Method Article

Сравнительный анализ структуры РНК зарождающихся и зрелых транскриптов у Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/69945

⸱

February 27th, 2026

 ,  ,  , 
1Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 2RNA Therapeutics Institute, UMass Chan Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вторичная структура РНК в основном наблюдалась у зрелой РНК с помощью методов структурного исследования. Ко-транскрипционное отслеживание структуры (CoSTseq) объединяет ядерный run-on, который использовался для изучения положения полимеразы на зарождающейся РНК, с зондированием структуры. Таким образом, CoSTseq позволяет наблюдать вторичную структуру РНК в РНК при активной транскрипции.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Во время транскрипции зарождающаяся РНК начинает спаривание оснований, выходя из РНК-полимераз (Pols). Такое спаривание оснований позволяет формировать структуры РНК, которые критически влияют на экспрессию генов на уровне обработки, трансляции и стабильности РНК. Устоявшиеся методы изучения вторичной структуры РНК ограничены зрелыми транскриптами, в то время как о состояниях сворачивания известно мало. Кроме того, относительно низкая численность (< 1%) и временный характер зарождающейся РНК усложняют её изоляцию и характеристику. Ко-транскрипционное отслеживание структуры (CoSTseq) использует транскрипционный проход с биотин-NTP и диметилсульфатом (DMS) для одновременного выявления положения Pol и статуса пары оснований зарождающихся транскриптов. У Saccharomyces cerevisiae CoSTseq даёт информацию о последовательности и структуре у 3'-конца зарождающихся РНК, транскрибируемых любой из трёх РНК-Pol. Во время транскрипционного прохождения биотин-NTP, инкорпорируемый в активном участке, эффективно останавливает Pols. Затем лечение ДМС метилатизирует неспаренные нуклеотиды A, C и U. Последующее обогащение биотина и синтез кДНК с помощью обратной транскриптазы, переключающей шаблоны, позволяет секвенировать парные концы и вычислять реактивность DMS в зависимости от положения Pol. CoSTseq легко выполняется параллельно с DMS-зондированием (DMS-MaPseq), что также позволяет захватывать сложенный зрелый транскрипт. Здесь представлен подробный протокол для параллельных CoSTseq и DMS-MaPseq, включая транскрипционное запуск, подготовку библиотеки и анализ данных.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

РНК может сворачиваться во вторичные и третичные структуры из-за спаривания оснований внутри молекул РНК, и эти структуры могут дополнительно подвергаться влиянию белков, выступающих в роли шаперонов, направляющих сворачиваниеРНК 1. Структура РНК может быть высокодинамичной, когда клеточные РНК могут подстраиваться под ряд структур, определённых термодинамическим ландшафтом, для формирования ансамблей возможных конформацийРНК 2. Динамические конформационные изменения могут повлиять на регуляцию и экспрессиюгенов 3,4. В то же время РНК также может принимать высоко благоприятные структуры, тесно связанные с её функцией, такие как тРНК, малые ядерные РНК и рРНК. Хотя эти примеры выделяют зрелые РНК с сильной регуляторной ролью, этапы обработки эукариотической РНК часто совпадают с транскрипцией, включая пре-мРНК-сплайсинг, расщепление на 3'-концах и модификацию РНК. Аналогично, сворачивание РНК может происходить до созревания транскрипта, как обсуждалось вдругом пункте 5.

Хотя последовательность РНК может кодировать вторичную структуру, точное определение часто требует экспериментальной валидации in vitro или in vivo. Появление структуроспецифических методов химической модификации, таких как DMS-MaPseq (мутационное профилирование диметилсульфата с секвенированием), проложило путь к определению вторичной структуры клеточной РНК из живыхклеток 6. ДМС вводится в клетки и конкретно метилирует грани пары оснований Уотсона-Крика — аденозина, цитозина и, в меньшей степени, уридина, которые доступны только без пары. После модификации с помощью DMS высокоточная и высокопроцессивная обратная транскриптаза, такая как термостабильная группа II Intron Reverse Transcriptase (TGIRT)7, может использоваться для перекодирования модифицированных баз как мутаций в готовой библиотеке кДНК. Эти мутации затем можно использовать для определения доступности РНК на нуклеотидном уровне. Хотя это мощный метод, DMS-MaPseq и связанные с ней методы в основном используются для изучения зрелой РНК, которая уже полностьюсвернута.

Разработано несколько методов для изучения регуляции и обработки зарождающейся РНК. Глобальное run-on секвенирование (GROseq) было разработано для преодоления ограничений RNA-seq, который позволяет измерять уровень РНК в клетках в стационарном состоянии и, таким образом, предоставляет усреднение по транскрипции, обработке РНК и процессам деградации, влияющим на уровни РНК. GROseq использовала бромуридин для ядерного запуска, где РНК-полимераза (Pol) могла добавлять нуклеотиды в зарождающуюся РНК с разрешением десятковоснований 8. Точное секвенирование при выполнении (PROseq) было построено на основе этой методологии для отображения РНК Pols на зарождающейся РНК с разрешением базовых пар с использованием биотин-NTP. Здесь добавляется биотинилированный NTP, где Pol в последний раз был обнаружен на 3'-конце недавно синтезированнойРНК-9.

Недавно Шерфен и соавторы разработали и использовали котранскрипционное отслеживание структуры (CoSTseq), которое использует и адаптирует зондирование биотина по течению и DMS для определения структуры РНК зарождающихся транскриптов у S. cerevisiae10. CoSTseq позволяет определить вторичную структуру РНК во время активной транскрипции; в этом протоколе подробно описано, как ядерный запуск объединяется с DMS-зондированием во время экспериментов CoSTseq. Учитывая, что CoSTseq требует тщательного обращения при подготовке образцов, а также внимательного внимания к качеству данных при анализе CoSTseq, этот протокол подробно описывает лучшие практики создания подходящих библиотек для парного секвенирования на платформе Illumina. Протокол CoSTseq одновременно даёт зарождающуюся и зрелую РНК, последнюю из которых можно проанализировать как набор данных DMS-MaPseq для строгого сравнения между зарождающейся и зрелой РНК (см. рисунок 1). Экспериментально необходим доступ к реагентам, необходимым для поддержания культур дрожжей и проведения ядерного исследования и ДМС, как подробно описано в протоколе ниже. Зарождающаяся добыча РНК критически важна для успеха подготовки библиотек CoSTseq и анализа данных; Таким образом, условия роста, установленные соответствующими инкубаторами и средами роста, критически важны для обеспечения достаточного количества исходного материала. Наконец, для проведения вычислительного анализа данных CoSTseq идеальный вариант доступа к кластеру высокопроизводительных вычислений (HPC).

