захватных mAb на поверхностях золотых наночастиц, что сужает плазмонное окно смещения и требует более сложной программы подгонки кривых и анализа для последующего анализа данных. В этом исследовании использовался веб-портал, который синхронизируется с внутренними базами данных. Главное преимущество этой первоначальной стоимости — это потенциал для накопления данных из большого пула последовательностей, чтобы максимизировать разнообразие кандидатов на следующих этапах и устранить узкие места на более дорогих этапах^{разработки 34, 35, 36}. Анализ CS-SINS, который мы описываем здесь, выделяется как совместимый с HTP метод, который хорошо коррелирует с поздними коллоидными анализами^{стабильности 16}. Профилирование с помощью ИИ находится в процессе продуманного проектирования мультиспецифик для будущих программ и для понимания индивидуальных вкладов каждой области в сложных форматах^{41, 42, 43, 44}. Эти усилия в совокупности повлияют на метаанализы и более детальное определение коллоидных свойств устойчивости антител, что в конечном итоге сэкономит время на ранних этапах исследований и разработок.

Протокол

Рисунок 2 показывает подготовку конъюгации наночастиц, рисунок 3 — полный рабочий процесс, рисунок 4 — процесс автоматизации лаборатории, а рисунок 5 содержит диаграмму конвейера анализа данных. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка буферов

ПРИМЕЧАНИЕ: Неделя 1 (подготовка образцов)

1. Приготовьте гистидин (10 мМ), pH 6,0 (буфер для проб и анализа).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги выполняются в первый день.
   1. Растворять 5 мМ L-гистидина моногидрохлорида моногидрата и 5 мМ L-гистидина в сверхчистой воде. Добавляйте соляную кислоту по каплям, перемешивая до pH до 6,0, измеряя с помощью калиброванного pH-метра.
   2. Фильтруйте раствор через поровый фильтр размером 0,22 мкм под вакуумом и собирайте фильтрат в стерильную бутылку.
   3. Измерьте проводимость для контроля качества и обеспечьте показания примерно 500 мкс/см.
2. Подготовьте ацетат калия (20 мМ), pH 4,3 (буфер конъюгации mAb).
   1. Растворите ацетат калия в сверхчистой воде и отрегулируйте pH до 4,3 с помощью ледниковой уксусной кислоты.
   2. Стерилизуйте раствор вакуумной фильтрацией через поровый фильтр размером 0,22 мкм, как описано в шаге 1.1.2.
3. Приготовьте поли-L-лизин.
   1. Приготовьте бумажный раствор 5 мг/мл в ультрачистой воде и храните при −20 °C до использования.

2. Диализ всех образцов (кандидат на mABS)

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте эти шаги на 2–5 днях.

1. Предварительное замачивание диализаторов 100 мкл или 300 мкл в гистидине 10 мм, pH 6,0, в течение 5 минут.
2. Перенесите все образцы (50–100 мкл) в диализные кассеты. Погрузите кассеты в буфер с гистидином 10 мм, pH 6,0 (700 мл на коробку), добавьте перемешивательные стержни в резервуары, поместите резервуары на магнитные перемешивающие пластины и инкубуйте при 4 °C в течение 2 часов 15 минут.
3. Проведите семь буферных обменов с гистидином 10 мМ, pH 6,0, каждые 2 часа 15 минут, или четыре смены буфера за ночь, чтобы обеспечить тщательное удаление соли из образцов.
4. Возьмите образцы, перенесите их в чистые матричные флаконы и храните при 4 °C до проведения анализа CS-SINS.
5. Измеряйте концентрацию образцов и записывайте информацию о полидисперсности после диализа. Вычислите скорректированные концентрации, деля исходные значения поглощения при 280 нм на поглощение при 280 нм для раствора 1 мг/мл.
6. Подготовьте входной файл жидко-обработчика с адресами и концентрациями скважин (мкг/мл), включая элементы управления.

3. Обмен буфером захвата mAb (Рисунок 2, шаг 1)

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните эти шаги в первый день 2-й недели (анализ).

1. Удалите буфер хранения из колонок для обезсоли объёмом 2 мл, центрифугая на 2 минуты при 1000 × г при комнатной температуре. Подготовьте две колонны для осушивания соли на каждые 700 мкл уловления мАб. После каждого этапа центрифугирования отбрасывайте проток через проточку.
2. Промыйте колонны три раза с помощью 1 мл буфера ацетата калия 20 мм, pH 4,3. Центрифугайте колонны в течение 2 минут при 1000 × г во время каждой мойки.
3. Добавьте 700 мкл захвата mAb (антитела, специфического к Fcγ-специфическому козлу) в каждую колонку и элюируйте в свежую трубку объемом 15 мл, центрифугировав в течение 2 минут при 1 000 × г.
4. Соберите обезсоленный элюат, нанесите его во вторую уравновешенную колонку для обезсоли и центрифугуйте ещё 2 минуты при 1 000 × г.
5. Объедините все элюированные сэмплы.
6. Измерьте концентрацию раствора mAb после обезсолённой обработки, как описано на днях 2–5, шаг 2.5.
7. Разведите раствор набора mAb до 0,8 мг/мл с буфером ацетата калия 20 мм, pH 4,3, и отложите до использования.

4. Подготовка рабочего материала поли-L-лизина

1. Разведите небольшой аликвот раствора поли-L-лизина до 2,66 мг/мл сверхчистой водой.

