Одномолекулярный FRET-анализ позволяет количественно анализировать отжиг, опосредованный Hfq, между бактериальными с-РНК и мРНК, что позволяет измерить кинетику взаимодействия и стабильность. Репрезентативные результаты показывают, как длина семян, мотивы связывания Hfq и расстояние между мотивами влияют на формирование дуплексов РНК.
Исследовательская статья
Влияние длины семян и связывающих мотивов на отжиг, опосредованное Hfq, с-РНК-мРНК, анализируемое с использованием одномолекулярного FRET
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Определение правил, регулирующих отжиг между бактериальными малыми РНК (сРНК) и их мРНК-мишенями, сложно, поскольку эти РНК обладают высокой гетерогенностью по последовательности и структуре. Чтобы распутать вклад отдельных признаков, мы систематически варьировали ключевые детерминанты, включая прочность семян, мотивы связывания Hfq и расстояние между ними. Влияние этих особенностей на дуплексную стабильность сРНК-мРНК тестировалось с помощью одномолекульного резонансного переноса энергии Фёрстера (smFRET), что позволяет контролировать отдельные молекулы РНК на миллисекундных временных шкалах и обеспечивает доступ к динамическим событиям, часто скрытым в ансамблевых анализах.
Мы показали, что короткие семенные участки (4-5..) образуют нестабильные и кратковременные комплексы, тогда как более длинные семена (8-10..) образуют стабильные дуплексы. Расширение мотивов связывания с Hfq или введение спейсера между сайтами связывания на мРНК дополнительно увеличило срок жизни взаимодействия, подчёркивая важность прочности мотивов и пространственного расположения в эффективности отжига, опосредованного Hfq. Кроме того, этот подход предоставляет надёжную и воспроизводимую основу для анализа динамики взаимодействия РНК-РНК с одномолекулярным разрешением и для изучения механизмов шаперонов РНК.
Введение
Экспрессия бактериальных генов широко регулируется на посттранскрипционном уровне малыми РНК. Эти короткие (обычно 50-300 нт) РНК действуют путём базового сопряжения с целевоймРНК 1. Во многих случаях сРНК отжигают к сайтам связывания рибосом, чтобы подавить трансляцию или вызвать распад мРНК путём рекрутированияРНазы 2,3. Хотя эти взаимодействия были широко изучены с помощью генетических и биохимических анализов, большинство доступных подходов делают выводы о регуляции косвенно на основе устойчивого влияния на уровень РНК или выработку белка, что затрудняет определение базовой динамики связывания.
Эффективная регуляция мишеней часто требует РНК-шаперона Hfq — небольшого гексамерного белка, похожего наSm, 4,5. Hfq продлевает период полураспада сРНК, защищая их отнуклеаз 6, и способствует отжигу с помощью мРНК 7,8. Hfq достигает этих функций через три отдельные поверхности связывания РНК с разными предпочтениями: дистальное лицо распознаёт мотивы AAN, обычно встречающиеся в мРНК, проксимальное лицо связывается с последовательностями, богатыми U, типичными для терминаторов с-РНК, а край электростатически взаимодействует с РНК-магистралями9. Однако Hfq присутствует в гораздо меньших количествах, чем общий пул взаимодействующихРНК 10,11. Несмотря на это очевидное ограничение, недавно синтезированные сРНК быстро находят свои цели и запускают регуляцию в течение нескольких минут послетранскрипции 12. Этот парадокс указывает на то, что взаимодействия РНК-Hfq очень динамичны, при этом РНК постоянно ассоциируются и диссоциируются, а не остаются связывающими в стабильныхкомплексах 13,14. Понимание того, как такие временные взаимодействия приводят к надёжной регуляции, требует экспериментального доступа к индивидуальным событиям связывания, а не к средним значениям популяции.
Взаимодействия между сРНК и мРНК опосредованы неидеально комплементарными семянными последовательностями, которые должны находить свои соответствующие сайты внутри мРНК, часто длинных и сильно структурированных. Кроме того, расстояние между областью семени sRNA и сайтом связывания Hfq на мРНК может значительноварьироваться на 15, что дополнительно усложняет процесс отжига. Hfq помогает преодолеть эти трудности, гибко передавая сРНК между потенциальными сайтами связывания на целевом объекте, увеличивая вероятность встречи правильной областипарирования 16. Пары, опосредованные Hfq, также могут перемоделировать локальные структуры мРНК, временно разворачивая парные области с основанием и обнажая иначе недоступные последовательности. Однако такое переоборудование может привести к непродуктивным или неуспешным событиям отжига. Эти временные взаимодействия иногда стабилизируются сильными мотивами, связывающими Hfq, расположенными рядом с местомспаривания 17. Несмотря на эту гибкость, не все встречи с РНК и мРНК приводят к стабильному образованию дуплексов, а факторы, определяющие эффективность отжига, остаются плохо изученными. В частности, остаётся неясным, как отдельные детерминанты последовательностей количественно влияют на срок службы связывания и сложную стабильность.
Здесь мы создали минимально восстановленную одномолекулярную систему, позволяющую поэтапно манипулировать детерминантами последовательностей и напрямую измерять кинетику отжига с помощью smFRET. В этой системе мы спроектировали пары РНК с изначально неэффективным отжигом и систематически изменёнными ключевыми характеристиками, включая прочность семени, силу мотивов связывания Hfq и расстояние между этими участками, чтобы разобрать, как отдельные параметры влияют на устойчивость дуплекса. Изолируя определённые последовательности в контролируемой in vitro системе, этот подход позволяет механистически разбирать правила таргетинга на sRNA, которые трудно распутать in vivo из-за сложности сети и косвенных регуляторных эффектов.
