Рабочий процесс для живой визуализации и количественного анализа сетей ацентросомных микротрубочек у ооцитов дрозофилы

Summary

Здесь мы представляем протокол, который сочетает живую визуализацию с автоматизированными инструментами анализа динамики микротрубочек в яйцеоците дрозофилы . Этот рабочий процесс позволяет эффективно и воспроизводимо измерять поведение микротрубочек, включая рост, ориентацию, скорость и пространственную организацию, и может адаптироваться к другим типам клеток после оптимизации.

Abstract

Микротрубочка (МТ) цитоскелет необходим для многих клеточных функций, включая форму клетки, полярность, миграцию и деление. Хотя центросомы функционируют как основной центр организации МТ (МТО) в делящихся клетках животных, многие дифференцированные клетки, включая яйцеклетки Drosophila , полагаются на ацентросомные пути для построения МТ-сетей. В отличие от обширных знаний о организации МТ в пролиферирующихся клетках, мало что известно о том, как МТ-сети собираются без центросом. Яйцеклетки Drosophila служат мощной моделью для изучения организации и динамики ацентросомного МТ. Однако их плотная MT-сеть бросает вызов традиционной визуализации. Живые изображения позволяют визуализировать рост и ориентацию MT в реальном времени, однако стандартизированные методы анализа остаются ограниченными. Здесь мы представляем протокол на основе живой визуализации для анализа динамики роста МТ в ооцитах Drosophila с использованием белка End-Binding Protein 1 (EB1)-Green Fluorescent Protein (GFP), дополнительного отслеживающего белка, который маркирует участки активной полимеризации MT. Высокоразрешающая конфокальная микроскопия Airyscan позволяет обнаруживать кометы EB1, а кастомные фиджийские макросы и скрипты на Python обеспечивают упрощённую, воспроизводимую количественную оценку плотности, скорости, длины и ориентации комет. Мы подтвердили этот метод, сравнив контрольные яйцеклетки с теми, что подверглись холодно-индуцированной деполимеризации МТ, а также с патрониновыми мутантами (CAMSAP у человека), консервативным стабилизатором МТ минус конца и ключевым компонентом нецентросомных центров организации микротрубочек (ncMTOC), как положительный контроль нарушенной динамики МТ. Наши анализы выявили регионально-специфическую динамику МТ, включая переднее обогащение комет EB1 и характерные ориентированные смещения, а также подтвердили чувствительность рабочего процесса к обнаружению тонких нарушений роста МТ. Этот подход предоставляет надёжную и удобную для пользователя основу для изучения поведения МТ у ооцитов. Пошаговый протокол позволяет исследовать регуляторы МТ в этом контексте и может быть адаптирован к другим дифференцированным типам клеток, таким как нейроны и эпителиальные клетки, при соответствующей оптимизации. В более широком смысле она поддерживает механистические исследования и генетические скрининги, изучающие, как разнообразные архитектуры МТ лежат в основе специализированных клеточных функций.

Introduction

Цитоскелет микротрубочки (МТ) является важной частью эукариотической клетки, играя важную роль в формировании и поддержании формы, полярности и деления клетки. Динамическое поведение MT-полимеров, характеризующееся ростом и усадкой, имеет решающее значение для многих процессов на основе MT ^1,2. Сборка различных MT-массивов основана на совместном действии центров организации микротрубочек (MTOC), из которых формируются MT, а также на активности различных MT-регуляторных белков, контролирующих устойчивость, ориентацию и динамику MT ^1,2,3. Лучше всего изучаемая МТОС — это центросома, которая генерирует радиальные массивы МТ, важные для регуляции формы и полярности клеток в межфазе, а также для сборки митотического веретена при^{митозе 4,5}. Однако при митотическом выходе или дифференцировке, как в нейронах и эпителиальных клетках, активность центросомного МТОС часто ослабляется, а в крайних случаях, например, в яйцеклетках, её можно^{устранить 6,7}. Это часто связано с клеточно-специфическим ремоделированием цитоскелета МТ, с назначением функции МТОЦ другим клеточным^{участкам 2,3,8}, обычно называемым нецентросомными МТОС (ncMTOCs). Хотя достигнут значительный прогресс в разъяснении организации МТ в митотических клетках, сравнительно мало известно о том, как МТ укрепляются, стабилизируются и пространственно расположены в животных клетках, выходящих из митоза или проходящих дифференцировку². Примечательно, что у живых организмов большинство клеток не делятся; Они вышли из клеточного цикла и/или дифференцировались. Поэтому крайне важно понять, как MT цитоскелет собирается и регулируется в таких условиях. Эти знания необходимы для выяснения, насколько уникальные архитектуры MT созданы для поддержки специализированных клеточных функций.