figure-introduction-1
Рисунок 1: Обзор комбинированной подготовки библиотеки CoSTseq и DMS-MaPseq из одного биологического образца. (A) Проницаемость клеточных стенок и ядерной мембраны дрожжей с помощью саркозила позволяет инкорпорировать биотин-NTP на 3'-конце зарождающейся РНК во время ядерной реакции. (B) DMS метилирует непарные остатки A и C (иногда U) на зарождающейся и зрелой РНК в пермеабилизированной клетке, а общая РНК получается экстракцией фенол/хлороформа. Зарождающаяся РНК затем очищается из всей РНК магнитными шариками, конъюгированными со стрептавидином; Экстракция TRIzol высвобождает зарождающуюся РНК из шариков. Параллельно супернатант шариков, содержащий полиаденилированные мРНК, может быть осадён с помощью EtOH; из этого материала мРНК можно выделить с помощью олиго(dT) вытягивания шариков. МРНК Poly A+ фрагментируются до подготовки библиотеки. (C) Для отдельного генерирования cDNA из зарождающейся или зрелой РНК используется обратная транскриптаза с переключением шаблона, затем для введения N7 UMI и штрихкодов (см . рисунок 2 для подробностей CoSTseq). Обратите внимание, что обратные транскрипционные шаги DMS-MaPseq и CoSTseq будут использовать отдельные гетеродуплексные адаптеры с навесами, дополняющими биотин-NTP, используемых в CoSTseq и N, применяемых в DMS-MaPseq. Минимальные циклы ПЦР используются для усиления, чтобы ограничить смещение в библиотеке, а выбор размера применяется для удаления адаптерных димеров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом убедитесь, что все буферы, указанные в Таблице 1, подготовлены. Все реагенты должны быть приготовлены в воде без нуклеазы. Фильтрная стерилизация буферов рекомендуется при использовании химикатов/реагентов немолекулярно-биологического класса для подготовки буфера. Для разделов 1–4 заранее подготовьте следующее:

1. Подготовка материалов и реагентов

  1. Приготовьте раствор с 10% саркозил (v/v) как минимум за день до заранее, чтобы дать достаточно времени для полного растворения. Фильтруйте-стерилизуйте однородный раствор с помощью фильтра 0,22 мкм. В день эксперимента используйте 10% саркозил, чтобы получить раствор саркозила с 0,5%, и оставьте его на льду до использования.
  2. Предварительное охлаждение ультрацентрифуг до 4 °C. В вытяжке установите термомиксер на 30 °C и предварительно нагрейте аликвоту 2,5x буфера для зондирования структуры. Этот термомиксер будет использоваться для обработки ДМС позже.
  3. В выхлопной вытяжке установите термоблок на 65 °C и нагрейте 650 мкл кислотного фенола: хлороформ за каждую реакцию для экстракции РНК.
  4. Смешать DTT с транскрипционным буфером 2,5x до конечной концентрации 2 мМ. Свежей подготовьте и предварительно охладите растворы для закалки и промывки для немедленного применения после обработки DMS (см. Таблицу 1).
  5. Аликвот 40 мкл 20% SDS в трубки для лизиса дрожжей перед экстракцией РНК. Приготовьте раствор хлорида цинка (ZnCl2) объемом 100 мм и простерилизуйте фильтром перед использованием.
  6. Генерируйте штамы дрожжей с делецией, истощением или knock-in, которые могут потребоваться для решения конкретных исследовательских вопросов о паре оснований зарождающейся РНК в сравнении с диким типом дрожжей. Всегда оживляйте штаммы, нанося полоски на подходящую пластинку для дрожжей (YPD, dropout или антибиотики). Начните жидкую культуру из одной колонии за день до начала эксперимента. Для получения дополнительных инструкций по росту и манипуляции дрожжевыми штаммами, пожалуйста, обратитесь к Schärfen et al., 2025.

2. Подготовка дрожжевых клеток для CoSTseq

  1. Подготовка прекультуры: выращивать штамм S. cerevisiae BY4741 в 50 мл среды YPAD до достижения средней фазы логарифма (оптическая плотность (OD) при 600 нм = 0,6) при 30 °C при встряхивании при 200 об/мин. При необходимости разведите культуру до OD 0.2-0.3 и дайте дрожжам достичь 0.6 OD.
  2. Сбор дрожжей: Собрать и открутить 1,8 OD (~3 мл) дрожжей культуры при 2 500 x g в течение 3 минут в предварительно охлажденной центрифуге (4 °C). Выбросьте супернатант в контейнер для отходов. Промывайте пеллеты, повторно взвешивая 10 мл холодного физраствора, буферированного фосфатом (PBS). Открутите ещё раз при 2 500 x g в течение 3 минут при 4 °C. Избавьтесь от супернатанта и держите дрожжевые гранулы во льду.
  3. Проницаемость клеток дрожжей: Аккуратно суспензировать дрожжевые гранулы в 10 мл холодного саркозила с 0,5% содержанием. Используйте пипеттору P1000 для повторного подвешивания ячеек и избегайте образования пузырьков. Инкубировать на льду в течение 20 минут, чтобы способствовать проницаемости. Пеллетируйте проницаемые клетки дрожжей при 400 г в течение 5 минут при 4 °C. Ресуспензировать проницаемые дрожжевые клетки в 100 мкл воды без нуклеаз.

ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя маркировка DMS не требует проницаемости клеточной стенки, ядерная реакция запуска требует пермеабилизации, чтобы биотинилированные нуклеотиды достигли места транскрипции. Это достигается с помощью обработки саркозилом, которое проникает как дрожжевую клеточную стенку, так и её ядерную мембрану. Кроме того, обработка саркозилом облегчает продолжение анализа, предотвращая новые события инициации транскрипции и вытесняя отрицательные факторы удлинения из Pol II ихроматина 11,12. Аккуратно обращайтесь с образцами и поддерживайте низкую центробежную скорость (400 x g), чтобы предотвратить разрыв клеток и способствовать успешному включению биотина в удлиняющиеся зарождающиесятранскрипты 13.

3. Ядерный запуск и зондирование ДМС

ПРИМЕЧАНИЕ: Ядерный процессор с биотином-НТФ вводит стерическую препятствие, которая останавливает РНК Pols в их активном участке и обеспечивает биотин-контроллер для селективного обогащения зарождающейся РНК. В зависимости от желаемого разрешения можно выполнить ядерный запуск с использованием одного, двух или всех четырёх биотинилированных рибонуклеотидов9. Для экономической эффективности описанный здесь рабочий процесс использует только один биотинилированный нуклеотид (то есть биотин-CTP).

