Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Новая модель крыс тяжелого тромбоза венозного синуса мозга, установленная в результате сочетания полу-лигации, железного хлорида и тромбина

330 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69961

⸱

13 февраля 2026 г.

 , 
1Department of Emergency, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, 2Department of Neurology, The People's Hospital of Qingxian

В этой статье

Краткое содержание

Новая модель тяжелого тромбоза венозного синуса мозга (CVST) у крыс, построенная путём полу-лигирования в сочетании с хлоридом железа и тромбином, может более эффективно имитировать патофизиологический механизм тяжёлого КВСТ у людей.

Аннотация

Тромбоз венозного синуса (CVST) — это отдельный тип инсульта, который преимущественно поражает молодых людей, особенно беременных женщин. Примерно у 60% пациентов с ЦВСТ развивается венозный инфаркт или кровоизлияние, которое определяется как тяжёлая форма CVST. В настоящее время различные методы применяются как внутри страны, так и за рубежом для индуцирования CVST у животных моделей. Однако эти модели не могут полностью воспроизвести патофизиологические механизмы, лежащие в основе тяжёлой CVST, что ограничивает фундаментальные исследования этого состояния. Новая модель тяжелой CVST у крыс может быть установлена с помощью полу-лигации в сочетании с железохлоридом и тромбином. Полу-лигация осуществлялась путём измерения кровотока в мозге (CBF) в интересующей области (ROI) до и после перевязки верхнего сагиттального синуса (SSS) с помощью перфузионного спекл-имиджера (PSI). Полулигация ССС вызывает стазис крови внутри венозной пазухи. Местное нанесение хлорида железа на поверхность ССС приводит к повреждению эндотелия, а прямое введение тромбина в пазух создаёт локализованное гиперкоагуляционное состояние. Этот подход эффективно имитирует три ключевых компонента формирования тромбоза: стазис, повреждение эндотелиума и гиперкоагуляцию. Полученная модель демонстрирует значительную тромботическую нагрузку, затрагивающую несколько венозных пазух одновременно. Индуцированный тромб остаётся стабильным не менее 1 недели. Окрашивание хлорида 2,3,5-трифенилтетразолия (TTC) демонстрирует, что эта модель стабильно может вызывать инфаркт венозного мозга на большой площади, который сохраняется до 7 дней. Эта модель может даже вызывать эпилептические приступы у крыс, чего предыдущие модели не могли достичь. Нарушение гематоэнцефалического барьера наблюдалось с помощью окрашивания цвета Эванса (EB). Таким образом, тяжелая модель CVST, созданная путём полу-лигирования в сочетании с введением хлорида железа и тромбина, более точно воспроизводит патофизиологическое прогрессирование тяжёлой CVST у людей, демонстрируя стабильность и надёжность.

Введение

Тромбоз венозного синуса мозга (CVST) — это отдельная форма цереброваскулярного заболевания, отличающаяся от артериального инсульта. Она встречается чаще у молодыхлюдей 1,2, особенно у беременныхженщин 3, и в последние годы её частота стабильно растёт. Эпидемиологическое исследование, проведённое в Австралии, показывает, что годовая заболеваемость CVST варьируется от 13,0 до 15,7 случаев на миллиончеловек 4. В Соединённых Штатах частота CVST демонстрирует растущую тенденцию с возрастом. Тем не менее, максимальный возраст начала у женщин ниже, чем умужчин 5. С 2021 по 2023 год 43 пациента, обратившихся в отделения неотложной помощи в США, были диагностированы сCVST 6. В клинических условиях наиболее часто наблюдаемой формой является множественный синусовый тромбоз, он составляет примерно 57,14% всех случаев. За этим следуют поражения верхнего сагиттального синуса (SSS; 16,19%), поперечного синуса (11,43%) и сигмовидного синуса (8,57%)4. Основные клинические проявления включают головную боль, которая может сопровождаться эпилепсией, нарушениями сознания и очаговыми неврологическими симптомами 7,8,9. Однако эти проявления не являются конкретными. Примерно у 60% пациентов с ЦВСТ развивается инфаркт или кровоизлияние в церебральных венах, классифицируемое как тяжёлоеCVST 10,11. Хотя лечение CVST включает антикоагулянтную терапию и хирургическое вмешательство, уровень смертности при тяжёлых КВСТ остаётся до 34,2%9. Эта высокая смертность может быть связана с тем, что лежащие в основе патофизиологические механизмы тяжёлой ЦВСТ ещё полностью не изучены. Соответствующая животная модель тяжелой CVST является необходимым экспериментальным инструментом для изучения его патогенеза, патофизиологического прогрессирования и потенциальных терапевтическихстратегий 12.

