Методическая статья

Трёхмерная визуализация лимфатических сосудов в коже человека и их структурных изменений во время лимфедемы

DOI:

10.3791/69972

⸱

13 февраля 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1MIRAI Technology Institute, Shiseido Co., Ltd., 2Department of Plastic, Reconstructive, and Aesthetic Surgery, Chiba University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь была достигнута трёхмерная визуализация структуры лимфатических сосудов в коже человека с помощью конфокальной или светлолистной микроскопии после применения трёх различных методов очищения тканей. Сочетание этих методов с иммуногистохимическим окрашиванием даёт представление о функциональных изменениях лимфатических сосудов в ходе прогрессирования лимфедемы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лимфатические сосуды кожи, включающие капилляры и собирающие сосуды, играют ключевую роль в удалении отходов и иммунных реакциях, а также необходимы для поддержания гомеостаза тканей. Однако человеческая кожа с тремя слоями — эпидермисом, дермисом и подкожным жиром — содержит плотный внеклеточный матрикс, богатый коллагеном, поэтому визуализировать лимфатические сети в трёх измерениях сложно. Для устранения этого ограничения в статье представлены три различных метода, каждый из которых адаптирован к конкретным молекулам интереса и экспериментальным целям, для трёхмерной визуализации лимфатических кожных организмов человека с использованием реагентов для очищения тканей в сочетании с конфокальной или светлолистной микроскопией. Путём нацеливания на молекулы соединения адгеренов в лимфатических эндотелиальных клетках с помощью иммуногистохимии были оценены структурные изменения с явными функциональными последствиями, особенно характерное ремоделирование капилляров, похожих на кнопку на молнию, в кожных тканях, полученных у пациентов с вторичной лимфедемой. Эта трёхмерная визуализация позволяет выявить сосудистые структуры, которые невозможно выявить при традиционном гистологическом анализе срезов тканей, тем самым расширяя понимание структуры и функции лимфатических сосудов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С момента признания их роли в поддержании гомеостаза кожи растёт интерес к функции лимфатических сосудов, помимо хорошо установленного участия в метастазахрака 1,2. Лимфатические сосуды структурно делятся на капилляры и собирательные сосуды, каждый из которых обладает уникальными характеристиками. Лимфатические капилляры состоят из однослойной структуры, образованной лимфатическими эндотелиальными клетками, и служат начальными местами сбора интерстициальной жидкости, отходов и иммунных клеток. В отличие от этого, собирающие лимфатические сосуды имеют двухслойную структуру с гладкомышечными клетками, окружающими лимфатический эндотелиальный слой, что позволяет активному транспортировать лимфатическую жидкость, собранную капиллярной сетью, к центральномукровообращению 3. Модели мышей использовались для выяснения структурных особенностей, особенно бронхиальных лимфатических сосудов, и показали, как воспалительные состояния вызывают структурноеремоделирование 4. Предыдущие исследования показали, что воспаление, вызванное ультрафиолетом, вызывает аномальное расширение лимфатических капилляров, что нарушает их функцию сбора жидкости. Были выявлены молекулярные механизмы, лежащие в основе этой дисфункции, в частности, что повышение экспрессии VEGF-A в сочетании со снижением экспрессии VEGF-C приводит к этим структурным изменениям 5,6,7.

Хотя трёхмерные методы визуализации значительно продвинули понимание лимфатической сети в мышиныхмоделях 8,9, сопоставимый структурный анализ лимфатических сосудов человека остаётся сложным. Этот аналитический разрыв возникает из-за трудностей работы с человеческими тканями, включая ограниченную доступность образцов и технические трудности, связанные с достижением комплексной трёхмерной визуализации. В частности, кожа, характеризующаяся трёхслойной структурой, включающей эпидермис, дерму и подкожный жир, и функционирующая как барьер для внешней среды, представляет собой более серьёзные трудности, чем другие мягкие органы. Кроме того, человеческая кожа представляет собой серьёзные аналитические сложности по сравнению с мышиными моделями, включая большую толщину ткани, что затрудняет глубокое проникновение при визуализации. Кроме того, многочисленные компоненты внеклеточного матрикса, особенно коллаген, вместе с возрастными структурными изменениями создают оптические барьеры, снижающие эффективность новых методов очищения тканей, которые произвели революцию в лимфатической визуализации умышей 10.