  1. Подготовка ядерной реакции на запуск
    1. Подготовьте рабочее решение для транскрипционного буфера 2,5x с добавлением 5 mM DTT и предварительно разогреваем буфер структуры 2,5x до 30 °C (см. таблицу 1).
    2. В чистую трубку объёмом 2 мл добавьте 120 мкл транскрипционного буфера 2,5x, 3,75 мкл 10 мМ АТФ, 3,75 мкл 10 мМ ГТФ, 3,75 мкл 10 мМ УТФ, 7,5 мкл 1 мМ био-ЦТФ, 15 мкл 10% саркозила и увеличите объём до 200 мкл при 46,25 мкл безнуклеазной воды.
    3. Добавьте 100 мкл ячеек в трубку и инкубируете в термомиксере, установленном на 30 °C в течение 2 минут с встряхиванием при 500 об/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг очень срочный. Старайтесь ограничить количество выборок для получения надёжных данных. Лучше всего распределять тайминг между сэмплами для обеспечения согласованности.
  2. Обработка с DMS: После завершения инкубации быстро добавьте в трубку 200 мкл предварительно подогреного буфера для зондирования структуры 2,5x и 25 мкл реагента DMS одновременно. Плавно встряхивайтесь двумя импульсами и продолжайте инкубировать на термомиксере в течение 4 минут при 30 °C, встряхивая при 500 об/мин. Разделяйте 30 секунд между сэмплами, чтобы быть согласованным.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ДМС-зондирование — это мгновенная реакция, позволяющая получить высокое временное разрешение14 состояния пары РНК-оснований. Чтобы предотвратить непрерывную модификацию DMS, крайне важно оперативно погасить маркировку DMS с помощью сильного восстанавливающего агента β-меркаптоэтанола. Кроме того, любой оставшийся DMS будет затруднять восстановление РНК при извлечении. Добавление насыщенного водой изоамил-спирта перед центрифугированием может удалить остатки нерастворимого ДМС вклеточной грануле 15. Этот шаг очень срочный. Для получения надёжных данных необходимо работать с ограниченным числом выборок.
    ВНИМАНИЕ: DMS — это очень токсичная, бесцветная жидкость с лёгким луковым запахом. При работе с DMS требуются крайние меры предосторожности. Прямой контакт и/или вдыхание паров может привести к некроз глаз, рта и дыхательных путей, включая серьёзное повреждение органов. Используйте защитные очки, лабораторный халат и подходящие перчатки. При возможности надевайте двойные перчатки и сразу меняйте перчатки после экспозиции или после использования в ДМС. Выполните шаги с DMS под вытяжкой для выхлопа. Используйте специальные контейнеры для утилизации отходов DMS.
  3. Закалка и промывка
    1. Заранее подготовьте буферы для остановки и мойки, как указано в Таблице 1 , и положите их на лёд до использования. Остановите метилирование DMS, добавив 1 мл стоп-буфера.
    2. Прокрутите пробы с маркировкой DMS на 5 минут при 3 500 x g в предварительно охлаждённой центрифуге. Выбросьте отходы в соответствующий контейнер.
    3. Добавьте 1 мл буфера для промывки в пеллет и снова подвесите. Повторите шаг 3.3.2. Немедленно приступайте к извлечению РНК. Не замораживайте дрожжевые гранулы.
  4. Экстракция фенолхлороформ
    1. Суспензировать дрожжи, маркированные DMS, в 600 мкл буфера лизиса РНК, затем перевести суспензию в трубки с 40 мкл 20% SDS. Инкубировать при 65 °C в течение 30 секунд с встряхиванием при 950 об/мин.
    2. Добавьте 650 мкл предварительно подогретого кислотного фенол-хлороформа в лизат дрожжей и продолжайте нагревать на термомиксере 2 минуты при 65 °C с встряхиванием при 950 об/мин. Дайте образцам постоять на льду на 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пока что переключите нагревательный блок или термомиксер на комнатную температуру (RT).
    3. Центрифугу при 20 000 x g в течение 3 минут на RT.
    4. Переместите верхний слой в новую трубку и добавьте 650 мкл хлороформа. Вихрь на мгновение. Снова центрифугуйте и соберите верхний слой в новую трубку с 700 мкл изопропанола.
    5. Переверните, чтобы смешать и инкубировать в морозильнике при -20 °C в течение 30 минут, давая РНК осадиться. Центрифуга при 20 000 x g в течение 45 минут при 4 °C. Отбросьте супернатант. Промой гранулы 750 мкл этанола 75% (EtOH).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это точка остановки/паузы в протоколе. Образцы можно оставить на ночь при -80 °C при 75% EtOH.
    6. Покрутите 3 минуты при 20 000 x g и отбросьте супернатант. Высушить РНК-гранулу на воздухе и растворить её в 81 мкл воды без нуклеаз. Количественно определите выход РНК с помощью спектрофотометра, установленного на длину волны 260 нм. Примените 1 мкл вышеуказанной ресуспензии для измерения. При необходимости разбавлять образец РНК. Для перехода к следующему этапу должно присутствовать не менее 80 мкг общей РНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости РНК с меткой DMS может храниться при -80 °C до 2 недель.

4. Зарождающаяся РНК (CoSTseq)

ПРИМЕЧАНИЕ: Общая РНК, полученная из экстракции фенола: хлороформа, содержит зрелые РНК с меткой DMS, а также биотинилированные зарождающиеся РНК из всех трёх полимераз, маркированных DMS. Для очистки зарождающихся РНК от полной РНК следующие шаги включают использование стрептавидиновых шариков для обогащения биотинилированной зарождающейся РНК. Из-за сильной аффинности биотина со стрептавидином (Kd = 10-14 - 10-15 M) проводятся два последовательных экстракции РНК-реагентов (см. таблицу материалов) для элюции РНК со стрептавидиновых шариков. Обратите внимание, что менее 1% дрожжевой РНК является зарождающейся РНК, в зависимости от условийроста 16.