Протокол
Этот протокол описывает анализ FRET на основе одной молекулы для мониторинга отжига сРНК-мРНК. Он включает процедуры по проектированию, синтезу моделей РНК, пассивации и функционализации слайдов, одномолекулярной визуализации и количественному анализу данных.
Подготовка РНК
Проектируйте последовательности sRNA и mRNA in silico. Каждая sRNA должна заканчиваться транскрипционным терминатором и содержать U-богатый Hfq-связывающий мотив, а также последовательность семени, дополняющая целевую мРНК. Соответствующая мРНК должна включать AAN-повторы, выступающие в роли мотива связывания Hfq, и последовательности, комплементарную к области семени sRNA. Последовательности вне связывания Hfq рандомизируются с избеганием мотивов AAN и участков, богатых U, чтобы предотвратить нежелательные взаимодействия Hfq. Добавьте трос-комплементарную последовательность на 3'-конец мРНК для обеспечения иммобилизации на поверхности во время визуализации. Прогнозировать вторичные структуры РНК, исключая последовательность привязки-комплементарной последовательности, используя РНКструктуру через веб-сервер илилокально 18. Для веб-анализа загрузите последовательности FASTA на веб-сервер RNAstructure Web Server (https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb) и выберите Predict a Secondary Structure. Используйте стандартные параметры (температура 37 °C, без ограничений на складывание). После вычислений проверьте структурную диаграмму и вероятность складывания. Регионы классифицировались как окклюзированные, если нуклеотиды внутри семенной или Hfq-связывающего мотива предсказывали вероятность парирования оснований >60%. Последовательности, превышающие этот порог, были переработаны.
Подготовьте шаблоны ДНК для транскрипции in vitro , расширяя перекрывающиеся олигонуклеотиды с помощью ДНК-полимеразы, следуя протоколу производителя. Концентрация праймера составляла по 3 мкм каждому. Программа термоциклера использовалась по рекомендации производителя, за исключением того, что количество циклов усиления было сокращено до 8, что было достаточно для увеличения грунтов.
Транскрипция РНК при 37 °C в течение 3 часов до ночи с использованием T7 РНК-полимеразы в транскрипционном буфере 1× (80 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 2 мМ спермидина, 10 мМ NaCl), дополняя по 1 мМ NTP, 40 мМ DTT и 30 мМMgCl 2. Остановите реакцию, добавив ЭДТА к конечной концентрации 30 мм. Для осадков РНК добавьте 1/10 объема 3 млн NaOAc (pH 5,4), затем 2,5–3 объёма ≥99% этанола. Тщательно перемешайте и инкубуйте при -80 °C в течение 1 часа. Пеллетная РНК центрифугой при ≥20 000 × г в течение 35 минут при 4 °C. Снимите супернатант, промойте гранулы с 70% этанола и ненадолго высушите на воздухе. Растворить РНК-гранулу в 20 мкл 8 м мочевины и нагреть при 90 °C в течение 2 минут. Очистить РНК на 8% полиакриламидных гелях, содержащих 8 млн мочевины. Исключить интересующие полоски и элюировать РНК за ночь в буфере элюции (0,3 млн ацетата натрия, pH 5,4, 1 мМ EDTA). Восстановить РНК с помощью этанолового осадка (следуйте инструкциям по осадке ДНК) и растворить гранулу в воде без нуклеазы.
Для подготовки РНК к флуоресцентной маркировке проводите in vitro транскрипцию, как описано, дополняя реакцию 32 mM GMP для получения транскриптов с 5' монофосфатом. Обработайте РНК 1-этил-3-[3-диметиламинопропил] карбодиимидгидрохлоридом 19 (EDC) и имидазолом, чтобы ввести аминовую группу на 5' конце. Инкубировать сРНК в карбонатно-бикарбонатном буфере (pH 8,5) с помощью эфира Alexa Fluor 555 или Cy3 NHS, следуя инструкциям производителя. Очистить модифицированную РНК с помощью хроматографических спиновых колонок, осакоть этанолом и растворить гранулу в воде без нуклеаз. Определите эффективность маркировки спектрофотометрически, измеряя поглощение на 260 нм и при максимальном поглощении красителя с помощью нанодропа или эквивалентного спектрофотометра. Рассчитывать концентрации РНК и красителей с использованием закона Бира-Ламберта и соответствующих коэффициентов вымирания, предоставленных производителем фторофора. Эффективность маркировки определяется как молярное отношение красителя к РНК и регулярно достигала 100%. Меченые РНК можно хранить при -20 °C.
Отряд ДНК олигонуклеотидов с 3′-биотиновой частью и 5′-амино-C6-линкером. Осадить ДНК с помощью этанола и ацетата натрия, как описано выше. Маркировка аминовой группы эфиром Cy5 NHS в карбонатно-бикарбонатном буфере (pH 8,5) согласно инструкциям производителя. Определите концентрацию маркированной ДНК спектрофотометрически, как описано выше. Маркированные ДНК могут храниться при -20 °C.
