Криосекция синтетических биосовместимых имплантатов с использованием ультрафиолетовой смолы для усиленного анализа иммунофлуоресценции

Краткое содержание

В данной работе представлен протокол криосекции, использующий стабилизацию смолы с помощью ультрафиолета, чтобы сохранить целостность интерфейса имплантат-ткань при сохранении доступности антигена, что позволяет надёжно и высокоразрешительный иммунофлуоресцентный анализ синтетических полимерных имплантов.

Аннотация

Гистологическая оценка синтетических, биосовместимых имплантатов представляет собой значительные технические сложности из-за несовместимости традиционных методов обработки тканей и физико-химических свойств этих материалов. Современные методы, использующие полное вложение смолы, обеспечивают достаточное структурное сохранение, но серьёзно снижают доступность эпитопа, что ограничивает иммуногистохимические применения, необходимые для характеристики иммунного ответа хозяина. В то же время традиционное внедрение парафина демонстрирует плохую адгезию к синтетическим субстратам и ограничивает отбор антител для комплексного иммунологического профилирования. Стандартные протоколы криосекции повышают иммуногистохимическую совместимость, улучшая сохранение антигенов; однако эти методы часто приводят к недостаточной структурной целостности образцов, содержащих импланты, что снижает качество морфологической оценки и сечения. Для устранения этих ограничений был разработан новый протокол обработки, включающий ультрафиолетируемую смолу для селективной стабилизации конструкций имплантат-ткани перед криосецированием. Эта методология использует фотополимеризуемую смолу для механической поддержки при сохранении доступности эпитопов и антигенных детерминантов, которые обычно нарушаются полной полимеризацией смолы. Протокол позволяет воспроизводимо получать высококачественные срезы оптимальной толщины для оценки иммунофлуоресценции, обеспечивая лучшую структурную сохраненность по сравнению со стандартным замороженным сечением без обширного перекрёстного сшивания, ограничивающего проникновение антител в традиционных образцах, встроенных в смолу. Этот подход представляет собой практичное и экономичное решение для гистологической обработки синтетических имплантов, предоставляя расширенные аналитические возможности для оценки биосовместимости и облегчая детальную характеристику локальных иммунных ответов на интерфейсе имплантат-ткань.

Введение

Иммунофлуоресцентная микроскопия — это важный аналитический метод в исследованиях регенеративной медицины, облегчающий визуализацию структуры тканей и клеточный состав с помощью фторо-конъюгированных антител. Эта методология объединяет молекулярную специфику иммунохимического распознавания с чувствительностью и универсальностью флуоресцентного обнаружения, что позволяет детально наблюдать распределение клеточных мишеней в микроокружении тканей. Подходы к иммунофлуоресценции охватывают как прямые, так и косвенные стратегии маркировки, при этом протоколы косвенной иммунофлуоресценции обеспечивают усиленное усиление сигнала с помощью вторичных антител, конъюгированных с различными флуорофорами, охватывающими видимый и ближний инфракрасный^{спектр 1}. Врождённая способность методологии одновременно обнаруживать многоцелевые объекты через спектральное разделение способствует всесторонней фенотипической характеристике гетерогенных клеточных популяций и их пространственных связей в сложных тканевых^{микросредах. 2}.

Технические возможности иммунофлуоресцентной микроскопии выходят за рамки традиционной локализации белков и охватывают количественные аналитические приложения, включая измерения интенсивности флуоресценции, колокализацию и оценку пространственного распределения, критически важные для понимания функции клеток и организации^{тканей 3}. В контексте исследований биосовместимости имплантатов анализ иммунофлуоресценции даёт важные данные о иммунных ответах хозяина, включая реакции чужеродных тел, воспалительные каскады и процессы интеграции тканей, определяющие принятие или отторжение имплантата на клеточном и молекулярном^{уровнях 4}.