  1. Биотиновый пуллдаун
    1. Подготовка магнитных бусинок Streptavidin
      1. Подготовьте буфер предварительной промывки A и буфер B, как показано в таблице 1 для состава. Гомогенизировать магнитные шарики Streptavidin путём вихря. Получить 44 мкл гомогенизированных магнитных шариков на образец с общей РНК 80 мкг.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Масштабируйте, умножив объём на количество образцов.
      2. Положите магнитные шарики на магнитную стойку и уберите раствор для хранения. Подвесьте магнитные шарики в 1 мл предварительного буфера A.
      3. Инкубировать 2 минуты при комнатной температуре. Намагничивайте и удалите супернатант. Повторите стирку. Промыйте 1 раз с 1 мл буфера предварительной мойки B. Намагничивайте и удалите супернатант, быстро переходите к этапу перевязки и промывки.
    2. Переплёт и стирка
      1. Подготовьте буферы для промывания с высоким содержанием 2, 1 буфера с высоким содержанием соли и с низким содержанием соли, как показано в таблице 1.
      2. Подвесьте предварительно промытые бусины, добавив вдвое больше исходного объёма (88 мкл) 2x буфера для переплёта. Перенесите 80 мкл шариков в стерильную трубку объёмом 1,5 мл, содержащую 80 мкл биотинилированного образца РНК.
      3. Вращайте смесь с образцами бусинок на ротаторе в течение 20 минут при комнатной температуре. Собирать сквозную РНК, содержащую зрелую РНК, по магнитной стадии (перейти к этапу осадка).
      4. Промывайте зарождающийся РНК-комплекс с 500 мкл буфера с высоким содержанием соли два раза. Проведите одно полоскание с 500 мкл 1x бинтования, затем одно промывка с 500 мкл буфера с низким содержанием соли.
  2. Элюция с помощью экстракции РНК-реагентов
    1. Предварительно нагрейте термомиксер до 60 °C. Охлаждение центрифуга, способная развивать скорость от 20 000 x g до 4 °C.
    2. Добавьте 300 мкл РНК-реагента (см. Таблицу материалов) в зарождающийся РНК-комплекс и повторно суспензуйте. Инкубировать на термомиксере в течение 5 минут, установив температуру до 60 °C.
    3. Добавьте 60 мкл хлороформа, вихрь и инкубировать 3 минуты при RT. Вращение при 14 000 x g в течение 5 минут в предварительно охлажденной центрифуге.
    4. Переместите верхнюю водную фазу в новую сборную трубку (~180 мкл). Отбросьте органическую фазу, оставив бусины и оставшуюся водную фазу.
    5. Повторяйте экстракцию, чтобы получить итоговый объём водной фазы 360 мкл в сборной трубке.
    6. Добавьте 360 мкл хлороформа в сборную трубку и кратковременно создайте вихрь. Вращайте при 14 000 x g в течение 5 минут в предварительно охлаждённой центрифуге.
    7. Перенесите (примерно 350 мкл) верхнего слоя в свежую трубку. Осадьте РНК, добавив 900 мкл абсолютного EtOH и 1 мкл соосадного вещества.
    8. Кратковременный вихрь и позволяет осадкам происходить при -20 °C в течение 20 минут или -80 °C ночью.
    9. В предварительно охлаждённой центрифуге центрифуга при 20 000 x g на 20 минут. Аккуратно отбросьте супернатант.
    10. Промыйте гранулы 750 мкл 75% EtOH, затем проведите ещё одну холодную центрифугу при 20 000 х г в течение 5 минут.
    11. Высушите гранулы, чтобы удалить остатки EtOH на 10 минут. Растворить РНК-гранулу в 3,75 мкл H2O.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точечное блотинг элюированной РНК с последующим зондированием конъюгатом стрептавидин-HRP является наиболее эффективным методом оценки вытяжения биотина. Однако такой подход потребляет значительное количество образцов, оставляя недостаточно материала для подготовки в библиотеке.
  3. Осадки супернатанта
    1. Осадьте супернатант, содержащий зрелые РНК, добавив 2,5-3 тома EtOH. Опустите осадки при -20 °C в течение 1 часа.
    2. В предварительно охлаждённой центрифуге откройте 45 минут при 20 000 x g. Аккуратно аспирируйте супернатант.
    3. Промой РНК-гранулу с 0,5 мл 75% EtOH. Высушите и растворите гранулы в 50 мкл воды без нуклеаз. Поставьте трубку на нагревательный блок при температуре 65 °C для улучшения растворения РНК-гранулы.
    4. Для дальнейших этапов измеряйте концентрацию РНК с помощью спектрофотометра.

5. Зрелая РНК (DMS-MaPseq)

  1. Выбор Poly A
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полиаденилированные зрелые РНК очищаются с помощью захвата аффинности на основе олиго(dT). Этот протокол оптимизирован для использования набора для очистки мРНК Dynabeads DIRECT (см. таблицу материалов). В качестве предварительной подготовки разогрейте 1 мл безнуклеазной воды до 80 °C для разрежения и установите тепловой блок до 70 °C.
    1. Подготовка РНК для поли-А пуллдауна: Перенос 50 мкг осаждённой РНК и доведение её до конечного объёма 300 мкл с использованием безнуклеазной воды. Нагрейте РНК при 70 °C в течение 2 минут, чтобы разрушить вторичные структуры, и немедленно поместите её на лёд. Смешайте РНК с 300 мкл буфера лизиса/связывания и кратковременно создайте вихрь.
    2. Подготовка магнитных бусин: Подвесьте магнитные шарики с помощью вихря не менее 30 секунд. Перенесите 100 мкл подвешенных шариков на образец в стерильную трубку объёмом 1,5 мл. Намагничи, чтобы сбросить буфер для хранения. Промывайте магнитные шарики в равном объёме буфера лизис/связывания, намагничивайте и сбрасуйте супернатант.
    3. Переплёт и стирка
      1. Добавьте 100 мкл предварительно промытых шариков к 600 мкл подготовленного образца РНК. Вращайте непрерывно на вращателе в течение 5 минут при комнатной температуре.
      2. Соберите бусины, положив их на магнитную стойку, и выбросьте поток из них. Промой шарики с помощью 600 мкл буфера для стирки. А. Пипетте для смешивания.
      3. Снова соберите бусины, чтобы выбросить стирку. Промой шарики с помощью 300 мкл буфера для стирки B. Пипетте для смешивания.
      4. Снова соберите бусины, чтобы выбросить стирку. Смешайте бусины с 90 мкл тёплой (80 °C) воды и позвольте перевязывать её, добавив 90 мкл лизиса/буфера связывания. Повторите шаг 5.1.3.1-5.1.3.3.
    4. Элюзия: Подвесьте шарики в 30 мкл тёплой (80 °C) безнуклеазной воды. Инкубировать при 75–80 °C в течение 2 минут. Быстро подвергайте шарики воздействию магнитного поля и собирайте элуат в трубку без РНаз. Повторите элюирование и соберите элюированную РНК.
  2. Фрагментация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фрагментация мРНК может быть достигнута как ферментативными, так и химическими методами. Здесь для фрагментации используются хлорид цинка и тепло. В отличие от ферментов, требующих определённой последовательности или структурных элементов, ионы цинка действуют как кислота Льюиса, активируя 2' кислород (нуклеофиль) и расщепляя фосфодиэстеровую основу. Это приводит к образованию 5' OH и 2',3' циклического фосфатного эфира на продуктовыхРНК-цепях 17.
    1. Предварительно разогрейте термоцикл с температурой блока 94 °C и температурой крышки 105 °C. Поместите 54 мкл элюированной мРНК в ПЦР-трубку.
    2. Добавьте 6 мкл раствора хлорида цинка 100 мм (конечная концентрация 10 мм), создайте вихрь на 2 секунды и немедленно инкубируете при 94 °C в течение 55 секунд на предварительно нагретом термоциклере.
    3. В конце инкубации закалите фрагментационную реакцию с помощью 6,6 мкл EDTA 0,5 м (конечная концентрация 50 мм), пипеткой вверх и вниз для смешивания и быстро поместите трубки на лёд. Перенесите содержимое в стерильные трубки объёмом 1,5 мл.
    4. Разрешить осаждение фрагментированных мРНК с добавлением 150 мкл изопропанола, 15 мкл 3 м ацетата натрия, pH 5,2 и 1 мкл соосадка.
    5. Поставьте при -20 °C на 30 минут. Вращайте при 20 000 x g в течение 45 минут в предварительно охлаждённой центрифуге. Промыйте гранулы с 75% EtOH и растворите её в 15 мкл воды без нуклеаз.
  3. Обработка PNK
    ПРИМЕЧАНИЕ: Химическая фрагментация с помощьюZnCl2 приводит к образованию концов 5' и 3', неподходящими дляперевязки 17. Таким образом, после химической фрагментации РНК подвергаются обработке полинуклеотидкиназой (PNK), которая фосфорилирует 5' OH и дефосфорилирует 3' фосфатные концы, которые затем могут быть связаны садаптерами 18.
    1. Добавьте 1 мкл ингибитора рибонуклеазы, 2 мкл 10x буфера PNK и 2 мкл T4 PNK. Инкубировать при 37 °C в течение 60 минут. Остановите реакцию, добавив 30 мкл воды без нуклеаз, 50 мкл буфера связывания РНК и 50 мкл EtOH.
    2. Используйте метод очистки РНК на основе спин-колонки для удаления загрязнителей и концентрации РНК. Это можно сделать с помощью коммерчески доступного комплекта (набор для очистки и концентратора РНК, см. таблицу материалов). Вкратце: смешайте два тома буфера связывания РНК с одним объёмом образца, смешайте равный объём этой смеси с 100% EtOH и загрузите на спин-колонку с помощью свежей трубки для сбора трубки. Прокрутите этот образец и избавьтесь от прохождения. Промыйте спин-колонку 700 мкл буфера для промывания РНК и один раз 400 мкл буфера для промывания РНК. Отбросьте поток сквозь. Прокрутите пустую колонку на 1 минуту, чтобы полностью удалить буфер для мойки.
    3. Элюируйте РНК в 10 мкл тёплой воды без нуклеаз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все этапы центрифугирования при 10 000 - 16 000 g при RT в течение 30 секунд.