Очистка HFQ
Grow Escherichia coli BL21 (DE3) Δhfq::cat-sacB-клетки , несущие экспрессионную плазмиду Hfq pET21b-EcHfq, в которой ген E. coli hfq экспрессируется от IPTG-индуцируемого промотора. Hfq выражается без тега аффинности; нативный белок содержит достаточное количество поверхностно открытых гистидиновых остатков для очистки с помощьюNi2+ аффинной хроматографии. Выращивать клетки в 1 л среды LB-Miller с добавлением 100 мкг/мл ампициллина при 37 °C доOD 600 0,6. Индуцировать экспрессию Hfq, добавляя IPTG к конечной концентрации 1 мМ, и инкубировать в течение 4 часов при 37 °C. Собирайте клетки центрифугированием при 5 000 × г в течение 10 минут, затем восстанавливайте гранулу в 50 мл лизисного буфера (50 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 500 мМNH 4Cl, 250 мМ MgCl2, 1 мМ 2-меркаптоэтанол, Овнимание: 2-меркаптоэтанол токсичен, подавать в вытяжке). Лизируйте клетки с помощью соникации на льду с импульсным циклом 50%. Примените три импульса по 40 секунд с интервалами охлаждения по 1 минуте на льду между импульсами. Центрифугуйте лизат при 27 000 × г в течение 20 минут при 4 °C. Нагрейте супернатант при 85 °C в течение 45 минут, затем снова центрифугуйте при тех же условиях. Обработайте полученный супернатант РНазой A (30 мкг/мл) и ДНКазой I (5 U/mL) в течение 1 часа при комнатной температуре с лёгким встряхиванием, затем фильтром с фильтром 0,45 мкм. Нанесите очищенный лизат на колонку аффинной хроматографии, предварительно заряженнуюNiSO 4. Промыть колонну буфером (50 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 500 мМNH 4Cl, 0,5 мМ 2-меркаптоэтанол). Элюируйте белок с использованием того же буфера с линейной концентрацией градиента имидазола от 10 мМ до 1 М. Объедините фракции, содержащие Hfq, и загрузите их в хроматографическую колонку HiLoad 16/600 Superdex 200 с хроматографией с исключением размера, уравновешенную с буфером HB (50 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 250 мМNH 4Cl, 1 мМ EDTA, 10% глицерин). Управляйте колонкой согласно инструкциям производителя. Репрезентативный анализ SDS-PAGE очистки Hfq показан на дополнительном рисунке 1. При необходимости концентрируйте очищенный белок с помощью центробежных фильтров (3 кДа MWCO). Очищенные аликвоты Hfq можно хранить при -80 °C.
Эксперименты с одной молекулой
Пассивация кварцевых слайдов20
Подготовьте кварцевые слайды с пятью параллельными отверстиями (диаметром 0,8 мм), просверленными у каждого длинного края. Поместите кварцевые стекли и накладки в банку для окрашивания Хеллендаля (держатель для затвора) и соникайте в ацетоне в течение 20 минут (Внимание: ацетон горючий и летучий; работайте в вытяжном контейнере). Повторите этап очистки с использованием метанола (Внимание: метанол токсичен и горючий; используйте в вытяжной вытяжке). Тщательно промывайте стекли водой и соник в 1 M KOH в течение 1 часа (внимание: KOH едкий, надевайте перчатки и защиту для глаз). Промывайте стекли водой, затем последовательно соникулируйте ацетоном и метанолом по 20 минут каждая. Повторите очистку KOH с использованием 5 M KOH в течение 1 часа, затем тщательное промытие водой (Внимание: используйте концентрированный KOH с соответствующим защитным снаряжением). Сушите слайды на воздухе. Подготовьте чистый набор банок для окрашивания Хеллендаля и прополосните их гексаном (внимание: гексан сильно горючий; держите их в вытяжке с дымом), затем дайте им высохнуть на воздухе. Положите затворы в держатель и дважды прополосните их гексаном. Добавьте 75 мл гексана в держатель затвора и аккуратно введите 50 мкл дихлордиметилсилана (DMDCS) под поверхность гексана (ПРИМЕЧАНИЕ: избегайте воздействия DMDCS). Инкубировать горки с лёгким покачиванием в течение 1,5 часа. Промыйте и соникуйте стекли в гексане в течение 1 минуты и повторите этот шаг три раза, чтобы удалить остаточные DMDCS. Сушите стекли на воздухе и вакуумно герметизуйте их в трубках объемом 50 мл (например, Falcon или конические). Подготовленные стекли можно хранить при −20 °C до дальнейшего использования.
Сборка и функционализация потоковых каналов
Простой потоковый канал можно собрать с помощью кварцевого затвора, стеклянного покрытия, двусторонней ленты, наконечников пипеток и эпоксидки. Наклейте тонкие полоски двусторонней ленты между отверстиями кварцевого затвора и положите накладку сверху. Запечатайте длинные края эпоксидкой. Вырежьте примерно 5 мм сегментов с кончика пипетки (как узкого кончика, так и широкого воротника) и вставьте один в отверстие для выхода, а другой — в параллельное отверстие для образования входного резервуара. Закрепите оба эпоксидкой. Впускной резервуар должен удерживать жидкость без протечек до впрыскивания. Чтобы получить растворы через канал, подключите трубку от шприца объёмом 1 мл к выходу.