5. Концентрация золотых наночастиц (Рисунок 2, шаг 2)

1. Подготовьте 1,2 мл аликвотов стандартной суспензии в трубках по 1 мл или аликвоты объемом 4,8 мл в трубках по 5 мл с использованием полипропиленовых микроцентрифугных трубок с наночастицами золота 20 нм. Центрифуга при 21 130 × г в течение 6 минут.
2. Удалите супернатанты (~1,1–1,15 мл), не нарушая гранулы, и переместите их в отдельную коническую трубку.
3. Объедините концентрированные гранулы и остаточные объёмы в чистую микроцентрифугную трубку. Определите объём наночастиц с помощью пипетирования и отрегулируйте объём до (количество трубок × 50 мкл) или (количество трубок на 5 мл × 200 мкл) с помощью зарезервированного супернатанта. Например, после центрифугирования 10 аликвот по 1,2 мл в трубках по 1 мл отрегулировать конечный объём концентрированных наночастиц до 500 мкл.

6. Сборка наночастиц

1. Тщательно смешайте 1,5 мкл рабочего раствора поли-L-лизина с 48,5 мкл буферно-обменянного захвата mAb (рисунок 2, шаг 3).
2. Приготовьте смесь концентрированного раствора наночастиц с шага 5 и раствора поли-L-лизина/захвата mAb из шага 6.1 (рисунок 2, шаг 4).
3. Инкубировать смесь на ночь при комнатной температуре (23 °C) (рисунок 2, шаг 5).

7. Установка пробной пластины с жидкостной обработкой

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните эти шаги на второй день.

1. Собрать материалы, необходимые для анализа, включая диализованные антитела, файл ввода жидкостного обработчика с концентрациями после диализа, сопряжённые золотые наночастицы, роботизированные наконечники, пластины и резервуары (рисунок 3, лабораторная автоматизация, шаг 1). Предварительно загрузите насадки, образцы, пластины и резервуары на палубу согласно схеме, показанной на рисунке 3 (Лабораторная автоматизация, шаг 1).
2. Добавьте элементы управления в скважинах A12–D12 пробной пластины (два положительных и два отрицательных контрольных). Оставьте скважину H12 пустой для буферного образца, подготовленного жидкостником.
3. Откройте метод CS-SINS с жидкостной обработкой и запустите программу (рисунок 3, Лабораторная автоматизация, шаги 2–3). Загрузите файл ввода жидкости по запросу и введите количество образцов (рисунок 4A). Просмотрите два последующих окна проверки вычислений (рисунок 4B,C), подтвердите значения и приступите к запуску.
4. Нормализуйте образцы, включая контрольные, до 55,5 мкг/мл в буфере гистидина 10 мм, pH 6,0, перенося их из матричных пробирок на пластину полимеразной цепной реакции в конечном объёме 100 мкл (рисунок 4D, шаг 1). Следите за прогрессом, отмечая, что завершённые области пластин выглядят серыми, а активные шаги выделены зелёным (рисунок 4E).
5. Подготовьте разбавление каждого образца в более крупном объёме при 11,1 мкг/мл в буфере гистидина 10 мм, pH 6,0, перенеся материал из пластины полимеразной цепной реакции в глубокий блок с конечным объёмом 200 мкл (рисунок 4D, шаг 2).
6. Позвольте системе остановиться после второго шага. По запросу смешайте концентрированные золотые наночастицы, подготовленные на шаге 6.3, инвертируя трубку и пипетируя примерно 10 раз.
   1. Равномерно распределите наночастицы между двумя полипропиленовыми микроцентрифугными трубками и разместите трубки с открытыми крышками в назначенном месте для стойки трубок на палубе (рисунок 4D, выделено как «AuNP»). Возобновите запуск и позвольте жидкообработчику ввести по 20 мкл наночастиц в каждую скважину второго блока глубоких скважин, по две скважины одновременно (рисунок 4D, шаг 3).
7. Позвольте обработчику жидкости перенести 192 мкл образца из блока глубокой скважины с образцами 11,1 мкг/мл (рисунок 4D, шаг 2) во второй блок глубокой скважины и тщательно перемешайте. Сгенерировать мастер-микс CS-SINS с 4× для каждого образца, в результате чего конечная концентрация образца составит 10 мкг/мл после добавления 48 мкл золотых наночастиц к итоговому объёму 240 мкл (рисунок 4D, шаг 3). Запустите 4-часовой инкубационный таймер на этом этапе.
8. Позвольте жидкосрабатывающему специалисту впустить 30 мкл в исходную скважину, а затем 60 мкл в три из четырёх колодцев в каждом квадранте пластины с 384 лунками для получения технических тройных экземпляров для каждого образца (рисунок 4D, шаг 4). Вернуть оставшиеся 30 мкл на исходную пластину.
9. Следите за планировкой палубы с жидкостной обработкой по мере прохождения забега. Наблюдайте, как используемые наконечники и заполненные образцовые ямы в реальном времени меняются от светлого к тёмно-серому, а активные движения отмечены зелёным (рисунок 4E).
10. Снимите пластину после завершения забега. Запечатайте пластину минимально клеящейся прозрачной пластиной и инкубуйте при комнатной температуре в общей сложности 4 часа. В точке времени 3,5 часа запустите программу динамического рассеяния света, чтобы уравновесить камеру до 20 °C с помощью настроек, указанных на дополнительном рисунке 2.
11. Измерьте спектр поглощения каждой скважины от 510 до 570 нм с шагом по 1 нм (30 нм с каждой стороны пика) в точке 4 часа.
12. Немедленно измерьте пластину с помощью считывателя динамического рассеяния света в точке времени 4,5 часа с настройками, указанными на дополнительном рисунке 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте высокопроизводительный считыватель пластин для спектральных измерений из-за ограниченного динамического диапазона. Не используйте функцию быстрого чтения.