В настоящее время методы индуцирования животных моделей CVST обычно можно разделить на следующие типы: перманентнаялигация 13,14, химическая индукция 15,16,17, интервенционные подходы 18,19, имплантация самостоятельныхтрансплантатов 20,21,22 и биполярная электрокоагуляция23,24. Тромб, вызванный предыдущими животными моделями, имел короткую продолжительность действия и не мог одновременно вызвать множественные венозные синусовые тромбы и крупнозонный венозный церебральный инфаркт. Поэтому разработка серьёзной модели CVST, включающей одновременно несколько венозных пазух, стала приоритетом. Метод полу-лигации в сочетании с хлоридом железа и тромбином может создать новую модель тяжелой CVST у крыс. Кроме того, новая модель тяжелой CVST более точно моделирует человеческий патофизиологический процесс тяжёлого CVST через три ключевых аспекта: тромб венозного синуса, венозный церебральный инфаркт и нарушение гематоэнцефалического барьера. Эта модель применима к исследованиям патофизиологических механизмов и стратегий лечения тяжёлых КВСТ. Эта новая модель крыс может быть использована в будущем для изучения патофизиологического механизма тяжёлой ККВСТ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Экспериментальный протокол был утверждён Комитетом по экспериментам с животными и благополучию животных Капитального медицинского университета (AEEI-2020-119) в Пекине, Китай, и проводился в соответствии с правилами Комитета по уходу за животными и использованию учреждения.

1. Приготовление животных

  1. Случайным образом отнесите здоровых взрослых самцов крыс Sprague-Dawley (SD) со средней массой тела 300 ± 10 г либо в экспериментальную группу, либо к фиктивной операционной группе. Все животные содержались по чередующему 12-часовому циклу света и темноты с доступом к корму и воде ad libitum.

2. Применение PSI

  1. Используйте PSI для постоянного мониторинга изменений кровотока в мозге (CBF) внутри SSS крыс на протяжении всего процесса моделирования. Выберите фиксированную круговую область внутри SSS в качестве области интереса (ROI). Отслеживая изменения в КБФ ROI во время операции, можно определить завершение полу-лигации и успешность индукции тромба.