6. Обратная транскрипционная реакция с переключением шаблона

ПРИМЕЧАНИЕ: Зарождающиеся РНК из биотина (шаг 4.2) и фрагментированная мРНК после обработки PNK (шаг 5.3) подвергаются следующим этапам подготовки библиотеки (см. рисунок 1 и рисунок 2). Кратко говоря, будет подготовлен стартовый дуплекс с шаблоном РНК/праймером ДНК (адаптер R2 РНК/ДНК гетеродуплекс), на котором может происходить переключение шаблонов. Этот гетеродуплекс обеспечивает короткую комплементарную последовательность, которая позволяет переключить шаблон с помощью обратной транскриптазы (RT) для смены цепей, когда RT переходит из РНК в праймер ДНК, что обеспечивает бесшовный синтез cDNA из РНК в последовательность адаптера. Здесь используется обратная транскриптаза Induro, которая была протестирована и оптимизирована для этого протокола. Другие обратные транскриптазы с переключением шаблонов могут использоваться для подготовки библиотеки CoSTseq при необходимости, но они требуют оптимизации пользователем.

  1. Последовательности гетеродуплексных адаптеров ДНК/РНК
    ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК/РНК-гетеродуплексные адаптеры, используемые для обратной транскрипции образца DMS-MaPseq, совпадают с теми, что перечислены в Xu и др.7 и на которые ссылаются Schärfen и др. 10.
    1. Для гетеродуплексного адаптера ДНК/РНК, который будет использоваться для обратной транскрипции образца CoSTseq, используйте адаптер с буквой «G» в области выступа. Это позволит G захватить биотин-C на 3'-конце РНК. Если используется другой биотинилированный NTP, отредактировать праймер гетеродуплексной ДНК, чтобы в качестве навеса соответствующий нуклеотид пары (см. таблицу 2).
    2. Для адаптера DMS-MaPseq убедитесь, что есть один N-перевес, поскольку 3'-конец будет случайным после фрагментации. Для обзора следующих этапов подготовки библиотеки см. рисунок 2.
  2. Подготовка гибрида ДНК/РНК для переключения шаблонов: Подготовьте 1 мкм праймеров R2 РНК и R2R ДНК в буфере, состоящем из 10 мМ Tris-HCl, pH 7,5 и 1 мМ EDTA. Инкубировать смесь праймера при 82 °C в течение 2 минут, затем охладить до 25 °C со скоростью 0,1 °C/с. Смесь заморозьте и заморозьте для последующего использования.
  3. Обратная транскрипция с переключением шаблонов
    1. Добавьте следующие реагенты и инкубируете 30 минут при комнатной температуре: 2 мкл 5x реакционного буфера, 1 мкл 1 мкм ДНК/РНК гетеродуплекса (используйте гетеродуплекс с одним G перевесом для образца CoSTseq; используйте гетеродуплекс с случайным нависанием N для образца DMS-MaPseq), 0,5 мкл фермента, 0,5 мкл ингибитора РНазы, 3,75 мкл образца РНК (или добавьте воду для достижения общего объёма 7,75 мкл).
    2. Инкубировать эту смесь (без dNTP) в течение 30 минут при RT. Затем добавьте в реакцию 1,25 мкл 10 мМ дНТФ и примените следующие циклические условия в термоциклере: 25 °C на 10 минут, 42 °C 10 минут, 50 °C 10 минут, 55 °C 10 минут, 60 °C 30 минут, 65 °C 20 минут, 75 °C 15 минут.
    3. Добавьте 1 мкл РНазы H и инкубуйте при 37 °C в течение 20 минут. Очистить реакцию ПЦР с помощью метода очистки ДНК на основе столбцов для удаления оставшихся праймеров, нуклеотидов и ферментов. Элют в финальном томе объемом 20 мкл.

figure-protocol-1
Рисунок 2: Детальное схематическое представление подготовки библиотеки CoSTseq. Зарождающаяся РНК с биотинилированным 3'-концом инкубируется с помощью шаблонного коммутационного адаптера, содержащего G-перевес, комплементарный биотин-CTP. Для фрагментированной зрелой РНК (DMS-MaPseq) используется адаптер с N-перевесом (см. рисунок 1). Синтез кДНК проводится с помощью высокопроцессивной обратной транскриптазы, такой как термостабильная интронная обратная транскриптаза группы II (TGIRT), после чего проводится обработка РНазой H для разложения РНК-цепи. Впоследствии 5' App DNA/RNA лигаза связывает рибозно-аденилированный 5'-конец (rA pp) линкера N7 UMI с 3' OH одноцепочечной кДНК. Адаптер N7 UMI имеет заблокированный 3′-конец, предотвращающий самолигирование между адаптерами. Наконец, амплификация ПЦР проводится с помощью праймеров, включающих перекрывающиеся области и 5′-навесы с уникальными штрихкодами Illumina i5 и i7, присваиваемыми каждому образцу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