8. Анализ данных (рисунок 5, схема обработки данных)

1. Экспортируйте сырые файлы с платформы спектрофотометра и сохраняйте их в папку с доступным диском.
2. Получите доступ к веб-порталу скриптов, связанному с внутренним сервером. Введите необходимые входные параметры CS-SINS, включая: (1) Начальную длину волны; (2) Расположение каталога исходного файла результатов; (3) Идентификаторы номерных знаков и кандидатов; (4) Положительные и отрицательные контрольные ямы для нормализации; (5) Обозначение установки метода («Manual» или «Liquid handler»); (6) Приборы, используемые для спектрального сканирования и измерений динамического рассеяния света; (7) Идентификатор электронной лабораторной тетради (ELN); (8) Дата приобретения.
3. Отправьте параметры на веб-портал и убедитесь, что три файла Excel сгенерированы в подпапке каталога raw-results.
4. Вычислите значения λmax с помощью скрипта для подгонки кривой, выполняемого веб-порталом.
5. Ознакомьтесь с двумя выходными файлами с репликационными значениями, нормализованными результатами и репрезентативными графами для спектрального сканирования и измерений динамического рассеяния света.
6. Используйте третий выходной файл, содержащий метаданные анализа и нормализованные результаты, чтобы создать массовые лабораторные результаты в пользовательском интерфейсе базы данных. Определите атрибуты отчетности в соответствии с требованиями группы, специфичные для группы, и загрузите результаты в базу данных для обеспечения доступа на уровне всей компании.

Результаты

На рисунке 6 показаны результаты, дополнительный рисунок 3A показывает пример балла CS-SINS из репрезентативного сырого и очищенного образца, дополнительный рисунок 3B показывает вариабельность сигнала от скважины к скважине в течение разных дней, дополнительный рисунок 4 содержит результаты процесса валидации пластин, а дополнительный рисунок 5 описывает расчёт нормализации для обоих показаний CS-SINS.

Важно отметить, что образцы были собраны с сообщаемыми концентрациями не менее 55 мкг/мл после диализа в 10 мМ гистидина с pH 6,0 для оценки допустимости анализа, поскольку это минимальная концентрация запаса (минимум 6 мкг на образец), и были созданы новые дочерние идентификаторы. Всего было 70 очищенных образцов и 20 образцов с сырой экспрессией, каждый из которых представлял типы образцов на различных контрольных точках проявления (очищенный на этапе оптимизации свинца и 1- или 2-ступенчатый очищенный сырой материал с этапа идентификации свинца, отмеченный на рисунке 1A). Сырый материал был получен из полностью автоматизированной системы экспрессии млекопитающих — Protein Expression and Purification Platform (PEPP; GNF, Сан-Диего, Калифорния, США). Элементы управления были получены из коммерческих материалов и ранее проверялись как обладающие максимальной или минимальной вязкостью, значениями kD-DLS и CS-SINS. Свежие аликвоты хранятся при -80°C, и для каждого анализа используется новый аликвот.

Рисунок 6A,B показывает средние спектральные и DLS-показатели, отображённые по типу выборки, а столбчатые графики показывают полоски ошибок (стандартное отклонение) с соответствующими цветовыми кодами. Нормализация вычисляется скриптом путём деления разницы между образцом и отрицательными контрольными значениями (рассчитано лямбда-максом на спектральный сдвиг или Z-среднее, гидродинамический диаметр в нм) на разницу между контролями (дополнительный рисунок 5). Рисунок 6C показывает спектральные показатели с баллами DLS, показывая явную корреляцию между аналитическими подходами. В таблице 1 перечислены идентификаторы, адреса скважин, тип выборки, спектральные показатели и показатели DLS вместе с их стандартными отклонениями для справки. Порог для коллоидного риска стабильности (независимо от спектрального или DLS-показания) для моноспецифического IgG превышает нормированное значение 0,35 (отмечено зелёной пунктирной линией на рисунках 6A,B, 6/70 (без учета репликатных контрольных) очищенные образцы показали высокий риск, а 64/70 — низкий для очищенного материала. Важно, что мы ожидаем, что для многоспецифических форматов этот пороговой балл будет тенденцией к росту. Для выборок грубой экспрессии 2 из 20 получили высокие баллы, а 18 из 20 — низкие. Из очищенных материалов, протестированных здесь, также была скринингована грубая экспрессия родительских партий определённого подмножества, которая дала схожие результаты (показаны на дополнительном рисунке 3A), что свидетельствует о репрезентативном характере анализа при масштабировании (очистке) кандидатных белков из независимых партий. Несмотря на ограничение размеров выборок, отмечается, что стандартная ошибка может быть выше для пробоевых образцов PEPP, чем для очищенных. Преимущество проведения CS-SINS на поздних стадиях гарантирует, что ортогональные оценки можно проводить с использованием анализов, требующих большего количества белка для анализа, таких как измерения вязкости и kD-DLS, а преимущество проведения CS-SINS в ранних скринингах проявленности заранее устраняет риски стабильности коллоидов, потенциально влияя на итоговый пул кандидатов (рисунок 1B). Кандидаты с пограничным расстройством с высокой ошибкой могут быть подтверждены как высокого или низкого риска при проведении анализов на последующих этапах.