Успешная реализация протоколов иммунофлуоресценции требует тщательного рассмотрения методологий обработки тканей, которые сохраняют морфологическую целостность, сохраняя при этом флуоресцентный сигнал и минимизируя фоновую автофлуоресценцию. Традиционный выбор среды вложения зависит от типа ткани, аналитических потребностей и специфических интересующих антигенов. Для синтетических материалов и имплантатов современная литература в первую очередь рекомендует полное встраивание смолы для поддержания структурной устойчивости во время процедур^{сечения 5}. Однако такой подход представляет собой значительные ограничения из-за необходимости специализированных ультрамикротомов и лопастей для сечения полимеризированных блоков смолы, что представляет собой значительные инвестиции в оборудование и техническую экспертизу. Вложение парафина, обеспечивая адекватную структурную поддержку для секционирования, вносит конформационные изменения в антигенные детерминанты во время фиксации и обработки через обширное обезвоживание, химическое затвердевание и инфильтрацию органическими растворителями, способными денатурировать белки и маскировать эпитопы. Обработка парафина также вызывает внутренние автофлуоресцентные помехи, которые нарушают обнаружение сигналов и количественный анализ. Эти изменения требуют проведения процедур извлечения антигена, обычно включающих тепло-индуцированную эпитопную забор (HIER) или протеолитически индуцированную эпитопную экспанцию (PIER), чтобы восстановить доступность^{антител 6}. Несмотря на эти меры, многочисленные коммерчески доступные антитела остаются несовместимыми с образцами, вложёнными в парафин, а суровые условия забора могут дополнительно ухудшить качество флуоресцентного сигнала и привести к появлению фотоотбелительных артефактов.

Криосекция предлагает альтернативную методологию обработки для иммунофлуоресцентных приложений. Для подготовки тканей можно использовать два метода криоконсервации. Первый подход включает быстрое криоконсервирование путём прямого погружения свежих образцов тканей в изопентановую ванну, предварительно охлаждённую жидким азотом, для достижения температуры ниже –20 °C, затем секционирование с использованием криостатных микротомов с регулируемой температурой камерами для резки. Второй протокол включает короткий период фиксации в параформальдегиде (PFA) или формалине, за которым следует криозащита с помощью градуированной инфильтрации сахарозы перед замораживанием. Процесс криоконсервации создаёт жёсткий матрикс, который сохраняет целостность ткани, сохраняя при этом нативные белковые конформации, необходимые для распознавания антител. Замороженное сечение сохраняет ткани в почти естественном состоянии с минимальными химическими^{изменениями 7}, тем самым снижая необходимость в жёстких процедурах извлечения антигена и позволяя использовать более широкий спектр первичных антител, включая те, несовместимые с парафиновыми тканями из-за маскировки или денатурации эпитопов⁸.

Процесс криосекции обычно использует соединение с оптимальной температурой резки (OCT) — водорастворимую среду для вложения, состоящую из поливинил-спирта и полиэтиленгликола, которая обеспечивает структурную поддержку при сечении, оставаясь при этом прозрачной и совместимой с системами обнаружения флуоресценции. Вложение ОКТ способствует образованию тонких, однородных срезов толщиной от 5 до 15 мкм, в зависимости от конкретных аналитических требований и характеристик^{ткани 9}. Сохранение нативных белковых конформаций в замороженных сечениях обеспечивает оптимальное соотношение сигнал/шум, необходимое для количественного анализа иммунофлуоресценции, а также сохраняет целые эпитопы, позволяющие использовать более широкий спектр первичных антител, включая те, несовместимые с парафино-вложёнными^{тканями 8}.

Однако секционирование замороженных тканей представляет собой уникальные технические сложности, особенно при обработке синтетических имплантатных материалов, обладающих отличительными физико-химическими свойствами по сравнению с нативными биологическими тканями. Дифференциальное тепловое расширение между синтетическими полимерами и интерфейсами биологических тканей во время замораживания может привести к локальному механическому напряжению, что нарушает целостность конструкции и создаёт артефакты^{сечения 10}. Кроме того, присущая жёсткость многих синтетических материалов по сравнению с замороженными биологическими тканями может вызывать отклонение лезвий при разрезе, что приводит к неравномерной толщине сечения и повреждению как образца, так и режущего оборудования. Эти технические ограничения требуют специализированных протоколов обработки, способных учитывать уникальные требования образцов с имплантатами, сохраняя при этом преимущества замороженного сечения для иммунофлуоресцентных применений.