3. Установление модели крыс с тяжелым CVST

  1. Анестезируйте крыс с использованием 5% энфлурана, в газовой смеси, состоящей из 70% закиси азота и 30% кислорода, подаваемой через анестезиологическую маску. Поддерживайте концентрацию энфлурана в диапазоне 1%-2% на протяжении всей операции. Поместите анестезированных крыс в положение лежа с головами, прикреплёнными к средней линии с помощью стереотаксичной рамки. Поддерживайте температуру тела на уровне 37 ± 0,5 °C во время операции с помощью термостатической грелки.
  2. Сделайте продольный разрез длиной 1,5 см вдоль средней линии черепной области крысы. Вскрытие подкожной ткани, чтобы обнажить подлежащий череп.
  3. При микроскопической визуализации создайте продольное черепное окно (10 x 4 мм) между брегмой и лямбдой с помощью высокоскоростного стоматологического сверла. Обнажить SSS и двустороннюю кору головного мозга, сохраняя целостность твердой мозговой мозговой кости. Во время процесса черепного сверления охлаждайте сверло непрерывно с помощью обычного физиологического раствора, чтобы предотвратить термические повреждения твердой мозговой мозги и коры.
  4. После воздействия SSS оцените CBF ROI в SSS с помощью PSI и зафиксируйте соответствующие данные. Полу-лигирование SSS рострально и каудально с помощью 8-0 полиамидные швы под микроскопическим наблюдением.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При перевязке SSS сила должна быть умеренной и не чрезмерной. В противном случае нельзя достичь полу-лигационного эффекта. В идеале лигация должна выполняться в одну непрерывную процедуру. Повторные попытки связывания могут привести к перфорации SSS, что снижает успех изготовления модели.
  5. Используйте PSI для оценки CBF ROI, расположенного в лигированном сегменте SSS, подтвердив, что CBF снизился примерно до 50% от этого уровня до полуперевязки. Записывайте результаты систематически.
  6. В условиях защиты от света обмакните шелковую нить длиной 7 мм длиной 3-0 в 40% железохлорида и используйте ею, чтобы покрыть поверхность места перевязки SSS на протяжении 5 минут. После снятия шелковой нити промыйте поле обычным физиологическим раствором.
  7. Введите 0,1 мл раствора тромбина (500 U/mL) в полость перевязанного сегмента с помощью микроинжектора в течение 1 минуты. Повторили инъекцию ещё два раза подряд, чтобы получить общую дозу тромбина 150 U. Рефлюкс тромбина в эпидуральное пространство не привёл к плохому тромбозу.
    1. Чтобы облегчить введение тромбина в SSS, аккуратно согните иглу микроинжектора перед введением. Такая регулировка позволяет лучше контролировать угол иглы во время прокола и помогает предотвратить непреднамеренное проникновение через SSS.
  8. Переоцените CBF ROI с помощью PSI после инъекции тромбина. Убедитесь, что результаты подтверждают значительное снижение CBF по сравнению с тем, что было после полу-лигации, что указывает на успешную индукцию тромбоза. Систематически фиксируйте данные для дальнейшего анализа.
  9. Запечатайте костяное окно костным воском, затем наложите швы на разрез. После операции каждому крысу вводите кетопрофен (5 мг/кг) подкожно, чтобы облегчить послеоперационную боль.
  10. В группе фиктивных операций проводят только краниотомию без дополнительных хирургических вмешательств.

4. Тромбоз венозного синуса и инфаркт мозга

  1. Оцените нагрузку тромбоза венозного синуса в три периода: через 1, 2 и 7 дней после установления модели. Жертвуйте крыс и проводите сердечную перфузию с помощью обычного физиологического раствора в разные временные моменты.
  2. Проведите краниотомию для визуальной оценки степени воздействия тромбоза венозного синуса. Изолировать тромб и подвергнуть количественный анализ. Вырезать ткань мозга и разрезать её на корональные срезы толщиной 2 мм.
  3. Окуните ломтики в раствор TTC 2% и инкубуйте в водяной бане при температуре 37 °C в течение 20 минут, чтобы облегчить окрашивание. После этого визуально оцените инфаркт мозга и количественно оцените объём инфаркта с помощью программного обеспечения ImageJ для последующего статистического анализа.
    Объём инфаркта = площадь инфаркта в квадратных мм x толщине [2 мм]

5. Нарушение проницаемости гематоэнцефалического барьера (BBB)

  1. На второй день после операции случайным образом выбирают крыс как из модельной, так и из группы фиктивных операций и вводят внутривенную инъекцию 2% Evans blue (EB) через хвостовую вену.
  2. После 2 часов успешного введения инъекции эвтаназии крыс и перфузируйте фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) через левый желудочек. Изберите ткани мозга и разделите их на срезы толщиной 2 мм, чтобы оценить степень проникновения EB.