Из-за небольшого характера обнаруженных плазмонных сдвигов был описан альтернативный индикатор для внушения уверенности в анализе, что расширяет динамический диапазон, что может оказаться особенно полезным при отсутствии высококлассного считывателя пластин для обнаружения мельчайших изменений. Показание DLS различает кластеризацию наночастиц и зависимость от спектральных свойств наночастиц; однако оба дескриптора имеют схожие стандартные диапазоны ошибок и малы относительно своих измерений. Похоже, что выборки, более склонные к выбросам, будут иметь более высокую ошибку (или быть «мультимодальными» и не сообщать результат по DLS), но значения CS-SINS в рабочем диапазоне анализа имеют низкие распределения ошибок. При сравнении значений DLS и спектральных оценок распределение ошибок для результатов DLS, взятых из грубых выборок, более строго, чем для спектральных оценок; однако это имело значение только для одного кандидата, который не достиг порога по DLS, но не по спектральному баллу. Это может оказаться полезным, если в лабораториях есть другие инструменты.

Для обеспечения надёжности обработки данных и самого метода времени сканирования были изменены от конца до конца для показаний положительных и отрицательных элементов управления в вышеуказанном наборе данных, а также для множества средних и низких контроллеров, которые служили промежуточными точками отсчёта в начале и конце пластины с 384 ямеками. Дополнительный рисунок 4 показывает результаты окончательной валидации пластины, показывая в основном незначительно отличающиеся значения от образцов, помещённых в начале и конца пластины (дополнительный рисунок 4A,B), а также высокую корреляцию между обоими значениями показаний (дополнительный рисунок 4C). Наконец, Z-фактор и %CV были рассчитаны для контрольных элементов спектрального сканирования и набора данных DLS на рисунке 6. На основе данных, полученных для контрольных групп, было определено как Z-фактор 0,648, при этом 0,019% CV — положительный контрольный и 0,012% — отрицательный контрольный. Для показания DLS был рассчитан Z-фактор 0,998, с 0,025% CV для положительного контроля и 0,021% для отрицательного контроля. В целом, коэффициент корреляции Спирмана между значениями выборки в этом анализе (рисунок 6C) был рассчитан как сильно положительный на уровне 0,829. Эти значения обеспечивают высокую точность и воспроизводимость для обоих типов измерений, и, неудивительно, что новая, выгодная стратегия обнаружения DLS оптимизирует Z-фактор, но спектральное сканирование обеспечивает достаточную зону разделения для получения достоверных результатов (Z > 0,5). Важно отметить, что оценка DLS — это ортогональный показатель, собираемый одновременно в рабочем процессе CS-SINS и не требующий дополнительной подготовки образца. Большая разница в значениях для исходных оценок DLS объясняет улучшенный Z-фактор, но «баллы» интерпретируются одинаково, поскольку нормализуются из исходных значений. Кроме того, показания DLS фиксируют трёхмерные размеры кластеров наночастиц по сравнению с косвенными показаниями близости от плазмонных сдвигов и спектральной информации, что может укрепить наше понимание динамики анализов CS-SINS. Учитывая пластинчатый и критический по времени характер HTP-анализа, мы стремились повысить его надёжность с помощью этих методов.