Для устранения этих ограничений в исследовании был разработан протокол криосекции, сочетающий селективную стабилизацию смолы, подвергаемой ультрафиолету, с контролируемыми параметрами секции криостата, что позволяет проводить высокоразрешительный, многопараметрический иммунофлуоресцентный анализ конструкций имплантатных тканей.

Протокол

Это исследование было проведено в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу и использованию животных клиники Майо (IACUC) под номером одобрения A00003765-18-24. Все процедуры с синтетическими биосовместимыми имплантатами проводились в стерильных условиях в соответствии с соответствующими протоколами биобезопасности.

1. Обработка образцов и криозащита

ПРИМЕЧАНИЕ: Обращайтесь с формалином исключительно в капюшоне с химическим паром и носите соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), поскольку формалин содержит формальдегид — мощный раздражитель, сенсибилизатор и канцероген.

1. Зафиксировать интегрированные с тканями биосовместимые синтетические имплантаты в 10% нейтральном буферном формалине за ночь при 4°C с использованием минимум 10 объёмов фиксативного вещества относительно объёма ткани для обеспечения полного погружения и достаточного проникновения. Цель этого ограниченного периода фиксации — достичь минимального перекрёстного сшивания при сохранении морфологии тканей. (См. таблицу материалов для материалов, используемых в протоколе.)
2. Переместить образцы в раствор сахарозы 15%, приготовленный в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) для ночной инкубации при 4°C с мягким перемешиванием. Обеспечьте полную инфильтрацию сахарозы, что подтверждается погружением тканей.
3. Переместить образцы в раствор сахарозы 30% в PBS для второй ночной инкубации при 4°C. Подтвердить полное уравновесие путём опускания ткани на дно контейнера, что указывает на адекватную инфильтрацию сахарозы и смещение воды.
4. Приготовьте объёмное соотношение 1:1 из 30% сахарозного раствора и ОКТ-соединения. Инкубировать образцы в этой переходной среде в течение 2 часов при 4°C, затем перенести на 100% OCT на 1 час для полного уравновесия, что подтверждается равномерно непрозрачным видом ткани.
5. Аккуратно размещайте образцы в стандартных криомолдах, заполненных свежей смесью OCT, обеспечивая оптимальную ориентацию для плоскостей сечения. Ориентируйтесь с помощью интерфейса имплантат-ткань, доступного для последующих процедур. Устраняйте воздушные пузырьки с помощью предварительно охлаждённых щипцов.
6. Разместите заполненные криоформы непосредственно на сухой ледяной платформе, чтобы создать температурный градиент, способствующий быстрому образованию кристаллов льда снизу вверх. Наблюдать за ним 10–15 минут до полного затвердевания, что подтверждается характерным непрозрачным белым видом замороженного соединения ОКТ. Переместить замороженные блоки в хранилище при –80°C или непосредственно в камеру криостата для немедленного сечения.

2. Установка криостата и начальное сечение

1. Поддерживайте камеру криостата с контролируемой температурой при –15°C. Проверьте температуру с помощью интегрированного цифрового мониторинга и уравновесьте её ночью перед введением образцов.
2. Установите новые одноразовые лезвия. Настройте угол лопастей для комбинированного разделения синтетико-биологических материалов в соответствии с спецификациями производителя.
3. Желаемая толщина сечения (50–100 мкм) запрограммируется в криостате путём выбора настройки Thickness на панели управления, регулировки с помощью стрелок и подтверждения параметра нажатием клавиши Set .
4. Продвигайтесь по встроенному образцу, чтобы достичь заранее определённой глубины, соответствующей интерфейсу имплантат-ткань. Мониторинг поверхности продвигающегося сечения для определения оптимальной плоскости для нанесения УФ-смолы, характеризующейся незначительными изменениями непрозрачности тканей и начальной экспозиции по периферии импланта, а глубина подтверждается, если эти признаки остаются стабильно видимыми на последующих обрезных участках.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленно прекращайте секционирование при достижении критического интерфейса, чтобы предотвратить продвижение за пределы целевой области.