Яйцеклетка Drosophila melanogaster обеспечивает мощную систему для изучения организации и функции ацентросомного МТ. На промежуточных стадиях оогенеза активность центросомы^{ослаблена на 9}, и МТ образуются из ncMTOCs, локализованных в передне-латеральной коре ооцита (рисунок 1B). Эта MT-сеть необходима для локализации материнских мРНК, белков и органелл, которые, в свою очередь, критически важны для формирования будущих эмбриональных осей и развития^10,11. Предыдущие исследования показали, что ncMTOC ооцитов состоят из белка MT минус конца Patronin, который образует комплекс с белком спектраплакина Shot, закреплённым с кортикальным актиновым цитоскелетом. Было предложено, что МТ растут из коротких фрагментов МТ, образованных разделяющими ферментами, такими как катанин, которые могут служить семенами для дальнейшей полимеризации^{МТ 12}. Похожие механизмы были предложены и в других дифференцированных клетках, таких как^{нейроны 13}, где активность центросомы снижается. Однако механизмы, с помощью которых разрыв создаёт сложные сети МТ, например, в яйцеоците, остаются плохо изученными. До сих пор неясно, образуются ли MT в этих контекстах преимущественно путём перестройки на основе разделения или сочетанием разрыва и de novo нуклеации MT. Сложность MT-сети ооцитов делает её идеальной системой для изучения того, как MT генерируются и организуются вне хорошо известного центросомного контекста. Примечательно, что это также создаёт сложность для визуализации и анализа: плотная сеть МТ внутри ооцита затрудняет выделение отдельных МТ с помощью традиционного иммуно-окрашивающего или статического изображения^{методов 2,14}.

Живые изображения значительно улучшили возможности изучения MT-сетей, позволяя визуализировать события полимеризации MT в реальном времени, предоставляя ключевые представления о динамике и ориентации роста MT. Предыдущие исследования успешно анализировали динамику роста МТ в ооцитах с помощью живой визуализации плюс-энд-маркеров 14,15,16. Однако во многих случаях процедуры анализа изображений, используемые для количественной оценки динамики МТ, описываются лишь кратко, опираются на индивидуальные или лабораторно-специфические реализации или не являются публично доступными, что ограничивает воспроизводимость и более широкое распространение. Наш метод опирается на эти предыдущие подходы, предоставляя полностью документированный, открыто доступный и удобный для пользователя аналитический конвейер, позволяющий стандартизированную количественную оценку параметров роста MT между наборами данных и экспериментальными условиями. В этом протоколе динамика МТ визуализируется в середине ооогенеза, когда цитоскелет МТ организуется ацентросомными МТ-сетями. Растущие MT визуализируются с помощью EB1-GFP — белка отслеживания MT с плюс-эндом ^17,18, и получаются с помощью лазерно-сканирующей конфокальной микроскопии с помощью детектора массива в режиме высокой скорости. Новизна нашего подхода заключается в анализе изображений: полностью документированный, удобный для пользователя пошаговый конвейер, требующий от пользователей выбирать только интересующие регионы. Обработка и количественная оценка изображений осуществляются с помощью индивидуальных фиджийских макросов и скриптов на Python, что позволяет эффективно и воспроизводимо обнаруживать комет EB1 и извлекать параметры, включая ориентацию роста, скорость и пространственную организацию. Эта структура предоставляет стандартизированный и доступный инструмент для сравнения динамики машинных машин в экспериментальных условиях.

В этой рукописи мы применяем этот метод для сравнения роста МТ в контрольных яйцеклетках и в яйцеклетках, деполимеризированных при холодном лечении. Это служит как для подтверждения протокола, так и для поддержки будущих исследований, направленных на анализ роли кандидатных белков в регуляции МТ.