Предварительно обработайте каналы последовательно следующими реагентами для функционализации поверхности: биотинилированный BSA (0,2 мг/мл) в течение 5 минут, Tween-20 (0,2%) 10 минут и NeutrAvidin (0,1 мг/мл) в течение 1 минуты. Примерно 100 мкл каждого раствора достаточно на канал. Избегайте затягивания большего количества жидкости, чем в впускном резервуаре, так как это приведёт к появлению воздуха в канал и образованию пузырьков. Оставьте небольшой объём раствора в резервуаре между этапами, чтобы канал не высыхал. Тщательно промывайте буфером 1× TNK (10 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 50 мМ NaCl, 50 мМ KCl) между каждым шагом. Это лечение устанавливает поверхность биотина и нейтраавидина для иммобилизации РНК.
Подготовьте мРНК-дуплексы непосредственно перед иммобилизацией, смешав 40 нМ мРНК с 20 нМ биотинилированным Cy5-маркированным ДНК-тросом. Денатурировать смесь при 75 °C в течение 5 минут в буфере 1× TNK (10 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 50 мМ NaCl, 50 мМ KCl), затем переохладить при 37 °C в течение 15 минут и уравновесить при 20 °C.
Разбавить образец в буфере визуализации в 50 раз (10 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 50 мМ NaCl, 50 мМ KCl, 4 мМ 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхромроман-2-карбоновой кислоты, 0,01% октаэтиленгликоля монододецилового эфира, 0,8% глюкозы, ингибитора 2 U/mL РНаз) и ввести его в потоковый канал для иммобилизации мРНК. Инкубировать 1 минуту, затем промывать с буфером для визуализации с дополнением кислородной системы очистки кислорода (165 U/mL оксидаза глюкозы и каталаза 2170 U/mL) для уменьшения фотоотбеливания.
Подготовьте комплексы sRNA-Hfq, смешивая компоненты в соотношении 1:1 к конечной концентрации 250 нМ в буфере 1× TNK и инкубировать 5–15 минут при комнатной температуре. Разведите комплексы в 50 раз в буфере визуализации, содержащем систему поглощения кислорода, и введите их в канал потока непосредственно перед съёмкой.
Сбор данных по одной молекуле
Настройте призматичный микроскоп с полной внутренней флуоресценцией (TIRF), включив камеру EMCCD и лазеры. Установите подготовленный стекло с собранными потоковыми каналами на стадию микроскопа и разместите призму сверху. Используйте единое программное обеспечение (https://github.com/Ha-SingleMoleculeLab) для сбора данных. В программном обеспечении определите уровень фона, выбрав AutoScal, и скопируйте полученное значение в поле Background. Установите частоту кадров на 100 мс. Excite Alexa Fluor 555 или Cy3 с лазером 532 нм и Cy5 с лазером 633 нм. Собирайте выбросы из обоих каналов одновременно через 60× водяной объект. Для каждого фильма начинайте с десяти кадров возбуждения 633 нм, чтобы локализовать мРНК с меткой Cy5 в поле зрения. Продолжайте запись в течение 5 минут с возбуждением 532 нм. Завершите получение 1 секундой возбуждения 633 нм для подтверждения фотоотбеливания Cy5. Это позволит создать файл фильма .pma, который можно использовать для анализа.
Анализ данных по одной молекуле
Анализируйте необработанные .pma-файлы с помощью собственных скриптов IDL для выполнения отображения каналов донор-акцептор и извлечения траекторий интенсивности флуоресценции. Сначала запишите калибровочный фильм с использованием многоцветных флуоресцентных шариков, которые можно определить как в донорском, так и в акцепторном каналах при возбуждении с помощью лазера 532 нм или 633 нм. Используйте этот фильм калибровки, чтобы сгенерировать файл отображения, который выравнивает каналы донора и акцептора. Применить полученный файл отображения ко всем экспериментальным записям для идентификации соответствующих пар донор-акцептор, обнаружения флуоресцентных пятен и экспорта трассировок времени интенсивности для дальнейшего анализа FRET. Подробные пошаговые инструкции предоставляются вместе со скриптом (https://github.com/Ha-SingleMoleculeLab).
Отслеживание интенсивности процесса в MATLAB с помощью скрипта s_tr_E.m. Запустите скрипт и войдите в каталог с файлами .traces и .pks, затем индекс файла и временное разрешение. Выберите окно рамки, используемое для идентификации точек, когда это будет предложено. Затем сценарий отображает интенсивность донора и акцептора в каждом месте. Перемещайтесь по молекулам с помощью клавиатурных команд (b — чтобы вернуться назад, g — для прыжка к заданной молекулы). Определите исходные линии донора и акцептора (k) и исправьте утечку (l), кликая по графикам при необходимости. Сохраняйте принятые следы отдельно как .dat файлы, содержащие время, интенсивность донора и акцептора, нажав s. Используйте экспортированные файлы для количественного анализа.
Используйте программу peak-finder для анализа отдельных следов smFRET и извлечения событий связывания для количественной оценки, включая анализ времени пребывания и распределения состояний FRET. Запустите программу и откройте папку с экспортированными .dat трассировочными файлами через меню Файл. Установите базовые значения и значения утечки от донора к акцептору, определённые ранее с помощью скрипта MATLAB. Далее установите пороги интенсивности так, чтобы направлять автоматическое обнаружение пиков так, чтобы все визуально подтвержденные события связывания находились выше выбранных значений. Если шум приводит к разделению одного события на несколько пиков, вручную объедините их с помощью встроенной функции слияния. Нажмите «Сохранить пики», чтобы экспортировать обнаруженные события в .csv файлы, содержащие время начала, время окончания и среднюю эффективность FRET для каждого события. Выходные файлы сохраняются в директории пиков, а значения FRET с разрешением кадров для каждого события записываются в директорию пиковых ладов. Эффективность FRET рассчитывается путем деления интенсивности флуоресценции акцептора на сумму интенсивностей донора и акцептора, используя значения, скорректированные с учётом фона и утечки донора в акцепторный канал. Ручной проверьте трассы на наличие фотоотбеливания Cy5, выявленного резким снижением эффективности FRET и увеличением интенсивности Cy3. Когда происходит фотоотбеливание, предположим, что связывание сохраняется, пока флуоресценция Cy3 остаётся обнаруживаемой, и корректируйте пиковые длительности, редактируя соответствующие .csv файлы.