6. Статистический анализ

  1. Проводите статистический анализ с помощью программного обеспечения SPSS 17.0. Представляем данные измерения как среднее ± стандартное отклонение. Используйте односторонний анализ дисперсии (ANOVA) или независимый t-тест с выборками для сравнения групп.
  2. Для анализа непрерывных переменных, измеряемых в нескольких временных точках в одной группе, используйте повторные измерения ANOVA для оценки межгрупповых различий между временными точками. p-значение менее 0,05 считалось статистически значимым.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Процесс моделирования
Рисунок 1A изображает SSS крысы, обозначенную стрелкой. Ростральные и хвостовые части ССС были полулигированы (рисунок 1B), после чего наносилась нить, пропитанная хлоридом железа, на поверхность лигированных областей (рисунок 1C). Тромбин впоследствии вводили в перевязанные сегменты для индуцирования тромбоза. Область, отмеченная стрелкой, куда вводили тро...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Новая модель тяжелой CVST на крысах, построенная с помощью полу-лигации в сочетании с железным хлоридом и тромбином, не только имитирует стаз крови и повреждение эндотелия, но и гиперкоагуляционное состояние крови, то есть моделирует три элемента формированиятромбоза 25. Что ещё более захватывающе, так это то, что модель крыс, разработанная с использованием этого метода, способна проявлять эпилептические приступы. Эпилептические судороги являются заметным клиничес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим Институт критических заболеваний мозга при Медицинском университете Капитала за техническую поддержку. Это исследование было поддержано Пекинским фондом естественных наук (No7182064).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2,3,5-хлорид трифенилтетразолияСигма-Олдрич
40% хлорида железа Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Китай
Эванс синий Сигма-Олдрич
Грелка Гарвардский аппарат Холлистон, Массачусетс, США50-7061-F, 
Высокоскоростная стоматологическая дрель и bbsp;Саэшин, Пусан, Южная КореяStrong-207B
Лазерный точнометр;PeriCam PSI System, Швеция
МикроскопCarl Zeiss, Inc., Берлин, Германия
Полиамидный шов  Фабрика микроаппаратов Нинбо Чэнхэ, Китай
Стереотаксичная системаDavid Kopf Instruments, Туджунга, Калифорния, США
ТромбинChang Chun Lei Yunshang Pharmaceutical Co., Ltd., Китай