Ранее были протестированы различные вещества для очищения тканей для визуализации капилляров кожи человека, демонстрируя их совместимость стканями 11. После этой работы реагенты для очищения тканей были успешно использованы для визуализации лимфатических сосудов кожи человека в трёхизмерениях 12. Сосредоточившись на соединениях адгеренов лимфатических эндотелиальных клеток, были выявлены структурные изменения лимфатических сосудов, связанные с прогрессированиемлимфедемы 13. Цель этой статьи — подробно описать процедуры трёхмерной визуализации лимфатических сосудов кожи человека с использованием комбинаций трёх методов очищения кожи, а также конфокальной микроскопии и микроскопии с лёгковыми листами, а также иммуногистохимического окрашивания, адаптированного к конкретным целям исследований. В этом исследовании, хотя мы сосредотачиваемся исключительно на свежих человеческих кожных тканях, которые были фиксированы в день удаления и не прошли циклы замораживания-оттаивания, эти методы дают представление не только о структурных изменениях лимфатических сосудов во время болезни и старения, но и о связанных с ними функциональных изменениях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Образцы кожи у людей были взяты в Университетской больнице Чиба (Чиба, Япония). Все процедуры, проводимые с участием людей, были одобрены Институциональным обзорным советом Университетской больницы Чиба и Глобальным инновационным центром Shiseido, а все участники получили письменное информированное согласие. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Предварительная обработка образцов человеческой кожи

  1. При получении удалять подкожную ткань вырезанных образцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Интервал между удалением кожи и завоеванием составлял примерно h. Во время транспортировки ткань погружалась в DMEM и хранилась на ледяных пакетах.
  2. Положите образцы эпидермальной стороной вниз на плитку при температуре 60 °C на 45 секунд, чтобы отделить эпидермис и дерму.
  3. Немедленно погрузите образцы в ледяной PBS.
  4. Отдельте эпидермис и дерму пинцетом.
  5. Зафиксируйте дермальные части в 4% параформальдегиде при 4°C в течение 16 часов, а затем промывайте с помощью PBS перед использованием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После фиксации образцы хранились в PBS при 4 °C, а этапы иммунокрашивания были начаты в течение нескольких месяцев.
    ВНИМАНИЕ: раствор PFA токсичен. Вся подготовка и обращение должны осуществляться в вытяжке с использованием выхлопа с соответствующими средствами индивидуальной защиты.