Импортируйте значения эффективности FRET с разрешением кадров из файлов пиковых ладов в GraphPad Prism. Генерируйте гистограммы FRET с помощью функции частотного распределения и подбирайте распределения с гауссовыми моделями для идентификации доминирующей популяции FRET.
Определите время пребывания для отдельных событий связывания, вычитая ассоциации из точек времени диссоциации с помощью таблицы. Вычислите долю переходных событий (<10 с) для каждого экспериментального повтора. Статистический анализ проводился в GraphPad Prism. Сравнения между двумя состояниями оценивались с помощью непарных t-тестов, а сравнения между тремя и более состояниями анализировались с помощью одностороннего ANOVA с пост-хок тестом Тьюки.
Результаты
Длина семени задаёт динамический режим пары сРНК-мРНК
Мы разработали минимальный одномолекулярный анализ для проверки того, как последовательности определяют отжиг, опосредованный Hfq. Модельные РНК были разработаны в соответствии с ранее описанными архитектурами Hfq-зависимых пар сРНК-мРНК 16,17 и несли аденозин-насыщенный Hfq-связывающий мотив на мРНК и богатый уридином участок связывания с обоем на sRNA (см. рисунок 1A). СРНК была маркирована Alexa Fluor 555 (донор) на 5ʹ конце и мРНК-ДНК с помощью Cy5 (акцептор), что позволяло обнаруживать близость, вызванную парой оснований, с помощью FRET.
Изменение комплементарности семян от 4, 5, 8 до 10.. приводило к выраженным динамическим поведению. У семени с 4 б.. взаимодействия были преимущественно временными и демонстрировали гетерогенную эффективность FRET, что указывает на неполное парирование оснований (рисунок 1B-D). В отличие от этого, семя 8 и 10 бп давали стабильные дуплексы, которые часто сохранялись до окна наблюдения (рисунок 1C). Взаимодействия приводили к ожидаемому высокому состоянию FRET (EFRET ≈ 0,79-0,80, рисунок 1D), что соответствует полному спариванию оснований между РНК. Семя с 5 ударных пунктов приводило к кратковременным, но хорошо определённым событиям связывания (FRET E ≈ 0,66), обеспечивая рабочий динамический диапазон для последующих изменений последовательности РНК (см. рисунок 1B-D). Поэтому мы использовали 5-бп комплементарность для всех последующих тестов.
Более сильные мотивы связывания Hfq повышают стабильность комплекса sRNA-mRNA
Далее мы спросили, как сила связывания Hfq модулирует сроки жизни связывания при фиксированной комплементарности в 5 ударных пунктов. Расширение мотива мРНК с AAN4 до AAN6 значительно увеличило вероятность образования стабильных комплексов (p < 0,001). Средняя продолжительность жизни выросла с 7,5 с до 18 с, а доля нестабильных событий < 10 с снизилась с 80 ± 2% до 68,3 ± 2,9% (рисунок 2A-C).
Затем мы протестировали влияние мотива связывания Hfq на сРНК. Укорочение участка связывания края с UUAUUUUUUUU до CUUC (sRNA-SR, «короткий край») вызвало крайне нестабильные взаимодействия (средний срок жизни 1,9 с с AAN4), а усиление мотива мРНК в этом контексте имело лишь умеренный эффект (среднее 3,0 с с AAN6, незначительно, см. рисунок 2B,C). Таким образом, оба партнёра способствуют стабильности полученного комплекса, но слабые контакты sRNA-Hfq ограничивают усиление более сильного мотива мРНК.
Спейсер между Hfq- и семянными участками на мРНК способствует более длительному существованию комплексов
Hfq может оставаться связанным с областью AAN, используя поверхность обода для поиска оптимального сайта парированияsRNA 16. Это свойство указывало на то, что дополнительное расстояние между двумя связывающими областями на мРНК может влиять на стабильность взаимодействия.
Для проверки этого мы ввели 15-нтный одноцепочечный спейсер между сайтами связывания Hfq и sРНК (N15). Эта модификация значительно увеличила продолжительность жизни стабильных отжигов с 7,5 с (AAN4) до 47 с (AAN4-N15) (p < 0,01) (рисунок 3A,B). Доля связывающих событий длительностью менее 10 секунд также снизилась с 80 ± 2% до 44 ± 6% (рисунок 3C). Эти данные показывают, что дополнительная гибкость между модулями связывания может стабилизировать отжигающие промежуточные продукты и способствовать более длительному существованию дуплексов.
ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ:
Все данные, подтверждающие результаты этого исследования, включая траектории FRET по одной молекулы, обработанные наборы данных и скрипты анализа, доступны в репозитории данных Менделей по адресу: doi:10.17632/3z8fng2c8g.1
Рисунок 1: Влияние комплементарности сРНК-мРНК на эффективность связывания. (A) анализ smFRET для отжига сРНК-мРНК. Спаривание оснований между сРНК, маркированной Alexa Fluor 555, и иммобилизованным комплексом мРНК-Cy5-ДНК обеспечивает высокий сигнал FRET. Модельные мРНК содержат сайт связывания с Hfq (AAC)4 (синий) и сайт связывания с sRNA (S5, красный), за которыми следуют пять нуклеотидов и гибридный регион РНК-ДНК. сРНК включают участок связывания по краю (оранжевый). Панели в (B-D) группируются по экспериментальному состоянию (длине семени). (B) Репрезентативное событие связывания с-РНК на одной молекуле мРНК. Показаны следы интенсивности флуоресценции сРНК с меткой Alexa Fluor 555 (донорская, зелёная) и троса Cy5-ДНК (акцептор, красный). Cy5 был непосредственно взволнован в первые десять кадров записи. (C) Растерграммы, изображающие 50 репрезентативных молекул мРНК, связанных с помощью sRNA-Hfq. Каждая горизонтальная полоса представляет собой одно взаимодействие сРНК и мРНК. (D) Гистограммы эффективности FRET для взаимодействий между мРНК и сРНК, содержащими 4 бп (N = 416 мРНК), 5 бп (N = 513 мРНК), 8 бп (N = 191 мРНК) или 10 бп (N = 105 мРНК) комплементарных областей. Эффективность FRET рассчитывалась на основе исходной и скорректированной с учётом утечки интенсивности донора и акцептора для отдельных событий связывания с интервалом 0,1 с. Гауссовские посадки (синие) показаны для обозначения доминирующей популяции FRET и не использовались для расчёта E_FRET значений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Влияние длины мотива, связывающего Hfq, на взаимодействия с-РНК и мРНК. Область парирования оснований во всех вариантах составляет длину 5 базисных пунктов. (A) Растерграммы, показывающие 50 представительных мРНК, связанных комплексами sRNA-Hfq. Каждая горизонтальная полоса представляет собой одно и то же взаимодействие. Карикатурные диаграммы выше иллюстрируют соответствующие конструкции РНК с изменениями количества повторов (AAC) в мРНК и длины области связывания обода в сРНК (SR = «короткий край»). Раскраска, как на рисунке 1A. (B) Диаграммы рассеяния сроков связывания с-РНК-мРНК. Каждая точка представляет собой одно событие связывания. Средние сроки жизни (красная горизонтальная линия): 7,5 с для мРНК-AAN4 + сРНК (N = 188 мРНК), 18 с для мРНК-AAN6 + сРНК (N = 142 мРНК), 1,9 с для мРНК-AAN4 + сРНК-SR (N = 85 мРНК), и 3 с для мРНК-AAN6 + сРНК-SR (N = 149 мРНК). (C) Столбчатый график, показывающий процент событий связывания короче 10 секунд. Полоски ошибок представляют собой стандартное отклонение от двух независимых наборов данных. Статистический анализ с помощью одностороннего ANOVA с пост-хок тестом Тьюки для множественных сравнений. p < 0,001, ****p < 0,0001; NS, не значительно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Влияние длины спейсера между сайтами связывания Hfq и sРНК на взаимодействия сРНК и мРНК. Область парирования оснований во всех вариантах составляет длину 5 базисных пунктов. (A) Растерграммы, изображающие 50 представительных мРНК, связанных комплексом sRNA-Hfq. Каждая горизонтальная полоса представляет собой одно событие связывания. Диаграммы мультфильмов выше иллюстрируют соответствующий дизайн РНК. N15 = 15 нт спейсера случайной последовательности. Раскраска, как на рисунке 1A. (B) Диаграммы рассеяния сроков связывания с-РНК-мРНК. Каждая точка представляет собой одно событие связывания. Средние сроки жизни (красная горизонтальная линия): 7,5 с для мРНК-AAN4 + сРНК (N = 188 мРНК) и 47 с для мРНК-AAN4-N15 + сРНК (N = 289 мРНК). (C) Столбчатый график, показывающий процент событий связывания короче 10 секунд. Полоски ошибок представляют собой стандартное отклонение от двух независимых наборов данных. Статистический анализ с помощью непарного t-теста. **p < 0.01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
Дополнительный рисунок 1: Очищение E. coli Hfq. SDS-PAGE анализ экспрессии и очистки Hfq. (Верх) Образцы, собранные во время очистки на колонке с аффинностью Ni2+ (HiTrap), включая до индукции, после индукции, пеллеты, лизаты, нагрузки, проточные, промывочные фракции и элюированные пиковые частицы. (Внизу) SDS-PAGE пиковых долей после хроматографии с исключением размера на столбце Superdex 200 HiLoad 16/600. Показаны мономерные (~11 кДа) и гексамерные (~66 кДа) формы Hfq. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Обсуждение
Это исследование устанавливает минимальный одномолекулярный анализ для анализа того, как специфические особенности последовательностей РНК определяют эффективность отжига сРНК-мРНК, опосредованного Hfq. Варьируя длину семени, силу связывающего мотива Hfq и расстояния между модулями связывания, мы напрямую количественно определили, как каждый параметр способствует дуплексной стабильности при разрешении одной молекулы. В отличие от ансамблевых измерений, которые отражают усредненные по популяции эффекты, этот подход напрямую разрешает отдельные события связывания и диссоциации, позволяя измерять кинетическую гетерогенность и временные взаимодействия. Наши результаты показывают, что даже короткие семенные области могут взаимодействовать временно, тогда как более длинные семена дают стабильные дуплексы с длительным сроком жизни. Эти результаты согласуются с более ранними in vivo и ансамблевыми данными, показывающими, что естественные семенные регионы бактериальных sRNA обычно охватывают 6-12 нуклеотидов и редко образуют полностью комплементарныедуплексы 21,22,23.