3. Применение УФ-отверждаемой смолы

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте смолу, которую можно отвергнуть ультрафиолет, в хорошо проветриваемом помещении, при этом надевая соответствующие средства индивидуальной защиты, и защищайте глаза и кожу от светодиодного ультрафиолетового света. Эти смолы содержат раздражители, которые могут вызывать реакции кожи и глаз, а воздействие светодиодов и ультрафиолета может привести к повреждению глаз, вызванных УФ-излучением.

1. Разрезать парапленку ножницами до размеров 2–3 мм, превышающих периметр импланта. Аккуратно отдельте от защитной бумажной подложки стерильными щипцами.
2. Нанесите 5–10 мкл УФ-отверждаемой смолы на поверхность экспонированной парапленки (рисунок 1A). Объём смолы оптимизируется за счёт проведения предварительных испытаний, при которых подаются дополнительные объемы, а результирующий разброс визуально оценивается для обеспечения равномерного покрытия поверхности образца без переполнения или чрезмерного накопления смолы, что могло бы затруднить секционирование.
3. Немедленно замените защитную бумажную подложку на парапленку с заполненной смолой. Примените полиуретановый ролик для шва (2 дюйма) с постоянным давлением при перекрывающихся параллельных проходах, затем перпендикулярные проходы для получения тонкого, равномерного слоя смолы (рисунок 1B).
4. Аккуратно снимите защитный слой бумаги, обнажая равномерно распределённую смоляную плёнку. Разместить смоляную парапленку непосредственно поверх открытой поверхности имплантата, обеспечивая точное выравнивание с интерфейсом имплантат-ткань (рисунок 1C).
5. Примените полиуретановый ролик для шва от центра импланта наружу, чтобы устранить пузырьки воздуха и обеспечить тесный контакт между смолой и синтетическими и биологическими поверхностями (рисунок 1D).
6. Позиция УФ-светодиодного источника с длиной волны 405 нм на расстоянии 2–3 см непосредственно у поверхности импланта. Экспонировать в течение 90 секунд для обеспечения полной полимеризации, проверяемой тактильной оценкой твёрдости смолы и нелипких характеристик (рисунок 1E). Перед фотополимеризацией наместите УФ-защитное покрытие на окно камеры криостата, чтобы защитить оператора от вредного воздействия УФ-излучения во время процедуры отверждения смолы.

4. Восстановление сечения и подготовка затвора

1. Удалять парапленку одним непрерывным движением, чтобы предотвратить механическое нарушение интерфейса смолы и ткани. Полное прикрепление смолы подтверждается осмотром открытой поверхности под криостатным освещением на наличие равномерного покрытия смолы, отсутствия подъёма по краю ткани и отсутствия видимого парапленкового остатка.
2. Разрезать образцы с заранее заданной толщиной 8 мкм с использованием калиброванного механизма продвижения микротома. Следите за каждой секцией на предмет постоянной толщины и отсутствия артефактов (сжатие, разрывы, неполная разрезка). Оптимально разместите стабилизатор, чтобы предотвратить скручивание (рисунок 1F).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гидрофильные положительно заряженные клеевые стеклянные стекли используются так как обеспечивают лучшее удержание сложных образцов, улучшая сцепление при переносе сечений и последующей обработке. Этикетки скользят отдельно перед передачей раздела.
3. Разместите поверхность клея затвора, обеспечив первоначальный контакт на краю сечения перед постепенным контактом по всей площади. Убедитесь, что поверхность смолы, отвергнутая УФ, прилипает к стеклу, при этом поддерживая поверхность ткани вверх для иммунофлуоресценции (рисунок 1G).
4. Аккуратно нажмите на секционный затвор, чтобы убрать пузырьки воздуха. Проверьте правильную ориентацию под криостатным освещением, подтверждая целосную границу имплантата и ткани.

5. Хранение и сохранение

1. Помещайте готовые слайды в заранее маркированные ящики для хранения при -20°C для приложений, требующих обработки в течение 72 часов.
2. Используйте при условиях 80°C для периодов хранения, превышающие одну неделю.

6. Протокол окрашивания иммунофлуоресценцией

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пепсин с соответствующей СИЗ, так как это раздражитель кожи и дыхательных дыхателей.