2. Иммунокрашивание с цельным креплением в сочетании с очищающими реагентами

  1. Техника iDISCO
    1. Обрезать образцы примерно до 5 мм × 5 мм × 5 мм.
    2. Переместить образцы в 5% Triton X-100 и 2,5% Tween 20 in PBS на орбитальном шейкере, установленном на 50 об/мин при 24 °C в течение 16 часов для проницаемости.
    3. Промывайте образцы PBS при 24 °C в течение 1 часа, повторяя процесс три раза.
    4. Погрузите образцы в свежеприготовленный блокирующий буфер A (1% BSA, 0,1% Tween 20, 0,03% натриевый азид в PBS) на орбитальном шейкере, установленном на 50 об/мин при 24 °C на 72 часа.
    5. Инкубировать образцы первичным антителом к подопланину (1:100) в блокирующем буфере A на орбитальном шейкере, установленном на 50 об/мин при 37 °C в течение 72 часа.
    6. Промывайте образцы с буфером для промывания A (0,1% Tween-20 в PBS) при 24 °C в течение 1 часа, повторяя процесс три раза. Затем сохраняйте образцы в буфере для промывания A на орбитальном шейкере, установленном на 50 об/мин при 4 °C в течение 72 часа.
    7. Инкубировать образцы с вторичным антителом против мыши IgG, конъюгированным с Alexa Fluor 647 (1:1000) в блокирующем буфере A на орбитальном шейкере, установленном на 50 об/мин при 37 °C в течение 72 часа.
    8. Повторите шаг 1.6.
    9. Инкубировать образцы с 50% MeOH при 24 °C в течение 3 часов.
    10. Инкубировать образцы с 70% MeOH при 24 °C в течение 3 часов.
    11. Инкубировать образцы с 100% MeOH при 24 °C в течение 16 часов.
    12. Инкубировать образцы дихлорметаном при 24 °C в течение 15 минут, повторяя процесс дважды.
    13. Очищайте образцы дибензилным эфиром при 24 °C в течение 16 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткань не стала прозрачной к этому моменту, дальнейшее ожидание не приведёт к значительному улучшению.
    14. Сделайте снимки образцов с помощью микроскопа с помощью светового листа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте Lightsheet с объективом EC Plan-Neofluar 5×/0.16; установить освещение (возбуждение) на 63 морских милях и обнаружение на 648 морских миль; получить Z-стек с шагом 5,8 мкм.
      ВНИМАНИЕ: Метанол, дихлорметан и дибензилэфир опасны. Вся подготовка и обращение должны осуществляться в вытяжке с использованием выхлопа с соответствующими средствами индивидуальной защиты.
  2. Реагент Rapiclear 1.52
    1. Обрезать образцы примерно до 5 мм × 5 мм × 2 мм.
    2. Переместите образцы в 2% Triton-X 100 в PBS на орбитальном шейкере, установленном на 50 об/мин при 24 °C в течение 16 часов для проницаемости.
    3. Погрузите образцы в свежеприготовленный блокирующий буфер B (5% ослиная сыворотка и 1% Triton-X 100 в PBS) на орбитальном шейкере, установленном на 50 об/мин при 4 °C в течение 16 часов.
    4. Инкубировать образцы с первичными антителами к подопланину и VE-кадгерину (оба в 1:100) в блокирующем буфере B на орбитальном шейкере, установленном на 50 об/мин при 4 °C в течение 72 часа.
    5. Промывайте образцы буфером B (3% NaCl и 0,2% Triton-X 100 in PBS) при 24 °C в течение 1 часа, повторяя процесс три раза. Затем сохраняйте образцы в буфере для промывки B на орбитальном встряхивателе на 50 об/мин при 4 °C в течение 16 часов.
    6. Промывайте образцы PBS при 24 °C в течение 1 часа.
    7. Инкубировать образцы с вторичными антителами против мышиного IgG и кролика IgG, конъюгированных с Alexa Fluor 647 и 568 соответственно (оба в 1:1000), в блокирующем буфере B на орбитальном шейкере, установленном на 50 об/мин при 4 °C в течение 16 часов.
    8. Повторите шаги 1.5. и 1.6.
    9. Очищайте образцы с как минимум в 5 раз больше объёма образца Rapiclear 1.52 при 24 °C в течение 16 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очищение периферических областей ткани наблюдалось менее чем за 1 час.
    10. Очищенные образцы поместить в камеру геля с полидиметилсилоксаном, размещённую на накладке с помощью свежего реагента Rapiclear 1.52.
    11. Сфотографируйте образцы с помощью конфокального микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте конфокальный микроскоп с объективом Plan-Apochromat 10×/0,45 M27; установили возбуждение на 633 нм и 561 нм, а дальность обнаружения — 641-754 нм и 566-628 нм, с помощью детектора GaAsP; приобрести Z-стек с шагом 3,15 мкм.
  3. Техника CUBIC
    1. Обрезать образцы примерно до 5 мм × 5 мм × 3 мм.
    2. Погрузите образцы в 50% CUBIC-L при 24 °C в течение 24 часов в качестве предварительной обработки от делипидаций.
    3. Переместить образцы в 100% CUBIC-L на орбитальном встряхивателе, установленном на 50 об/мин при 37 °C в течение 7 дней для удаления.
    4. Промывайте образцы с PBS при комнатной температуре в течение 24 часов.
    5. Погрузите образцы в свежеприготовленный блокирующий буфер A на орбитальном встряхивателе, установленном на 50 об/мин при 24 °C в течение 72 часов.
    6. Инкубировать образцы первичным антителом против VE-кадгерина, подопланина и CD31 (соответственно 1:100, 1:100 и 1:200) в блокирующем буфере A на орбитальном шейкере, установленном на 50 об/мин при 37 °C в течение 72 часа.
    7. Промывайте образцы с буфером A при 24 °C в течение 1 часа. Повторите процесс три раза, затем храните образцы в буфере A на орбитальном шейкере, установленном на 50 об/мин при 4 °C в течение 72 часа.
    8. Инкубировать образцы с вторичными антителами против мышиного IgG, кролика IgG и овечьего IgG, конъюгированных с Alexa Fluor 647, 568 и 488 соответственно (все с частотой 1:1000), в блокирующем буфере A на орбитальном шейкере, установленном на 50 об/мин при 37 °C в течение 72 часа.
    9. Повторите шаг 3.7.
    10. Предварительно очистите образцы с 50% CUBIC-R+(M) при 24 °C в течение 16 часов.
    11. Очистите образцы с помощью 100% CUBIC-R+(M) при 24 °C в течение 16 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткань не стала прозрачной к этому моменту, дальнейшее ожидание не приведёт к значительному улучшению.
    12. Сфотографируйте образцы с помощью конфокального микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте конфокальный микроскоп с объективом Plan-Apochromat 20×/0,8 M27; установили возбуждение на 633 нм, 561 нм и 488 нм, а дальность обнаружения — 641-754 нм, 566-628 нм и 479-550 нм с помощью детектора GaAsP; приобрести Z-стек с шагом 0,78 мкм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Разница в светопропускаемости очищенной кожей человека с эпидермисом и без неё
На рисунке 1 показаны репрезентативные фотографии образцов человеческой кожи с эпидермисом и без, после проницаемости и очистки реагентом Rapiclear 1.52. Удаление эпидермии улучшает прозрачность тканей, устраняя меланин — мощный светопоглощатель, что подтверждается улучшенной видимостью чёрной линии под образцами.