Рисунок 1: Парадигма разработки и сбор данных CS-SINS. (A) Типичный рабочий процесс от кампании по открытию до отбора кандидатов показан на этой диаграмме для мультиспецифических антител. Процесс обнаружения приводит к отбору моноспецифических кандидатов, после чего следует отбор из различных пакетов данных для сузения интересующих моноспецифических характеристик перед объединением в мультиспецифические форматы. Пакеты данных повторяются или расширяются, чтобы сузить круг ведущих кандидатов до тех пор, пока не будет выбран лучший кандидат для развития. Анализы с низкой пропускной способностью проводятся в текущем рабочем потоке, когда выбирается небольшая панель молекул (фиолетовые коробки). HTP CS-SINS можно выполнять на каждом этапе пути, добавляя ценные данные и улучшая процесс отбора. (B) Гипотетический результат коллоидных свойств для шести лучших кандидатов показан по двум возможным путям: отбор ведущего кандидата с низкопроизводительными анализами и отбор ведущего кандидата с HTP CS-SINS. Кандидаты с неблагоприятным поведением по решению представлены светом. В первом сценарии половина ведущих кандидатов, основанных на оптимальных характеристиках связывания с экранов обнаружения, демонстрирует плохое поведение при высокой концентрации. Во втором сценарии включается только один кандидат с умеренно низкой коллоидной стабильностью, поскольку данные CS-SINS рассматривались параллельно с данными связывания на ранних скринингах обнаружения. Во втором сценарии разнообразие потенциально жизнеспособных кандидатов выше, чем в первом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Рабочий процесс анализа SINS. Подготовка и конъюгация золотых наночастиц: (1) Захват mAb буферно обменивается на ацетат калия 20 мМ, pH 4,3, и разбавляется до 0,8 мг/мл. (2) Золотые наночастицы концентрируются из запаса. (3) Поли-l-лизин смешивается с буферно-обменянным захватом mAb. (4) Золотые наночастицы инкубируются с поли-л-лизином и захватывают mAb и тщательно смешиваются. (5) Инкубация комплекса CS-SINS ночью при комнатной температуре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Рабочий процесс автоматизации лаборатории. Рабочий процесс автоматизации лаборатории: (1) Материалы и образцы собираются для метода обработки жидкости. Диализованные образцы с гистидином 10 мМ, pH 6, собираются в матричные трубки или пластины с 96 ямецами. Концентрации образцов формируются в файл ввода жидкостного обработчика. Сложные золотые наночастицы CS-SINS, конъюгированные для улавливания mAb, роботизированные насадки для обработки жидкостями и пластиковые изделия, собираются в подготовке к установке анализа с жидкостным обработчиком. (2) Пробная пластина готовится на жидкостном обработчике и инкубируется 4 часа при комнатной температуре. 3) На отметке 4 часа собираются спектральные сканирования (индикатор 1) из пробо-скважин продолжительностью 25 минут; После отметки 4,5 часа динамическое рассеяние света (показание 2) собирает данные о размере каждой более однородной популяции скважин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Программа жидкостного обработчика и настройка пластины. (A) При запуске программы и после инициализации системы открывается отдельное окно/запрос для выбора входного файла с указанными адресами скважин и концентрацией образцов. Количество образцов должно указываться каждый раз, но объём 200 мкл (последний объём смешанных реагентов до штампования пластин на 384 лунки) остаётся прежним. (B) После нажатия «продолжить » из предыдущего окна в (A) появится это второе окно, подтверждающее интерпретации из входного файла слева и значения справа. (C) После подтверждения интерпретаций из (B) появляется это третье окно с диалоговым окном, перепроверяющим математику концентрации образца для нормализации (объём 100 мкл) на финальной глубокой пластине ямы (объём 200 мкл). (D) Эта верстка взята из Method Editor программного модуля жидкостного обработчика. Слева загружаются стандартные насадки объемом 300 мкл, а в центре сцены — 1 коробка по 50 мкл и 3 коробки по 300 мкл тонких насадок, совместимых с робототехникой для обработки жидкостями. Спереди загружен буферный желоб с 10 мМ гистидина pH 6 (буфер, в который диализировались образцы). Золотые наночастицы равномерно делятся на 2 микроцентрифугные трубки и загружаются без крышки в заднюю часть трубной стойки справа. Матричная пластина с пробирками загружается в задней части несущей в колонке 10. После образцов указываются нормализационная пластина (1), плита глубокой скважины с образцом 11,1 мкг/мл (2), глубокая пластина 200 мкл для объединённого образца и наночастиц (3) и пластина с форматированием 384 лунок (4). (E) Схема палубы с обработкой жидкостей показывает получение насадов и разлив образцов в реальном времени и отмечает скважины по мере каждого шага. Здесь все образцы (изображение на 96 лунок в задней части носителя в^{третьем} столбце) серые, как и последующий нормализационный материал, который указывает на добавление образцов на нормализационную пластину из матричных пластин источника. Зелёным цветом мы показываем 8-канальную головку после аспирации буфера из желоба и подачи её в первую колонку нормализационной пластины во время смешивания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: Схема обработки данных. Схема обработки данных: (1) Сырые файлы подаются на внутренний сервер. (2) Файлы данных считываются и обрабатываются скриптом, настроенным для точной настройки кривой спектральных сканировок, расчёта лямбда-максимума для репликаций CS-SINS и проверки мультимодальных популяций с помощью DLS. (3) Данные группируются по репликам, затем усредняются и нормализуются по заданным контролям; Сопоставление карт пластин в портале базы данных предоставляется для связки результатов. (4) Все данные организованы в шаблон, готовый к загрузке в базу данных, а графики автоматически создаются для отчетности по ELN. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6: Репрезентативные данные из показаний 1 и 2. (A) Нормированные оценки спектрального сдвига были нанесены с помощью PPB ID для очищенных, грубых образцов экспрессии и контрольных образцов, если они были отмечены и разделены вертикальной пунктирной линией, в виде столбчатого графика для определения распределения полос ошибок между типами выборок. Сплошная красная линия указывает верхний предел анализа, который соответствует положительному контролю, а зелёная пунктирная линия — сроговое значение для профиля молекул низкого риска для CS-SINS. (B) Нормализованные показатели DLS были нанесены с помощью PPB ID для очищенных, грубых экспрессионных образцов и контрольных образцов, если они были отмечены и разделены пунктирной линией, в столбчатом графике для определения распределения полос ошибок между типами выборок. Некоторые значения отсутствуют (например,^второе значение светло-голубого цвета с баллом выше среднего в (A) из-за мультимодальных сканов с выхода DLS, которые веб-портал скриптов признал недействительными. Сплошная красная линия указывает верхний предел анализа, который соответствует положительному контролю, а зелёная пунктирная линия — сроговое значение для профиля молекул низкого риска для CS-SINS. (C) Усредненные нормированные оценки для спектрального сдвига и значения DLS сравнивались с помощью корреляционного точечного графика, как показано (оценки спектрального смещения соответствуют оси Y, а оценки DLS — оси X). Цветовой код координируется только с баллами DLS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1. Показатели коллоидной стабильности образцов антител, определяемых с помощью