Method Article

Сравнительный анализ структуры РНК зарождающихся и зрелых транскриптов у Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/69945

⸱

February 27th, 2026

 ,  ,  , 
1Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 2RNA Therapeutics Institute, UMass Chan Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вторичная структура РНК в основном наблюдалась у зрелой РНК с помощью методов структурного исследования. Ко-транскрипционное отслеживание структуры (CoSTseq) объединяет ядерный run-on, который использовался для изучения положения полимеразы на зарождающейся РНК, с зондированием структуры. Таким образом, CoSTseq позволяет наблюдать вторичную структуру РНК в РНК при активной транскрипции.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Во время транскрипции зарождающаяся РНК начинает спаривание оснований, выходя из РНК-полимераз (Pols). Такое спаривание оснований позволяет формировать структуры РНК, которые критически влияют на экспрессию генов на уровне обработки, трансляции и стабильности РНК. Устоявшиеся методы изучения вторичной структуры РНК ограничены зрелыми транскриптами, в то время как о состояниях сворачивания известно мало. Кроме того, относительно низкая численность (< 1%) и временный характер зарождающейся РНК усложняют её изоляцию и характеристику. Ко-транскрипционное отслеживание структуры (CoSTseq) использует транскрипционный проход с биотин-NTP и диметилсульфатом (DMS) для одновременного выявления положения Pol и статуса пары оснований зарождающихся транскриптов. У Saccharomyces cerevisiae CoSTseq даёт информацию о последовательности и структуре у 3'-конца зарождающихся РНК, транскрибируемых любой из трёх РНК-Pol. Во время транскрипционного прохождения биотин-NTP, инкорпорируемый в активном участке, эффективно останавливает Pols. Затем лечение ДМС метилатизирует неспаренные нуклеотиды A, C и U. Последующее обогащение биотина и синтез кДНК с помощью обратной транскриптазы, переключающей шаблоны, позволяет секвенировать парные концы и вычислять реактивность DMS в зависимости от положения Pol. CoSTseq легко выполняется параллельно с DMS-зондированием (DMS-MaPseq), что также позволяет захватывать сложенный зрелый транскрипт. Здесь представлен подробный протокол для параллельных CoSTseq и DMS-MaPseq, включая транскрипционное запуск, подготовку библиотеки и анализ данных.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

РНК может сворачиваться во вторичные и третичные структуры из-за спаривания оснований внутри молекул РНК, и эти структуры могут дополнительно подвергаться влиянию белков, выступающих в роли шаперонов, направляющих сворачиваниеРНК 1. Структура РНК может быть высокодинамичной, когда клеточные РНК могут подстраиваться под ряд структур, определённых термодинамическим ландшафтом, для формирования ансамблей возможных конформацийРНК 2. Динамические конформационные изменения могут повлиять на регуляцию и экспрессиюгенов 3,4. В то же врем....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом убедитесь, что все буферы, указанные в Таблице 1, подготовлены. Все реагенты должны быть приготовлены в воде без нуклеазы. Фильтрная стерилизация буферов рекомендуется при использовании химикатов/реагентов немолекулярно-биологического класса для подготовки буфера. Для разделов 1–4 заранее подготовьте следующее:

1. Подготовка материалов и реагентов

  1. Приготовьте раствор с 10% саркозил (v/v) как минимум за день до заранее, чтобы дать достаточно времени для полного растворения. Фильтруйте-стерилизуйте однородный раствор с помощью фильтра 0,2....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом разделе представлены фактические результаты, полученные при реализации рабочего процесса и анализа CoSTseq, как описано в данном протоколе. Во-первых, в этом разделе описываются ожидаемые результаты после оценки качества успешной подготовки библиотеки до и после секвенирования. Перед секвенированием исследователи могут использовать тестовое ПЦР и анализ TapeStation для подтверждения наличия РНК после обогащения биотином. Это указывает на успешное выделение зарождающейся РНК в ходе.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