Трёхмерная...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Трёхмерная визуализация лимфатических сетей в биологических тканях крайне важна для понимания их структурных характеристик и физиологических функций, а также патологических изменений. В этом протоколе представлены три различных метода очищения тканей, оптимизированных для человеческих кожных тканей, каждый из которых адаптирован для конкретных наблюдательных целей.

Удаление эпидермии считается критически важным этапом для устранения меланина, который снижает п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

K.T., E.G., N.I. и K.K. являются сотрудниками компании Shiseido Co., Ltd.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ни одного.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Анти-CD31 антителаR& D SystemsAF806разбавление в 1:200
Антитела к ПодопланинуДакоM3619разбавление на 1:100
Анти-VE-кадгериновое антителоТехнология клеточной сигнализации#2500разбавление на 1:100
CUBIC-LТокийская химическая промышленностьT3740
CUBIC-R+(M)Токийская химическая промышленностьT3741
DMEM, низкий уровень глюкозы, пируватThermo Fisher SCIENTIFIC11885084
Высокоадсорбируемое вторичное антитело Alexa Fluor 647 против мышей против мышей (H+L) с сильной перекрестной адсорбциейThermo Fisher SCIENTIFICA-31571разбавление на 1:1000
Высоко адсорбируемое вторичное антитело против кроликов IgG (H+L), Alexa Fluor 568Thermo Fisher SCIENTIFICA10042разбавление на 1:1000
Вторичное антитело против овец IgG (H+L) с перекрестной адсорбцией, Alexa Fluor 488Thermo Fisher SCIENTIFICA-11015разбавление на 1:1000
Rapiclear 1.52Лаборатория СунцзиньRC152001
Микроскоп ZEISS Lightsheet Z.1Карл Цейсс
Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп ZEISS LSM 880Карл Цейсс