Мы также обнаружили, что как мРНК, так и сРНК-мотивы, связывающие Hfq, сильно влияют на дуплексную стабильность. Расширение мотива ААН на мРНК увеличивало сроки жизни связывания, а укорачивание участка связывания на ободе с-РНК значительно дестабилизировало их. Это поддерживает кооперативную модель, при которой дистальная грань Hfq закрепляет аденозин-богатые мРНК мотивы, а край привлекает богатые уридином сРНК для эффективного выравнивания комплементарныхобластей 9,17. В отличие от генетических или репортерных тестов, которые обычно выявляют только продуктивные регуляторные результаты, эта система количественно отделяет стабильность связывания от последующих эффектов, позволяя напрямую сравнивать то, как отдельные особенности последовательностей модулируют продолжительность жизни физического взаимодействия. Сильный мотив связывания по краю особенно важен при необходимости структурных перестановок для пары sRNA-mRNA, поскольку он улучшает удержание РНК наHfq 17. Также считается, что край способствует боковому сканированию мРНКкомплексами sRNA-Hfq 16, что может быть особенно важно, когда целевые участки находятся далеко от области связывания с Hfq. Наши результаты с 15-нтным прокладкой между сайтами связывания подтверждают эту точку зрения, показывая, что дополнительная гибкость между семенной и Hfq-мотивами повышает стабильность пары, возможно, за счёт уменьшения стерических ограничений во время обмена цепями.
Помимо естественных систем, результаты имеют отношение к проектированию синтетических или инженерных сРНК. Большинство существующих стратегий проектирования сосредоточены на оптимизации зоны семени или общего каркаса 23,24,25, но наши данные выделяют дополнительные детерминанты, такие как расстояние между мотивом связывания Hfq и целевой областью. Поскольку признаки последовательности вводятся контролируемо и модульно, анализ предоставляет систематическую экспериментальную основу для тестирования правил проектирования. Этот принцип может направлять будущую конструкцию искусственных сРНК с повышенной эффективностью регулирования.
Хотя этот подход позволяет проводить количественный и воспроизводимый анализ взаимодействий РНК-РНК, у него есть и ограничения. Анализ исследует полностью комплементарные участки, тогда как большинство физиологических взаимодействий сРНК-мРНК содержат несоответствия и выпуклости, которые могут влиять на распознавание и регуляцию. Метод измеряет сроки жизни связывания sRNA-mRNA, но не учитывает напрямую регуляторные последствия, такие как ингибиция трансляции или распад мРНК. Будущие адаптации этого анализа могут включать несовпадающие области семян, разнообразное содержание ГК, а также рибососомы и деградосомы для систематического изучения того, как эти факторы формируют кинетику связывания.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликтов интересов.
Благодарности
Мы благодарим профессора Сару Вудсон за облегчение доступа к приборам для одной молекулы. Это исследование было профинансировано Национальным научным центром Польши (2022/46/E/NZ1/00462 до EMM) и грантом на установку EMBO (IG 5730-2024 для EMM).
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,45 и мю; m-фильтр | Миллипор | HABG04700 | |
| 5 мл Hi-Trap колонна | Цитива | GE17-0408-01 | |
| Ацетон | Merck | 270725 | Класс HPLC |
| Акриламид: Бис-акриламидный раствор | Merck | A2792-100ML | |
| ALEXA555 Сукцинимидил эфир NHS | Термо Фишер | A20009 | |
| Центробежные фильтры Amicon Ultra (NMWL, 3 кДа) | Merck | UFC900308 | |
| Хлорид аммония | Merck | 1330-500G | |
| Ампицилин | Merck | A9518-5G | |
| ATP | Linegal Chemicals | K054.1 | |
| Бета-меркаптоэтанол | Merck | M3148-500ML | |
| BIO-BSA | Merck | A8549-10MG | |
| Колонки Bio-Spin с биогелем P-30 | Био Рад | 7326231 | Для очистки меченой РНК |
| Каталазе | Merck | C9322 | |
| CTP | Linegal Chemicals | K057.4 | |
| Эфир Cy3 HNS | Цитива | PA13105 | |
| Cy5 NHS сукцинимидил эфир | Цитива | PA15101 | |
| ДДТ | Термо Фишер | R0861 | |
| Дихлордиметилсилан | Merck | 440272 | |
| ДНК-олигомеры (трос) — 5′-аминолинкер C6 | Thermo scientific | н/д | |
| Dnase I | Thermo Scientific | 18047019 | |
| EDC | Thermo scientific | PG82079 | |
| EDTA | Merck | ED2SS-1KG | |
| Камера EMCCD | Андор | ||
| Этанол | Merck | 1085430250 | |
| Глюкоза | Merck | D9434-1KG | |
| Глюкозооксидаза | Merck | G2133-50KU | |
| Глицерин | Merck | G5516-1L | |
| GMP | Merck | G8377 | |
| GTP | Linegal Chemicals | K056.4 | |
| HCL | Merck | 1.00318 | |
| Гексан | Термо Фишер | 045652.M1 | |
| Колонка исключения размера SuperLoad 16/60 Superdex 200 | Цитива | GE28-9893-35 | |
| IPTG | Merck | 420322-1GM | |
| KCl | Merck | P9541-1KG | |
| KOH | Merck | 484016-1KG | |
| Магензий хлорид | Merck | M8266-1KG | |
| Метанол и bbsp; | Merck | 34885-M | Класс HPLC |
| Нейтравидин | Термо Фишер | 31000 | |
| Сульфат никеля | Merck | 1067261000 | |
| Никкол | Merck | P8925-1G | |
| Полимераза Q5 | NEB | M0491S | Используется для создания шаблона транскрипции in vitro |
| RNase A | Thermo scientific | EN0531 | |
| RNasin Plus | Promega | N2611 | |
| Ацетат натрия | Merck | S7545-100G | |
| Хлорид натрия | Сигма-Олдрич | S3014-1KG | |
| Спермидин | Merck Life Science | S2626 | |
| База Трис | Thermo Scientific | 17926 | |
| Тролокс | Merck | 238813-1G | |
| Мочевина | Merck | U1250-5KG | |
| UTP | Linegal Chemicals | K055.3 |
Ссылки
- Alquethamy, S., Lalaouna, D., Tree, J. J. What makes a small RNA work. Nucleic Acids Res. 53 (12), 563(2025).