CS-SINS. Таблица суммирует идентификаторы выборок, адреса скважин, классификацию образцов, нормализованные спектральные оценки и показатели динамического рассеяния света (DLS), полученные с помощью анализа CS-SINS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительный рисунок 1: PLL улучшил стабильность AuNP при 10 мМ. Его буфер, pH 6, для CS-SINS. Этот рисунок показывает плотное наложение отрицательного контроля mAb, связанного с комплексом CS-SINS с покрытием PLL и буферным контролем, в отличие от непокрытых золотых наночастиц с отрицательным контролем mAb или буфером, которые имеют пики в совершенно разных диапазонах. Синим цветом показаны инкрементальные спектральные сканирования (проводимые шагами по 1 нм в 4-часовой точке времени) для конъюгированного AuNP, инкубированного с 10 мМ. Его буфер наложен на сопряжённые шарики, инкубированные отрицательным контролем (PPB-117487) при отсутствии прединкубации поли-L-лизина. Красным выделены инкрементальные спектральные сканирования (сделанные шагами по 1 нм в 4-часовой точке времени) для конъюгированного AuNP, инкубированного с 10 мМ. Его буфер наложен на сопряжённые шарики, инкубированные отрицательным контролем (PPB-117487) после преинкубации поли-L-лизина. Рассчитанные лямбда-максимумы для обоих отрицательных контролей в присутствии PLL находятся близко друг к другу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Настройки для DLS и выбор пластин скважины для считывателя пластин DLS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Результаты CS-SINS по ABS, выраженные в PEPP, по сравнению с очищенными в последующих процессах. (A) Нормированные оценки спектрального смещения были нанесены по идентификатору скважины и пластины для образцов PEPP (например, A1PL1 = колодца A1 от пластины 1), экспрессирующих Ab64, и отделённые вертикальной пунктирной линией от нормализованного спектрального смещения или оценок DLS от очищенного Ab64 далее, на столбчатом графике для определения распределения баров ошибок (стандартного отклонения) между типами выборок. Зелёная пунктирная линия обозначает сроговое значение для профиля молекул низкого риска для CS-SINS. (B) Общий AUC и распределение по пластине для всех образцов в экспериментах, проведённых в (A), отображаются здесь (цветно кодированы для соответствующих экспериментов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 4: Сквозная валидация пластин с 384 лунками контроля. (A) Усреднённые, нормализованные спектральные оценки для образцов в начальных столбцах пластины с 384 лунками отображаются красным цветом, а дублирующиеся значения, отсканированные в конце пластины с 384 лунками, показываются лаймовым зелёным. Значения репликации расположены рядом, варьируясь от положительного контроля (обозначенного плюсом рядом с PPB ID) до отрицательного контроля (обозначенного минусом рядом с PPB ID). Значение для управления буфером, подготовленного программой обработчика жидкостей (независимо от входного запроса образца), отображается в шахматном порядке. (B) Усредненные нормированные показатели DLS для образцов в начальных столбцах пластины с 384 лунками отображаются красным цветом, а дублирующиеся значения, отсканированные в конце пластины с 384 лунками, отображаются лаймовым зелёным. Значения репликации расположены рядом, варьируясь от положительного контроля (обозначенного плюсом рядом с PPB ID) до отрицательного контроля (обозначенного минусом рядом с PPB ID). Для считывания DLS нет значения управления буфером (из-за мультимодальных показаний). (C) Усредненные нормализованные спектральные показатели отображаются с DLS-показателями в корреляционном точечном графике для образцов, варьирующихся от показаний в начальных столбцах пластины с 384 лунками до конца пластины с 384 лунками. Цветовая кодировка точек данных напрямую соответствует средним нормализованным оценкам спектрального сканирования. Поскольку для считывания DLS нет значения управления буфером (из-за мультимодальных показаний), сравниваются только 6 повторяющихся элементов управления из обоих показаний на этом графике. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 5: Расчёты для нормализации спектральных оценок или DLS для обеспечения универсальной отчетности и ссылок между пользователями и днями. Положительные контрольные значения устанавливаются на 1, отрицательные — в 0, а высокие оценки связаны с плохим коллоидным поведением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Этот протокол представляет собой несколько ключевых модификаций исходного метода^{CS-SINS 16}. Важно, что оптимизированное соотношение PLL:IgG и буфер гистидина были сохранены в оригинальном^{исследовании 16}. Особенно примечательно, что анализ был адаптирован для роботизированной платформы жидкостного обработчика, позволяя обработку HTP (до 352 образцов за 1 день против ~20), что сократило время работы на практике и улучшило воспроизводимость за счёт автоматизированной обработки жидкости. Система робототехники совместима с форматами на основе пластин, включая штампование в новые форматы, такие как пластина с 384 лунками, и различные типы лабораторной посуды. Программы могут работать независимо, а сквозной рабочий процесс обеспечивает высокообъёмное считывание с улучшенной воспроизводимостью в условиях ограничения выборок. Измерения DLS также были включены в качестве ортогонального показания спектрального смещения с более оптимальным Z-фактором, чем интерпретации спектрального сдвиса (0,998 против 0,648), что особенно ценно для образцов с пограничными спектральными баллами или высокими стандартными отклонениями и описывает интерпретацию плазмонного смещения для усиления динамического диапазона, видимого только из выхода считывателя пластин. Предполагается, что лаборатории без высококлассных многомодовых считывателей пластин могли бы использовать DLS для надежного выполнения CS-SINS. Для устранения потенциальной временно-зависимой вариабельности на пластине с 384 лунками была проведена обширная валидация пластин (дополнительный рисунок 4) путём размещения контрольных элементов как в начале, так и в конце пластины, что подтверждает минимальные эффекты времени сканирования. Кроме того, было показано, что сырые образцы PEPP дают сопоставимые результаты с очищенным материалом (рисунок 6, дополнительный рисунок 3A), расширяя применимость метода на более ранних этапах обнаружения, где очищенный белок недоступен, что ранее не было сообщено. Данные на дополнительном рисунке 3 указывают на надёжность выборок между источниками, но также указывают на минимальную изменчивость анализов из дня в день с момента сбора и нормализации данных из разных наборов данных. Более конкретно, дополнительная рисунок 3B показывает общую площадь под кривой для всех колодцев из соответствующих экспериментальных пластин (цветово кодированных для соответствия пластине из того же эксперимента на дополнительном рисунке 3A), чтобы продемонстрировать ожидаемую, но минимальную вариабельность внутри одного эксперимента и в разные дни с разными приготовлениями бусин. На ранней стадии обнаружения такие методы, как kD-DLS и столбцовские подходы (SMAC, CIC), невозможны из-за более высоких требований к потреблению образцов и невозможности обрабатывать необработанный^{материал} 12,13,24,25,26,27; CS-SINS уникально позволяет проводить коллоидный скрининг стабильности на этом этапе с содержанием всего 6 мкг на образец, который можно очистить в один шаг. Наконец, скрипт подгонки кривой был обновлён для настройки мелких лямбда-макс-сдвигов и улучшения обработки файлов и автоматизированной подачи данных во внутренние базы данных.