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Skobe, M., Detmar, M. Structure, function, and molecular control of the skin lymphatic system. J Investig Dermatol Symp Proc. 5 (1), 14-19 (2000).
  2. Yang, Y., Wang, X., Wang, P. Signaling mechanisms underlying lymphatic vessel dysfunction in skin aging and possible anti-aging strategies. Biogerontology. 24 (5), 727-740 (2023).
  3. Oliver, G., Kipnis, J., Randolph, G. J., Harvey, N. L. The Lymphatic Vasculature in the 21st Century: Novel Functional Roles in Homeostasis and Disease. Cell. 182 (2), 270-296 (2020).
  4. Baluk, P., McDonald, D. M. Imaging Lymphatics in Mouse Lungs. Methods Mol Biol. 1846, 161-180 (2018).
  5. Kajiya, K., Hirakawa, S., Detmar, M. Vascular endothelial growth factor-A mediates ultraviolet B-induced impairment of lymphatic vessel function. Am J Pathol. 169 (4), 1496-1503 (2006).
  6. Kajiya, K., Detmar, M. An important role of lymphatic vessels in the control of UVB-induced edema formation and inflammation. J Invest Dermatol. 126 (4), 919-921 (2006).
  7. Sawane, M., Kidoya, H., Muramatsu, F., Takakura, N., Kajiya, K. Apelin attenuates UVB-induced edema and inflammation by promoting vessel function. Am J Pathol. 179 (6), 2691-2697 (2011).
  8. Kirschnick, N., et al. Rapid methods for the evaluation of fluorescent reporters in tissue clearing and the segmentation of large vascular structures. iScience. 24 (6), 102650(2021).
  9. Orlich, M., Kiefer, F. A qualitative comparison of ten tissue clearing techniques. Histol Histopathol. 33 (2), 181-199 (2017).
  10. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  11. Kajiya, K., Bise, R., Commerford, C., Sato, I., Yamashita, T., Detmar, M. Light-sheet microscopy reveals site-specific 3D patterns of the cutaneous vasculature and pronounced rarefication in aged skin. J Dermatol Sci. 92 (1), 3-5 (2018).
  12. Sawane, M., et al. Apelin provides an alternative function to estrogen in regulating lymphatic vascular integrity. J Dermatol Sci. 111 (3), 124-127 (2023).
  13. Itai, N., et al. Lymphangiogenesis and lymphatic zippering in skin associated with the progression of lymphedema. J Invest Dermatol. 144 (3), 659-668.e7 (2024).
  14. Breiteneder-Geleff, S., et al. Podoplanin-a specific marker for lymphatic endothelium expressed in angiosarcoma. Verh Dtsch Ges Pathol. 83, 270-275 (1999).
  15. Suami, H., Scaglioni, M. F. Anatomy of the lymphatic system and the lymphosome concept with reference to lymphedema. Semin Plast Surg. 32 (1), 5-11 (2018).
  16. Avraham, T., et al. Fibrosis is a key inhibitor of lymphatic regeneration. Plast Reconstr Surg. 124 (2), 438-450 (2009).
  17. Giannotta, M., Trani, M., Dejana, E. VE-cadherin and endothelial adherens junctions: active guardians of vascular integrity. Dev Cell. 26 (5), 441-454 (2013).
  18. Newman, P. J., et al. PECAM-1 (CD31): cloning and relation to adhesion molecules of the immunoglobulin gene superfamily. Science. 247 (4947), 1219-1222 (1990).
  19. Bhutto, I. A., et al. Visualization of choroidal vasculature in pigmented mouse eyes from experimental models of AMD. Exp Eye Res. 238, 109741(2024).
  20. Cichoń, M. A., Elbe-Bürger, A. Epidermal/Dermal separation techniques and analysis of cell populations in human skin sheets. J Invest Dermatol. 143 (1), 11-17.e8 (2023).
  21. Takahashi, K., et al. An analysis modality for vascular structures combining tissue-clearing technology and topological data analysis. Nat Commun. 13 (1), 5239(2022).
  22. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  23. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  24. Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Rep. 24 (8), 2196-2210.e9 (2018).
  25. Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. J Cell Biol. 144 (4), 789-801 (1999).
  26. Wigle, J. T., Oliver, G. Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell. 98 (6), 769-778 (1999).
  27. Johnson, L. A., et al. Inflammation-induced uptake and degradation of the lymphatic endothelial hyaluronan receptor LYVE-1. J Biol Chem. 282 (46), 33671-33680 (2007).
  28. Pechtimaldjian, L., et al. Skin-iDISCO+: An optimized tissue-clearing and labeling protocol for morphometric analysis of human cutaneous vasculature. STAR Protoc. 6 (1), 103524(2024).
  29. Hägerling, R., et al. VIPAR, a quantitative approach to 3D histopathology applied to lymphatic malformations. JCI Insight. 2 (16), e93424(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Lymphatic VesselsHuman SkinThree Dimensional VisualizationLymphedemaTissue ClearingConfocal MicroscopyLight Sheet MicroscopyImmunohistochemistryCapillary JunctionsLymphatic Endothelial Cells

Похожие статьи