7. 5' Лигирование адаптера для подготовки окончательных библиотек cDNA для секвенирования меток с парными концами

  1. Подготовка адаптера на 5-конец
    1. Аденилировать 5'-конечный адаптер с помощью реакции на основе РНК-лигазы (например, Mth РНК-лигаза, указанной в Таблице материалов) со следующими компонентами реакции: 8 мкл 10x 5'-буфера реакции аденилирования ДНК, 8 мкл 1 мМ АТФ, 100 мкм R1R ДНК (это праймер TruSeq с уникальным молекулярным идентификатором или UMI), 8 мкл Mth РНК-лигазы, 52 мкл воды без нуклеаз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для подробностей, касающихся конструкцииадаптера N 7 UMI, см. таблицу 2 и рисунок 2.
    2. Инкубировать эту реакцию при 65 °C в течение 1 часа, затем при 85 °C в течение 5 минут. Очищайте продукт с помощью осадки EtOH или методом очистки ДНК на основе кремнеземной мембраны для выделения кДНК согласно инструкциям производителя.
    3. Для осадков с EtOH ДНК можно осаждать при -20 °C (минимум 20 минут) с использованием ацетата натрия (pH 5,2) при конечной концентрации 0,3 м и 2-2,5 раз с холодным EtOH 95%-100%. Центрифугуйте реакцию, вызванную EtOH, в течение 15 минут на максимальной скорости в предварительно охлажденной (4 °C) центрифуге, промыйте гранулу с 70% EtOH, повторно центрифугайте и высушите гранулы на воздухе. Повторно суспензировать (или элютировать, если использовать спин-колонку) гранулу в 40 мкл воды без нуклеаз. Храните при -20 °C длительное время.
  2. 5-футовое перестройка
    1. Для одного реакционного объёма 20 мкл добавьте следующие компоненты к 10 мкл кДНК: 2 мкл 10x NE Buffer 1, 2 мкл 50 мМMnCl 2, 2 мкл 5' AppDNA/RNA лигазы, 4 мкл 10 мкм (100 нг/мкл) аденилированного адаптера с шага 7.1.
    2. Инкубировать эту реакцию при 65 °C в течение 1 часа, затем 3 минуты при 90 °C. Очистите реакцию с помощью комплекта для очистки ПЦР minElute и элюируйте в итоговом объёме 20 мкл воды без нуклеаз.
  3. Минимальная ПЦР-амплификация библиотек cDNA с помощью пилотного теста
    1. Перед началом подготовьте запас индексных праймеров объемом 10 мкм с уникальными штрих-кодами. Каждый уникальный образец CoSTseq или DMS-MaPseq должен иметь уникальный штрихкод для плавного дальнейшего анализа. См. последовательности праймеров в Таблице 2. Прямой и обратный праймеры с штрихкодом могут быть объединены в смесь 1:1 и хранятся в виде штрих-кодирующего премикса.
    2. Используя 2 мкл продукта ПЦР с шага 7.2, добавьте 2,5 мкл высококачественного ПЦР-буфера (например, коммерческий HiFi-буфер), 0,375 мкл dNTP (10 мМ), 0,75 мкл предварительной смеси штрих-кодирования (или 0,375 мкл отдельных праймеров для штрих-кодирования i5 и i7), 0,25 мкл высококачественной ДНК-полимеразы для горячего запуска (например, коммерческий фермент HiFi для горячего запуска), 6,625 мкл воды без нуклеаз.
    3. Инкубировать эту реакцию при 95 °C и повторить [15 с 98 °C, 30 с 62 °C, 30 с 72 °C] в течение 23 циклов, завершая 1 минуту инкубации при 72 °C. Используйте гель агарозы 1%, чтобы определить оптимальное количество цикла.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для тестирования условий более низкого цикла образец можно подготовить в конце более низкого цикла (например, в конце 15 или 16 циклов) и провести на агарозном геле, чтобы сравнить интенсивность мазка библиотеки кДНК на агарозном геле по длине цикла.
  4. Итоговая ПЦР для усиления библиотеки
    1. Используя 18 мкл продукта ПЦР с шага 7.2, добавьте следующее из комплекта KAPA HiFi PCR Kit: 22,5 мкл высокоточного ПЦР-буфера, 3,375 мкл dNTP (10 мМ), 6,75 мкл предварительной смеси штрих-кодирования (или 3,375 мкл отдельных i5 и i7 уникальных праймеров), 2,25 мкл высокоточной ДНК-полимеразы горячего запуска и 59,625 мкл воды без нуклеаз.
    2. Инкубировать эту реакцию при 95 °C и повторить [15 с 98 °C, 30 с 62 °C, 30 с 72 °C] для количества циклов, определённых на этапе 7.3. Завершите инкубацию продолжительностью 1 минуту при 72 °C.
  5. Выбор размеров
    1. Выполните выбор размера на продукте ПЦР с помощью парамагнитной очистки на основе шариков (например, AMPure XP или эквивалент). Используйте в 1,3 раза больше объёма шариков (например, для реакции 50 мкл ПЦР используйте 65 мкл суспензии для шариков) и хорошо перемешайте до однородности. Дайте бусинам связать образец 10 минут при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение образца к шарикам 1:1,3x позволяет удалять димеры адаптеров праймера и гарантирует, что сохранившиеся фрагменты ДНК не меньше 150 п.п. и не превышают 800 п.п.
    2. Удалите супернатант, не трогая бусины, и промывайте бусины с 80% EtOH согласно протоколу производителя.
    3. Элюируйте готовый продукт за 11 мкл. Запустите 1 мкл на агарозном геле для проверки библиотек. Отправьте финальный продукт на секвенирование.

8. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Полный пакет CoSTseq и аналитический код доступны на GitHub (https://github.com/NeugebauerLab/CoSTseq), а рабочий процесс анализа показан на рисунке 3. Этот конвейер предназначен для обработки как данных секвенирования CoSTseq, так и DMS-MaPseq. CoSTseq использует Snakemake — биоинформатический рабочий процесс, который легко параллелизирует анализ, оптимизируя количество доступных ядерпроцессора 19. Рабочий процесс определяется Snakefile, который состоит из набора правил, определяющих анализы, которые будут выполняться. Нет необходимости менять Snakefile, который доступен после установки пакета GitHub.