1. Достать стекли из хранилища и перенести в камеры влажности на 15–20 минут для уравновешения комнатной температуры.
2. Проведите три последовательных цикла мытья PBS по 2 минуты.
3. Извлечение антигенов:
   1. Метод теплового извлечения эпитопов (HIER): Горизонтальное размещение слайдов в микроволновых контейнерах с 1x раствором для получения цели. Микроволновка (выходная мощность 1000 ватт) на высокой мощности в течение 15 минут, затем охлаждение до комнатной температуры.
   2. Метод извлечения эпитопов с протеолитической индуцированностью (PIER): наносить 100–150 мкл готового раствора пепсина на секцию. Накройте временными пластиковыми накладками и инкубуйте при 37°C в течение 10 минут в увлажнённой камере.
4. Проведите три последовательных цикла мытья PBS (по 2 минуты каждый).
5. Примените 1 мл блокирующего раствора с 0,1% сапонина и 2,5% нормальной козьей сыворотки в PBS. Инкубировать 30 минут при комнатной температуре в увлажнённой камере.
6. Проведите три последовательных цикла мытья PBS (по 2 минуты каждый).
7. Нанести 100 мкл первичных антител в оптимальных концентрациях:
   1. Анти-коллаген IV кролик поликлональ при разбавлении 1:100.
   2. Анти-ламининовый кролик поликлональ при разбавлении 1:500.
   3. Анти-F4/80 моноклональное антитело кролика при разбажении 1:500.
8. Накройте временными пластиковыми накладками и инкубуйте ночью при 4°C в увлажнённых камерах.
9. Проведите три цикла стирки PBS (по 2 минуты каждый).
10. Применяйте вторичные антитела при концентрации 10 мкг/мл.
    1. IgG Alexa Fluor Plus 555 против ослов против кроликов
    2. Goat Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488
11. Инкубировать 60 минут при комнатной температуре в тёмных условиях.
12. Опциональное окрашивание агглютинина зародышей пшеницы (WGA):
    1. Нанесите WGA-Alexa Fluor 647 при 5 мкг/мл в PBS с 2,5% обычной козьей сывороткой.
    2. Накрывайте и инкубуйте при 37°C в течение 30 минут. Проведите три последовательных цикла стирки PBS по 2 минуты.
13. Наносите 80 мкл крепкий крепящий материал с ядерной контрморилкой на секцию.
14. Накройте стекло для покрытия, чтобы устранить пузырьки воздуха.
15. Дайте слайдам затвердеть горизонтально при комнатной температуре в течение 2 часов в темноте.
16. Храните при 4°C до одной недели для оптимального качества изображения.

7. Флуоресцентная микроскопия и получение изображений

1. Проводите визуализацию с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа с фильтрами производителя: возбуждение/излучение 360/460 нм, возбуждение/излучение 470/525 нм, возбуждение/излучение 545/605 нм, возбуждение/излучение 620/700 нм.
2. Изображения получаются путём выбора каждого флуоресцентного канала в меню фильтра микроскопического программного обеспечения. Перед оптимизацией экспозиции выполняется процедура чёрного баланса путём выбора Adjust Black Balance для обеспечения точной коррекции базовой линии для каждого канала. Параметры экспозиции оптимизируются путём открытия окна захвата изображения , включения режима Live и регулировки режима экспозиции и интенсивности света до достижения высокого отношения сигнал/шум без насыщения пикселей. Насыщение контролируется с помощью гистограммного дисплея и инструмента Highlight Saturated Pixels . Каждый канал регулируется независимо перед получением изображения.
3. Выполните автоматический сбор плиток с 10% перекрытием производителем между соседними полями. Поддерживайте автоматическую корректировку фокуса на протяжении всей последовательности захвата.

Результаты

Оценка и оптимизация качества секций
После стабилизации ультрафиолетовой смолы и сечения толщиной 8 мкм собрать секции на клеевые стекли и оценить контроль качества. Высококачественные срезы демонстрируют целостную морфологию без значительных трещин и артефактов трещин, с непрерывной тканевой архитектурой и сохранившейся интерфейсной интерфейсом имплантат-ткань (рисунок 2A). Срезы с существенными структурными повреждениями, включая разрыв...