Ссылки

  1. Silvis, S. M., de Sousa, D. A., Ferro, J. M., Coutinho, J. M. Cerebral venous thrombosis. Nat Rev Neurol. 13 (9), 555-565 (2017).
  2. Ferro, J. M., Aguiar de Sousa, D. Cerebral venous thrombosis: an update. Curr Neurol Neurosci Rep. 19 (10), 74(2019).
  3. Kashkoush, A. I., et al. Cerebral venous sinus thrombosis in pregnancy and puerperium: A pooled, systematic review. J Clin Neurosci. 39 (5), 9-15 (2017).
  4. Devasagayam, R., Wyatt, B., Leyden, J., Kleinig, T. Cerebral venous sinus thrombosis Incidence Is Higher Than Previously Thought: A Retrospective Population-Based Study. Stroke. 47 (9), 2180-2182 (2016).
  5. Payne, A. B., et al. Epidemiology of cerebral venous sinus thrombosis and cerebral venous sinus thrombosis with thrombocytopenia in the United States, 2018 and 2019. Res Pract Thromb Haemost. 6 (2), e12682(2022).
  6. Ruderman, A., Hogan, A., Epley, C., Courtney, D. M., Milman, B. Epidemiology of Cerebral Venous Sinus Thrombosis: 2021-2023. Cureus. 17 (10), e93654(2025).
  7. Singh, R. J., Saini, J., Varadharajan, S., Kulkarni, G. B., Veerendrakumar, M. Headache in cerebral venous sinus thrombosis revisited: exploring the role of vascular congestion and cortical vein thrombosis. Cephalalgia. 38 (3), 503-510 (2018).
  8. Mahale, R., et al. Acute seizures in cerebral venous sinus thrombosis: what predicts it. Epilepsy Res. 123 (7), 1-5 (2016).
  9. Luo, Y., Tian, X., Wang, X. Diagnosis and treatment of cerebral venous thrombosis: a review. Front Aging Neurosci. 30 (1), 102(2018).
  10. Kowoll, C. M., et al. Severe cerebral venous and sinus thrombosis: Clinical course, imaging correlates, and prognosis. Neurocritical care. 25 (3), 392-399 (2016).
  11. Stam, J., Majoie, C. B. L. M., van Delden, O. M., van Lienden, K. P., Reekers, J. A. Endovascular thrombectomy and thrombolysis for severe cerebral sinus thrombosis: A prospective study. Stroke. 39 (5), 1487-1490 (2008).
  12. Yenigün, M., Jünemann, M., Gerriets, T., Stolz, E. Sinus thrombosis: do animal models really cover the clinical syndrome. Ann Transl Med. 3 (10), 138(2015).
  13. Frerichs, K. U., et al. Cerebral sinus and venous thrombosis in rats induces long-term deficits in brain function and morphology--evidence for a cytotoxic genesis. J Cereb Blood Flow Metab. 14 (2), 289-300 (1994).
  14. Li, G., et al. A new thrombosis model of the superior sagittal sinus involving cortical veins. World Neurosurg. 82 (1/2), 169-174 (2014).
  15. Röttger, C., et al. A new model of reversible sinus sagittalis superior thrombosis in the rat: magnetic resonance imaging changes. Neurosurgery. 57 (3), 573-580 (2005).
  16. Chen, C., et al. Photothrombosis combined with thrombin injection establishes a rat model of cerebral venous sinus thrombosis. Neuroscience. 306 (10), 39-49 (2015).
  17. Wei, Y., Deng, X., Sheng, G., Guo, X. B. A rabbit model of cerebral venous sinus thrombosis established by ferric chloride and thrombin injection. Neurosci Lett. 662 (1), 205-212 (2018).
  18. Wang, J., et al. A new model of reversible superior sagittal sinus thrombosis in rats. Brain Res. 1181 (11), 118-124 (2007).
  19. Wang, J., et al. Development of a new model of transvenous thrombosis in the pig superior sagittal sinus using thrombin injection and balloon occlusion. J Neuroradiol. 37 (2), 109-115 (2010).
  20. Yang, H., Meng, Z., Zhang, C., Zhang, P., Wang, Q. Establishing a new rat model of central venous sinus thrombosis and analyzing its pathophysiological and apoptotic changes. J Neurosci Methods. 203 (1), 130-135 (2012).
  21. Bourrienne, M. C., et al. A Novel Mouse Model for Cerebral Venous Sinus Thrombosis. Transl Stroke Res. 12 (6), 1055-1066 (2021).
  22. Mu, S., et al. A novel rat model for cerebral venous sinus thrombosis: verification of similarity to human disease via clinical analysis and experimental validation. J Transl Med. 20 (1), 174(2022).
  23. Sakaki, T., Kakizaki, T., Takeshima, T., Miyamoto, K., Tsujimoto, S. Importance of prevention of intravenous thrombosis and preservation of the venous collateral flow in bridging vein injury during surgery: an experimental study. Surg Neurol. 44 (2), 158-162 (1995).
  24. Cokluk, C., Aydin, K., Yemisci, M., Colakoglu, S., Kaplan, S. Cortical anastomotic veins occlusion in the rat including the assessment of cerebral swelling. J Neurosci Methods. 156 (1-2), 203-210 (2006).
  25. Kyrle, P. A., Eichinger, S. Deep vein thrombosis. Lancet. 365, 1163-1174 (2005).
  26. Lindgren, E., et al. Acute symptomatic seizures in cerebral venous thrombosis. Neurology. 95 (12), e1706-e1715 (2020).
  27. Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models. J Vis Exp. (115), e54479(2016).
  28. Rahal, J. P., Malek, A. M., Heilman, C. B. Toward a better model of cerebral venous sinus thrombosis. World Neurosurg. 82 (1-2), 50-53 (2014).
  29. Duan, J., et al. Identifying Biomarkers Associated with Venous Infarction in Acute/Subacute Cerebral Venous Thrombosis. Aging Dis. 12 (1), 93-101 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.