  1. Настройте конфигурационный файл (.yaml) с правильными путями к тому, где хранятся сырые данные. В этих настройках должен быть путь к последовательностям адаптеров и соответствующие имена сэмплов. Измените конфигурационный файл, чтобы запускать конкретные анализы, определённые в Snakefile.
  2. Для начала анализа скачайте исходные парные конечные чтения в fastq.gz формате. Обработка чтений с помощью fastp20 для обрезания последовательностей адаптеров и фильтра качества для чтений с Phred-показателями не менее 20. Выровняйте эти считывания с эталонным геномом с помощьюSTAR 21 для генерации файлов BAM.
  3. В качестве дополнительного подтверждения визуализируйте BAM-файлы, сгенерированные после запуска конвейера анализа CoSTseq в браузере Integrated Genome Viewer (IGV). С помощью IGV файлы BAM должны быть легко интерпретируемы, чтобы показывать чтения по всем частям интересующих генов, что указывает на то, что риды представляют собой зарождающуюся РНК. Как и ожидалось, зрелые РНК-чтения должны демонстрировать минимальное покрытие в интронных областях, поскольку ожидается, что они будут получены из зрелых и, вероятно, эффективно склеенных транскриптов.
  4. Используйте результат fastp (.html-файл, который можно открыть в веб-браузере) для оценочного процента дублированных прочитаний. Обратите внимание, что чтения CoSTseq могут быть очень сильно дублированы, что подчёркивает критичность следующего шага.
  5. Используя UMICollapse22, дедупликация считываний для свершения с идентичными UMI и выравниваниями, что позволяет сохранять только уникальные чтения и снижает смещение ПЦР. Полученные файлы должны быть свободны от дублированных чтений и в формате BAM, где риды, выравнивающиеся с рРНК, будут отделены от тех, что связаны с не-рРНК-генами.
  6. Для последнего основного компонента модульного конвейера CoSTseq используйте собственную реализацию на Python для расчёта количества мутаций и покрытия чтения каждого нуклеотида. Функции, описывающие эту реализацию, можно найти в исходном коде на GitHub, а Snakefile подробно описывает вход, вывод, параметры и функции для генерации этих данных, хранящихся в формате .pkl.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Существует множество других анализов, которые можно провести с помощью конвейера анализа CoSTseq, хотя параметры могут потребовать оптимизации для персонализированного анализа. Ценным методом, адаптированным для CoSTseq, является HDProbe — R-пакет, позволяющий сравнивать частоты мутаций по всемугеному 10. Вкратце, HDProbe требует данных всех репликат и может методично классифицировать значительные различия в частоте мутаций по сравнению с контрольной моделью. Дополнительные типы анализов, которые можно провести для прохождения, включают предсказание структуры на основе экспериментальной реактивности DMS. Это можно выполнить с помощью пакета RNAstructure23.

figure-protocol-2
Рисунок 3: Шаги анализа и ожидаемые результаты модульного конвейера анализа CoSTseq. Шаги анализа, указывающие рекомендуемое использование существующих инструментов в дополнение к готовому конвейеру анализа CoSTseq с ожидаемыми выходными файлами и содержимым. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом разделе представлены фактические результаты, полученные при реализации рабочего процесса и анализа CoSTseq, как описано в данном протоколе. Во-первых, в этом разделе описываются ожидаемые результаты после оценки качества успешной подготовки библиотеки до и после секвенирования. Перед секвенированием исследователи могут использовать тестовое ПЦР и анализ TapeStation для подтверждения наличия РНК после обогащения биотином. Это указывает на успешное выделение зарождающейся РНК в ходе...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

РНК начинает складываться ко-транскрипционно благодаря более высокой кинетике спаривания оснований по сравнению со скоростьюсинтеза 24,25,26,27. Наши современные знания о зарождающемся сворачивании РНК основаны на мономолекулярных исследованиях прокариотических РНК, in vitro зондировании или методах in silico. В этом протоколе представлен подр...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают благодарность доктору SK Boopathy Jegathambal за программирование и сотрудников лаборатории Neugebauer, особенно P. Bech, за полезные обсуждения. Эта работа была поддержана Национальными институтами здоровья (R01GM112766 до KMN) и преддокторской стипендией Американской кардиологической ассоциации (908949 до LS). LPS поддерживался грантом NIH на обучение 5T32GM14943803. LRAB поддерживался постдокторской стипендией Американской кардиологической ассоциации (26POST1569544). Сбор данных в Центре геномного анализа Йельского университета был поддержан Национальным институтом общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под номером 1S10OD03036301A1. Эта работа полностью лежит в ответ на авторов и не обязательно отражает официальные взгляды NIH.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 мМ АТФИнвитроген18330019
10 мМ биотин-11-CTPJena biosciencesNU-831-BIOX
10mM GTPИнвитроген18332015
10mM UTPИнвитроген18333013
10X NEBuffer 1New England BiolabsB7001SИспользуется в шаге 7.2.1
Физиологический раствор с буфером 10 фосфатов (PBS)Gibco70011-044
20% SDSRPI L23100-500
Кислотный фенол: хлороформ и bbsp;АмбионAM9722
Бусины AMPure XP для выбора размераБекман Коултер A63880Используется для выбора размера на шаге 7.5.1
Бакто ПептонеGibco211677
Экстракт дрожжей бактоGibco212750
БицинСигма ОлдричB3876-100G
ХлороформСигма Олдрич319988
D-(+)-ГЛЮКОЗАСигма ОлдричG5767-500G
ДИФКО АГАРBD DIFCO214010
ДиметилсульфатСигма ОлдричD186309-5ML
Dynabeads и trade; MyOne Streptavidin C1 бусины Инвитроген65001Используется для вытяжения биотина в разделе 4.1
Dynabeads и trade; мРНК DIRECT&Trade; Набор для очисткиИнвитроген61011Используется для выбора Poly A в разделе 5.1
ЭДТА, pH 8, 0,5 мSigma Aldrich 03690-100ML
ЭтанолСигма ОлдричE7023-500ML
GlycoBlueИнвитрогенAM9516Ко-преципитант, используемый в шагах 4.2.7 и 5.2.4
Induro®   Обратная транскриптазаNew England BiolabsM0681SФермент RT, используемый в шаге 6.3.1
Изоамиловый спиртSigma Aldrich W205710-1KG-K
ИзопропанолJT-BAKER9084-05-01
KAPA HiFi HotStart PCR Kit   Рош07958889001Высококачественный ДНК Pol, используемый в 7.3.2 и 7.4.1 для ПЦР-реакций
Хлорид магнияСигма ОлдричSLCM2154
Комплект для очистки ПЦР MinEluteЦягэн28004Используется для очистки ДНК на шагах 6.3.3 и 7.2.2
Mth РНК-лигазаNew England BiolabsM2611A
Oligo Clean & КонцентраторZymo ResearchD4060Рекомендуется очистка ДНК Oligo на шаге 7.1.2
Ацетат калия Сигма Олдрич236497-500G
Хлорид калияДжей Ти Бейкер3040-01
Гидроксид калияAvantor6984-04-01
РНК Clean & Концентратор-5Zymo ResearchR1014Набор для очистки РНК, используемый в шаге 5.3.2 после обработки PNK
RNaseOUT™ Ингибитор рекомбинантной рибонуклеазыТермо Фишер Сайентифик10777019Ингибитор РНаз, используемый на этапе 5.3.1 во время лечения PNK
СаркозилIBI ScientificIB07080
Ацетат натрияКачество биологических характеристик351-035-721
Хлорид натрияСигма ОлдричS5150-1L
Гидроксид натрия и bbsp;Макрон7708-10
SUPERase и middot; In™ Ингибитор РНазы (20 U/μ L)Термо Фишер СайентификAM2696Ингибитор РНаз, используемый на шаге 6.3.1
Т4-полинуклеотидкиназаNew England BiolabsM0201S
Термостабильный 5' Приложенная ДНК/РНК-лигазаNew England BiolabsM0319L
Tris-HCl, pH 7,4, 1MThermo ScientificJ60202. K2
Triton X-100TEKNOVAT1105
TRIzol™ РеагентИнвитроген15596-026Для зарождающейся элюции РНК в разделе 4.2; также называется «РНК-реагент» в разделе 4
&бета;-меркаптоэтанолСигма ОлдричM6250-1L