Распространённые сценарии устранения неполадок включают: (1) высокостандартные отклонения в спектральных или DLS-оценках, часто указывающие на неполное смешивание наночастиц (шаг 7.6) или агрегацию образцов — в таких случаях рекомендуется провести проверку качества по диализованным образцам с помощью DLS для обеспечения целостности после диализа и по умолчанию использовать спектральные оценки в качестве стандартного показания; (2) мультимодальные распределения DLS или неудачные показания DLS, обычно вызванные предшествующим скоплением образцов или загрязнением пылью — фильтрация через фильтры 0,22 мкм перед диализам может смягчить это; (3) расхождения между спектральными и DLS-показателями, которые обычно обусловлены искажёнными измерениями DLS (вероятно, из-за высокой полидисперсности, которая проявляется в диапазоне нормально-высокого по спектральной оценке); (4) несогласованные положительные контрольные значения, обычно возникающие из-за неправильного хранения наночастиц или ухудшения захвата mAb; свежие аликвоты, хранящиеся при -80 °C, следует использовать для каждого анализа (не хранить при 4 °C более нескольких дней).

Некоторые ограничения анализа включают необходимость времени на тщательную диализацию образцов и полуручную подготовку конъюгированных наночастиц за день до анализа; однако время диализа эквивалентно независимо от размера выборки. Что касается риска засорения наконечников, насадники для обработки жидкости отслеживают изменения давления во время аспирации, и при работе появляются соответствующие ошибки. На этапе разработки метода мы проверяли лог-файлы (и продолжали после обслуживания), чтобы убедиться, что ожидаемые тома вычисляются скриптом. Функции алицитирования были протестированы для получения концентрированных бусинок и не предполагают проблем. Мы признаём временную чувствительность теста, доминирующий Fab характер оценки и его роль как суррогатного теста без прямого измерения коллоидных проявлений, таких как вязкость и опалесценция. Однако такая адаптация позволяет эффективно характеризуть более крупные наборы данных на ранних этапах процесса поиска лекарств, служя мощным инструментом скрининга там, где ранее не существовало.

Несколько критически важных этапов в этом протоколе требуют тщательного внимания для обеспечения воспроизводимых результатов. Во-первых, точная корректировка pH во время подготовки буфера (шаги 1.1.1 и 1.2.1) крайне важна, поскольку отклонения сверх единиц pH ±0.1 могут повлиять на стабильность наночастиц и эффективность захвата антител. Буфер с низким pH, используемый для подготовки захвата антител, обеспечивает оптимальную конъюгировку, а указанные условия буфера были оптимизированы для стабилизации заряда и широкой совместимости антител (обычно в контексте формулы). Буфер с pH 6,0 гистидина 10 мМ обеспечивает оптимальные электростатические взаимодействия при сохранении стабильности белка. Во-вторых, тщательный диализ с полным удалением соли (шаг 2.3) крайне важен; Неполный диализ может мешать электростатическим взаимодействиям во время сборки наночастиц. В-третьих, этап концентрации золотых наночастиц (шаги протокола 5.1–5.3) должен выполняться аккуратно, чтобы не нарушать гранулу, так как непоследовательные концентрации наночастиц напрямую влияют на чувствительность анализа. В-четвёртых, коэффициент PLL:захвата mAb 0,03 (шаг 4.1) оптимизирован для максимального покрытия поверхности при сохранении достаточного плазмонного смещения, как было^{установлено ранее 16}. Что касается динамики обращения с жидкостями, для нормализации и смешивания пластин использовались наконечники жидкого датчика до появления золотых наночастиц, которые ненадёжно измеряются в растворе (поэтому объёмы дозирования устанавливаются на стандартных уровнях). Жидкостный датчик вверх по потоку позволяет оператору отмечать проблемы с неправильным выравниванием пластин или отсутствующими образцами, а этап штамповки с 384 лунками выявляет проблемы с Z-выравниванием. Наконец, строгое соблюдение времени инкубации в 4 часа (шаги протокола 7.10–7.12) и постоянное чтение пластины от начала до конца (независимо от неполной пластины) критически важны, поскольку плазмонное сдвиг и кластеризация наночастиц зависят от времени явлениями; задержки или ранние показания могут привести к неточным результатам CS-SINS, тогда как чтение полной таблицы обеспечивает согласованность результатов в течение дней в формате HTP.