Protocol

1. Генетика мух

ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации МТ в яйцеоците этот протокол использует общедоступный трансген (Таблица материалов), экспрессирующий белок EB1 с меткой GFP (зелёный флуоресцентный белок)¹⁹. EB1-GFP конкретно связывается с растущими MT с концами, выглядя как флуоресцентные «кометы», движущиеся по направлению^{полимеризации 17,18}. Это позволяет визуализировать и количественно оценивать динамику роста МТ, включая ориентацию роста, скорость и пространственное распределение внутри^{яйцеклетки 14,20}.

1. Поддерживайте все штаммы мух на стандартной кукурузно-агаровой среде при 25 °C, используя стандартные методы содержания дрозофилы .
2. Скрещивайте 8–12 самок несовершенственных самок с трансгеном UAS-RNAi, направленным на экспрессию интересующего белка, к 5 самцам генотипа matα4-Gal4-VP16; EB1-GFP.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для упрощения генетических скрещиваний создайте мухоловку, скрещивая линию V32-Gal4 (вставку на вторую хромосому) с линией EB1-GFP (вставку на третью хромосому). Поскольку EB1-GFP находится под контролем промотора UASp, драйвер V32-Gal4 индуцирует экспрессию EB1-GFP, а также любого трансгена UAS-RNAi, введённого при последующих скрещиваниях при необходимости.
3. После вылупления потомства F1 выбирают 10–15 самок желаемого генотипа (младше недели).
4. Переложите самок вместе с 2–3 самцами в свежий флакон с небольшим количеством дрожжевой пасты на поверхности корма. Дрожжевая паста стимулирует оогенез и способствует развитию яйцеклетки. Присутствие самцов обеспечивает спаривание, что также способствует созреванию яйцеклетки и откладке яиц. Поддерживайте мухи при 25 °C в течение 2 дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для изучения роли специфических генов в динамике МТ можно достичь снижения белка с помощью системы UAS/^{GAL4 21} с общедоступным материнским драйвером matα4-Gal4-VP16 (также известным как V32-Gal4; Таблица материалов), которая инициирует экспрессию Gal4 в зародышевой линии из состояний 3–4 оогенеза. Как описано выше, этот драйвер индуцирует экспрессию EB1-GFP, а также конструкций UAS-RNAi, что позволяет истощать интересующие белки только после стадии гермария. Эта стратегия обходит потенциальные ранние функции целевых белков во время начального митотического деления и спецификации яйцеклетки. При проведении таких экспериментов мух следует готовить, как было описано ранее.

2. Вскрытие яичника

1. Анестезируйте самок F1 с помощью CO₂ на стандартной муши-подушке и выберите одну самку для вскрытия.
2. Переместите выбранную самку непосредственно в чашу с стеклянным дном 35 мм (толщиной стекла 0,13–0,15 мм) и нанесите каплю снимочного масла сверху мухи.
3. Расположите муху, обращённую вентральной стороной вверх (крылья направлены вниз). Используя одну пару пинцета, аккуратно держите нижнюю часть груди пинцетом, а вторым пинцетом защипните кутикулу брюшной области с задней части живота.
4. Аккуратно извлекайте репродуктивный тракт, аккуратно вытаскивая его через отверстие.
5. Изолируйте яичники, а затем отдельные яйцеклетки, аккуратно скользя их через масло с помощью пинцета. При манипуляции яичниками всегда держите их за старшие яйцеклетки (стадии 13–14), чтобы не повредить более хрупкие средние стадии (стадии 6–9), которые представляют интерес для визуализации (рисунок 1A,B).
6. Захватите передний кончик яичника, где расположены гермарий и камеры яйцеклетки на ранней стадии (рисунок 1A,B). Применяйте медленное, равномерное натяжение, чтобы разделить отдельные яйочки. При вытягивании появляются яичные камеры на разных стадиях развития. Этот процесс можно повторять несколько раз на каждую яичник для выделения дополнительных^{яйцевариолей 22} (см. видео для демонстрации).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для яйцеклетки, подвергшихся холодной обработке с целью деполимеризации МТ, вскрытия проводились как описано ранее, но с использованием буфера BRB-80 вместо масла для визуализации. Вскрытые яичники затем были перенесены в микротрубки с BRB-80 и инкубированы на льду в течение 15^{минут 23}. После инкубации яичники были перенесены в чашку с стеклянным дном с изображением масла, и протокол был возобновлён с шага 3.1.