РНК начинает складываться ко-транскрипционно благодаря более высокой кинетике спаривания оснований по сравнению со скоростьюсинтеза 24,25,26,27. Наши современные знания о зарождающемся сворачивании РНК основаны на мономолекулярных исследованиях прокариотических РНК, in vitro зондировании или методах in silico. В этом протоколе представлен подр.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают благодарность доктору SK Boopathy Jegathambal за программирование и сотрудников лаборатории Neugebauer, особенно P. Bech, за полезные обсуждения. Эта работа была поддержана Национальными институтами здоровья (R01GM112766 до KMN) и преддокторской стипендией Американской кардиологической ассоциации (908949 до LS). LPS поддерживался грантом NIH на обучение 5T32GM14943803. LRAB поддерживался постдокторской стипендией Американской кардиологической ассоциации (26POST1569544). Сбор данных в Центре геномного анализа Йельского университета был поддержан Национальным институтом общих медицинских наук Национальных институтов здра....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 мМ АТФИнвитроген18330019
10 мМ биотин-11-CTPJena biosciencesNU-831-BIOX
10mM GTPИнвитроген18332015
10mM UTPИнвитроген18333013
10X NEBuffer 1New England BiolabsB7001SИспользуется в шаге 7.2.1
Физиологический раствор с буфером 10 фосфатов (PBS)Gibco70011-044
20% SDSRPI L23100-500
Кислотный фенол: хлороформ и bbsp;АмбионAM9722
Бусины AMPure XP для выбора размераБекман Коултер A63880Используется для выбора размера на шаге 7.5.1
Бакто ПептонеGibco211677
Экстракт дрожжей бактоGibco212750
БицинСигма ОлдричB3876-100G
ХлороформСигма Олдрич319988
D-(+)-ГЛЮКОЗАСигма ОлдричG5767-500G
ДИФКО АГАРBD DIFCO214010
ДиметилсульфатСигма ОлдричD186309-5ML
Dynabeads и trade; MyOne Streptavidin C1 бусины Инвитроген65001Используется для вытяжения биотина в разделе 4.1
Dynabeads и trade; мРНК DIRECT&Trade; Набор для очисткиИнвитроген61011Используется для выбора Poly A в разделе 5.1
ЭДТА, pH 8, 0,5 мSigma Aldrich 03690-100ML
ЭтанолСигма ОлдричE7023-500ML
GlycoBlueИнвитрогенAM9516Ко-преципитант, используемый в шагах 4.2.7 и 5.2.4
Induro®   Обратная транскриптазаNew England BiolabsM0681SФермент RT, используемый в шаге 6.3.1
Изоамиловый спиртSigma Aldrich W205710-1KG-K
ИзопропанолJT-BAKER9084-05-01
KAPA HiFi HotStart PCR Kit   Рош07958889001Высококачественный ДНК Pol, используемый в 7.3.2 и 7.4.1 для ПЦР-реакций
Хлорид магнияСигма ОлдричSLCM2154
Комплект для очистки ПЦР MinEluteЦягэн28004Используется для очистки ДНК на шагах 6.3.3 и 7.2.2
Mth РНК-лигазаNew England BiolabsM2611A
Oligo Clean & КонцентраторZymo ResearchD4060Рекомендуется очистка ДНК Oligo на шаге 7.1.2
Ацетат калия Сигма Олдрич236497-500G
Хлорид калияДжей Ти Бейкер3040-01
Гидроксид калияAvantor6984-04-01
РНК Clean & Концентратор-5Zymo ResearchR1014Набор для очистки РНК, используемый в шаге 5.3.2 после обработки PNK
RNaseOUT™ Ингибитор рекомбинантной рибонуклеазыТермо Фишер Сайентифик10777019Ингибитор РНаз, используемый на этапе 5.3.1 во время лечения PNK
СаркозилIBI ScientificIB07080
Ацетат натрияКачество биологических характеристик351-035-721
Хлорид натрияСигма ОлдричS5150-1L
Гидроксид натрия и bbsp;Макрон7708-10
SUPERase и middot; In™ Ингибитор РНазы (20 U/μ L)Термо Фишер СайентификAM2696Ингибитор РНаз, используемый на шаге 6.3.1
Т4-полинуклеотидкиназаNew England BiolabsM0201S
Термостабильный 5' Приложенная ДНК/РНК-лигазаNew England BiolabsM0319L
Tris-HCl, pH 7,4, 1MThermo ScientificJ60202. K2
Triton X-100TEKNOVAT1105
TRIzol™ РеагентИнвитроген15596-026Для зарождающейся элюции РНК в разделе 4.2; также называется «РНК-реагент» в разделе 4
&бета;-меркаптоэтанолСигма ОлдричM6250-1L

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, J., Fei, Y., Sun, L. Advances and opportunities in RNA structure experimental determination and computational modeling. Nature Methods. 19 (10), 1193-1207 (2022).
  2. Bonilla, S. L., Jones, A. N., Incarnato, D. Structural....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RNA Structure AnalysisNascent RNA FoldingMature RNA StructureSaccharomyces CerevisiaeCo Transcriptional Structure TrackingDMS ProbingRNA Polymerase PositionBiotinylated RNATemplate SwitchingRNA Secondary Structure

Related Articles