По мере того как коллоидная стабильность мультиспецифических антител всё больше изучается, крупные наборы данных, предоставляемые биофизическими анализами HTP, такими как CS-SINS, могут подавать модели AI/ML для лучшего понимания комбинаторных эффектов на стабильность молекул. Исследования показали, что по мере роста разнообразия последовательностей потребность в больших наборах данных увеличивается для повышения точности результатов AI/^ML 41,42,43. Свойства и молекулярные дескрипторы для моноспецифических могут изменяться при переформатировании в биспецифические или триспецифические, учитывая распределение заряда и баланс всей молекулы, в отличие от специфических для последовательностей или мотивов для таких характеристик, как риски химического^{разрушения} 17,18,19,20,21,22 . В частности, структурные особенности, такие как прогнозируемые электростатические участки, гидрофобность и площадь поверхности, доступная растворителям, могут улучшить прогнозы агрегации и стабильности независимо от специфических свойств последовательности, делая несколько меньших наборов данных совместимыми с подготовкой^{прогноза} 17,18,19,20,21,22 . Простота оценки CS-SINS как отсылки к репрезентативному итогу биофизического профиля молекулы делает анализ подходящим для обучения моделей искусственного интеллекта и машинного обучения.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
CLEARSEAL FILM 100PKCLEARSEAL	Fisher Scientific	500214
CO-RE II (50 μL Conductive Tips, 300 μL Conductive Tips, 300 µL Slim Conductive Tips)	Hamilton Company	235966, 235902, 235806
Eppendorf Tubes Snap Cap (5.0 мл, Microtube)	Eppendorf	30119401
Falcon Conical Centrifuge Tubes (15 мл)	Thermo Fisher Scientific	Falcon 352196
Koзлиное античеловеческое Fcγ-специфическое антитело	Jackson ImmunoResearch Laboratories	109-005-008
Золотые наночастицы (20 нм)	Ted Pella Inc.	157051
Greiner Bio-One 384-well μClear Bottom Polystyrene Microplates – (SS & DLS assay plates)	Fisher Scientific	07-000-057
Greiner Bio-One MASTERBLOCK 96 Deep Well Conical Bottom 2 мл Storage Plate – (mastermix and reagent mixing plates)	Fisher Scientific	07-000-122
Hard-Shell PCR Plates normalization (96-Well, low profile, thin wall, skirted, white/clear HSP9601)	Bio-Rad	HSP9601	URL: https://www.bio-rad.com/en-us/sku/HSP9601-hard-shell-96-well-pcr-plates-low-profile-thin-wall-skirted-white-clear?ID=HSP9601
Буфер гидрохлорида гистидина образец (10 мМ, pH = 6,0, буфер образца и анализа)	Sigma	H8125; H6034	Приготовить конечную концентрацию 5 мМ на реагент в ультрачистой воде, отрегулировать pH до 6,0, отрегулировать конечный объем ультрачистой водой и профильтровать с помощью 0,22 μм фильтра
Matrix ScrewTop Tubes образец (500 μL)	Thermo Fisher Scientific	3744
MD100 или MD300 Xpress Mini Dialyzer (Xpress Micro Dialyzer, Scienova, 6-8 кДа, 96 шт. в глубокой лунке пластинки (12 картриджа), пломбировочный лист) и диализный резервуар/коробка (кассеты для диализа с низким объемом)	Vivaproducts, Inc.	40789, 40076
Микроцентрифужные пробирки из чистого полипропилена (1,5 мл)	USA Scientific	1615-5500
Nalgene Disposable Polypropylene Robotic Reservoirs – (buffer trough)	Thermo Fisher Scientific	1200-2300
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes	Thermo Fisher Scientific	567-0020
Poly-L-lysine, >70,000 MW	MP Biomedicals	219454405	Приготовить 5 мг/мл стоковый раствор в ультрачистой воде
Положительные и отрицательные контроли (1 мг/мл диализированный в 10 мМ гистидин, pH 6)	Внутренне произведенные коммерческие антитела	N/A	~2 нм спектральная смена и размер DLS 250-300 нм для положительного контроля; незначительная спектральная смена и размер DLS сопоставимый с контрольным буфером только
Буфер ацетата калия для захвата (20 мМ, pH = 4,3, буфер конъюгации mAb)	Fisher Scientific	P171-500	Приготовить конечную концентрацию 10 мМ реагента в ультрачистой воде, отрегулировать pH до 4,3 с уксусной кислотой, отрегулировать конечный объем ультрачистой водой и профильтровать с помощью 0,22 μм фильтра
Zeba десалинирующие колонки (2 мл, 5 мл или 10 мл)	Thermo Fisher Scientific	PI-89889; 89891; 89893