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, J., Fei, Y., Sun, L. Advances and opportunities in RNA structure experimental determination and computational modeling. Nature Methods. 19 (10), 1193-1207 (2022).
  2. Bonilla, S. L., Jones, A. N., Incarnato, D. Structural and biophysical dissection of RNA conformational ensembles. Current Opinion in Structural Biology. 88, (2024).
  3. Bose, R., Saleem, I., Mustoe, A. M. Causes, functions, and therapeutic possibilities of RNA secondary structure ensembles and alternative states. Cell Chemical Biology. 31 (1), 17-35 (2024).
  4. Rapakko, J., Scaravilli, M., Änkö, M. L. Interplay between RNA-protein interactions and RNA structures in gene regulation. FEBS Open Bio. , (2025).
  5. Rodgers, M., Woodson, S. A. A roadmap for rRNA folding and assembly during transcription. Trends in biochemical sciences. 46 (11), 889-901 (2021).
  6. Tomezsko, P., Swaminathan, H., Rouskin, S. DMS-MaPseq for Genome-Wide or Targeted RNA Structure Probing In Vitro. Methods in Molecular Biology. 2254, 219-238 (2021).
  7. Xu, H., Douglas, C. W., Lambowitz, A. M. Improved TGIRT-seq methods for comprehensive transcriptome profiling with decreased adapter dimer formation and bias correction. Scientific Reports. 9 (1), (2019).
  8. Lopes, R., Agami, R., Korkmaz, G. GROseq, A Tool for Identification of Transcripts Regulating Gene Expression. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1543, 45-55 (2017).
  9. Mahat, D. B., et al. Base-Pair Resolution Genome-Wide Mapping Of Active RNA polymerases using Precision Nuclear Run-On (PROseq). Nature protocols. 11 (8), 1455-1476 (2016).
  10. Schärfen, L., Vock, I. W., Simon, M. D., Neugebauer, K. M. Rapid folding of nascent RNA regulates eukaryotic RNA biogenesis. Molecular Cell. 85 (8), 1561-1574 (2025).
  11. Hawley, D. K., Roeder, R. G. Functional steps in transcription initiation and reinitiation from the major late promoter in a HeLa nuclear extract. Journal of Biological Chemistry. 262 (8), 3452-3461 (1987).
  12. Hawley, D. K., Roeder, R. G. Separation and partial characterization of three functional steps in transcription initiation by human RNA polymerase II. Journal of Biological Chemistry. 260 (13), 8163-8172 (1985).
  13. Zubradt, M., et al. DMS-MaPseq for genome-wide or targeted RNA structure probing in vivo. Nature Methods. 14 (1), 75-82 (2017).
  14. Tijerina, P., Mohr, S., Russell, R. DMS foot-printing of structured RNAs and RNA-protein complexes. Nature Protocols. 2 (10), 2608-2623 (2007).
  15. Liebig, A., Waldsich, C. W. Probing RNA structure within living cells. Methods in enzymology. 468, 219-238 (2009).
  16. Pelechano, V., Chávez, S., Pérez-Ortín, J. E. A Complete Set of Nascent Transcription Rates for Yeast Genes. PLOS ONE. 5 (11), (2010).
  17. Wery, M., Descrimes, M., Thermes, C., Gautheret, D., Morillon, A. Zinc-mediated RNA fragmentation allows robust transcript reassembly upon whole transcriptome RNA-Seq. Methods. 63 (1), 25-31 (2013).
  18. Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme. The EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).
  19. Köster, J., Rahmann, S. Snakemake a scalable bioinformatics workflow engine. Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).
  20. Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. fastp: an ultrafast all-in-one FASTQ preprocessor. Bioinformatics (Oxford, England). 34 (17), i884-i890 (2018).
  21. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics (Oxford, England). 29 (1), 15-21 (2013).
  22. Liu, D. Algorithms for efficiently collapsing reads with Unique Molecular Identifiers. PeerJ. 7, (2019).
  23. Spasic, A., Assmann, S. M., Bevilacqua, P. C., Mathews, D. H. Modeling RNA secondary structure folding ensembles using SHAPE mapping data. Nucleic Acids Research. 46 (1), 314-323 (2018).
  24. Saldi, T., Fong, N., Bentley, D. L. Transcription elongation rate affects nascent histone pre-mRNA folding and 3′ end processing. Genes & Development. 32 (3-4), 297-308 (2018).
  25. Pan, T., Artsimovitch, I., Fang, X., Landick, R., Sosnick, T. R. Folding of a large ribozyme during transcription and the effect of the elongation factor NusA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (17), 9545-9550 (1999).
  26. Heilman-Miller, S. L., Woodson, S. A. Effect of transcription on folding of the Tetrahymena ribozyme. RNA. 9 (6), 722-733 (2003).
  27. Yu, A. M., et al. Computationally reconstructing co-transcriptional RNA folding from experimental data reveals rearrangement of nonnative folding intermediates. Molecular Cell. 81 (4), 870-883 (2021).
  28. Yu, G., et al. Genome-wide probing of eukaryotic nascent RNA structure elucidates cotranscriptional folding and its antimutagenic effect. Nature communications. 14 (1), (2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RNA Structure AnalysisNascent RNA FoldingMature RNA StructureSaccharomyces CerevisiaeCo Transcriptional Structure TrackingDMS ProbingRNA Polymerase PositionBiotinylated RNATemplate SwitchingRNA Secondary Structure

Related Articles