Обсуждение

Этот метод стабилизации смолы с ультрафиолетом предоставляет альтернативный подход к криосецированию образцов тканей, встроенных в ОКТ, содержащих синтетические материалы, которые в противном случае трудно обработать с помощью стандартных методов замороженных секционов. Хотя существует множество вариантов клея, таких как заряженные слайды, ленты для сцепления тканей и другие крепкие опоры, которые помогают предотвратить отслоение срезов ткани или хрупких образцов при обработке, эти проду...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
5W Gooseneck Ultraviolet Light 395– 405 нм для отверждения смолы	Amazon	UPC и LRM; 603335835561
Антитела — Anti-F4/80 (моноклональные)	Abcam	AB300421	1:500
Антитела — коллаген IV (поликлональный)	Abcam	ab6586	1:100
Антитела — Donkey Anti-Rabbit IgG AlexaFluor Plus 555	Инвитроген	A32794	10 мкг/мл
Антитела — козла против кроликов IgG AlexaFluor 488	Инвитроген	A-11008	10 мкг/мл
Антитело — ламинин (поликлональный)	Инвитроген	PA1-16730	1:500
BioMed Clear	Formlabs	FLBMCL01	Биосовместимый материал #1
BioMed Durable	Formlabs	FLBMDU01	Биосовместимый материал #2
Буферизованный 10% формалин	Кардинал Хелс	C4320-101
Фильтр BZ-X Cy5	Кейенс	OP-87766	Набор фильтров
BZ-X фильтр DAPI	Кейенс	OP-87762	Набор фильтров
BZ-X фильтр GFP	Кейенс	OP-87763	Набор фильтров
BZ-X фильтр TRITC	Кейенс	OP-87764	Набор фильтров
Программное обеспечение для анализатора BZ-X800	Кейенс	BZ-X800	Интегрированное программное обеспечение
Фишербренд Премиум Coverglass  50 x 24 мм	Fisher Scientific	12-544-14
3D-принтер Form4B	FormLabs	F4B-принтер
Смоляный резервуар Form4	Formlabs	RT-F4-01
Козья сыворотка	Gibco	16210064
HM525 NX Cryostat	Эпредия	956641EC
Бытовая микроволновая печь	Panasonic	NN-S766BA	Выходная мощность 1000 ватт
Пластиковые накладки IHC-Tek размером 24 мм x 60 мм	IHC World	IW-2601	Временное покрытие
JDiction УФ-смола с низкой вязкостью	Amazon	6974143904430	Высокая автофлуоресценция
Keyence BZ-X800	Кейенс	BZ-X800
Давайте смола UV Resin Clear Hard Type	Amazon	ALR00038	Высокая автофлуоресценция
Давайте используем прозрачную УФ-смолу с высокой вязкостью	Amazon	ALR00048
Микрослайдные стеклянные стекла Matsunami MAS	Снабжение новичков	SUMAS1190	Клейкий затвор
Хирургический имплант Medpor	Stryker	8662	Биосовместимый материал #3
Mr. Resin UV Resin Crystal Clear	Amazon	B08FRF9QTB	Высокая автофлуоресценция
MX35 Ultra Microtome Blade	Эпредия	3053835
Лабораторная плёнка Parafilm M	Парафильм	P7543-1EA
Пепсин	Sigma	R2283-15ML
pH солёного раствора с буфером фосфатов 7,4	Sigma	P3813
План Апо и лямбда; 40X	Кейенс	BZ-PA40	Объективная линза
План Апо и лямбда; 4X	Кейенс	BZ-PA04	Объективная линза
Полиуретановый ролик для шва	Amazon	682698799567
Крепление ProLong Glass Antifade с морилкой NucBlue	Инвитроген	P36985	Hoechst 33342 Контроцветка
Сапонины	Миллипор	558255-100GM
StainTray	Симпорт	M920-2
Стерильное силиконовое покрытие	Bentec	PR72034-51N
Раствор для поиска мишеней, цитрат pH6	Agilent	S236984-2
Компаунд Tissue-Tek O.C.T	Сакура	4583
Агглютинин из зародышей пшеницы AlexaFluor 647	Инвитроген	W32466	5 мкг/мл