- Prévost, K., Desnoyers, G., Jacques, J. F., Lavoie, F., Massé, E. Small RNA-induced mRNA degradation achieved through both translation block and activated cleavage. Genes Dev. 25 (4), 385-394 (2011).
- Massé, E., Escorcia, F. E., Gottesman, S. Coupled degradation of a small regulatory RNA and its mRNA targets in Escherichia coli. Genes Dev. 17 (19), 2374-2383 (2003).
- Panja, S., Woodson, S. A. Hexamer to monomer equilibrium of E. coli Hfq in solution and its impact on RNA annealing. J Mol Biol. 417 (5), 406-412 (2012).
- Sauter, C., Basquin, J., Suck, D. Sm-like proteins in eubacteria:the crystal structure of the Hfq protein from Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 31 (14), 4091-4098 (2003).
- Andrade, J. M., Pobre, V., Matos, A. M., Arraiano, C. M. The crucial role of PNPase in the degradation of small RNAs that are not associated with Hfq. RNA. 18 (4), 844-856 (2012).
- Panja, S., Schu, D. J., Woodson, S. A. Conserved arginines on the rim of Hfq catalyze base pair formation and exchange. Nucleic Acids Res. 41 (15), 7536-7546 (2013).
- Soper, T. J., Woodson, S. A. The rpoS mRNA leader recruits Hfq to facilitate annealing with DsrA sRNA. RNA. 14 (9), 1907-1917 (2008).
- Updegrove, T. B., Zhang, A., Storz, G. Hfq:the flexible RNA matchmaker. Curr Opin Microbiol. 30, 133-138 (2016).
- Moon, K., Gottesman, S. Competition among Hfq-binding small RNAs in Escherichia coli. Mol Microbiol. 82 (6), 1545-1562 (2011).
- Hussein, R., Lim, H. N. Disruption of small RNA signaling caused by competition for Hfq. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (3), 1110-1115 (2011).
- Papenfort, K., et al. SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay. Mol Microbiol. 62 (6), 1674-1688 (2006).
- Wagner, E. G. H. Cycling of RNAs on Hfq. RNA Biol. 10 (4), 619-626 (2013).
- Roca, J., Santiago-Frangos, A., Woodson, S. A. Diversity of bacterial small RNAs drives competitive strategies for a mutual chaperone. Nat Commun. 13, 2449(2022).
- Tree, J. J., et al. Identification of bacteriophage-encoded anti-sRNAs in pathogenic Escherichia coli. Mol Cell. 55 (2), 199-213 (2014).
- Małecka, E. M., Woodson, S. A. RNA compaction and iterative scanning for small RNA targets by the Hfq chaperone. Nat Commun. 15, 2069(2024).
- Małecka, E. M., Woodson, S. A. Stepwise sRNA targeting of structured bacterial mRNAs leads to abortive annealing. Mol Cell. 81 (9), 1988-1999.e4 (2021).
- Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129(2010).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nat Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nat Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
- Kawamoto, H., Koide, Y., Morita, T., Aiba, H. Base-pairing requirement for RNA silencing by a bacterial small RNA and acceleration of duplex formation by Hfq. Mol Microbiol. 61 (4), 1013-1022 (2006).
- Bandyra, K. J., et al. The seed region of a small RNA drives the controlled destruction of the target mRNA by the endoribonuclease RNase E. Mol Cell. 47 (6), 943-953 (2012).
- Brück, M., et al. A library-based approach allows systematic and rapid evaluation of seed region length and reveals design rules for synthetic bacterial small RNAs. iScience. 27 (9), (2024).
- Han, K., Kim, K. S., Bak, G., Park, H., Lee, Y. Recognition and discrimination of target mRNAs by Sib RNAs, a cis-encoded sRNA family. Nucleic Acids Res. 38 (17), 5851-5866 (2010).
- Sharma, V., Yamamura, A., Yokobayashi, Y. Engineering artificial small RNAs for conditional gene silencing in Escherichia coli. ACS Synth Biol. 1 (1), 6-13 (2012).