3. Живые изображения

1. Поставьте стеклянную чашу на стадию микроскопа, используя подходящий держатель для затвора.
2. Выберите яйцеклетки 7-й или 8-й стадии для визуализации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Яйцеклетки на этих стадиях можно определить по размеру яйцеклетки и расположению ядра. Яйцеклетка явно крупнее отдельных клеток медсестры и занимает примерно треть (стадия 7) до половины (стадия 8) камеры яйцеклетки. Ядро яйцеклетки расположено в передней коре яйцеклетки, рядом с клетками^{медсестры 24}.
3. Избегайте визуализации яйцеклеточных камер с разрывами внешнего слоя фолликулов или другими признаками повреждения, которые могут указывать на механическое нарушение, вызванное щипцами. Для оптимального качества изображения используйте быструю конфокальную систему с высоким соотношением сигнал/шум (SNR) и объективом 63x (1,40 NA, масляное погружение). Убедитесь, что вы следуете критериям выборки Nyquist-Shannnon.
4. Отрегулируйте фокус и определите соответствующую экспозицию, так как она может варьироваться в зависимости от используемой конструкции EB1 (например, разные промоторы или люминесцентные метки) и микроскопической системы. Сигнал должен быть достаточно ярким, чтобы отслеживать динамику комет, но при этом не насыщенным или скрытым фоном флуоресценции.
5. Настройте лазер 488 нм на возбуждение флуорофора GFP (мощность лазера 10%; усиление детектора = 750 В). Выберите соответствующее окно выбросов с интервалом 500–550 нм или эквивалентный фильтр для флуорофора GFP.
6. Запишите таймлапс-фильмы длительностью не менее 4 минут, используя интервал кадров 500 мс (2 кадра в секунду), чтобы получить достаточные данные для отслеживания отдельных концов MT плюс. (Дополнительное видео 1 иллюстрирует репрезентативное получение по таймлапсу, подходящее для последующего анализа отслеживания машинного транспорта).
7. Обрабатывайте полученные изображения с помощью детектора массива в программном обеспечении для микроскопа с стандартной силой фильтра.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После погружения в масло для визуализации вскрытые яичники остаются жизнеспособными до 90 минут. В этот период камеры яиц можно обнаружить без значительных признаков дегенерации. После этого периода следует вскрыть новую самку и подготовить свежие яйцекамеры для^{съёмки 20}.

4. Обработка изображений

Выполните следующий рабочий процесс для генерации графиков и статистики для количественной оценки различных параметров, связанных с динамикой MT. Выполняйте каждый шаг либо автоматически с помощью макроса/скрипта, либо вручную, следуя протоколу (рисунок 2). Все фиджийские макросы, скрипты отслеживания и аналитический код на Python, используемые в этом рабочем процессе, предоставляются в виде дополнительных файлов кодирования 1–7.

1. Предварительная обработка изображений — ШАГ 1
   Следующие этапы готовят необработанные таймлапс-изображения путём коррекции на фотоотбеливание и снижения фоновых шумов, обеспечивая стабильность сигнала для отслеживания. Во-первых, видимость EB1 улучшается с помощью фильтра различий Гаусса (DoG), который функционирует как пространственный фильтр полосного пропуска. Вычитая сильно размытое изображение из слегка размытого, этот процесс подавляет низкочастотный цитоплазматический дымок и высокочастотный пиксельный шум, одновременно изолируя дифракционно-ограниченный сигнал комет EB1. Во-вторых, для усиления растущих кончиков MT применяется временной градиентный фильтр. Стек изображений релсирован для отображения временной размерности на пространственную ось Y. Затем применяется одномерная свёртка с ядром [-1 0 1] для вычисления временной производной для каждого пикселя, выделяя передний край движущихся комет, где интенсивность увеличивается наиболее быстро. Затем стек возвращается к исходным размерам, объединяется в составное изображение и экспортируется для анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг можно выполнить пакетно для всех файлов в папке, перетаскивая макрофайл File1.Step1_MTs_macro.ijm (Дополнительный файл кодирования 1) в Фиджи и запустил макро.
   1. Установка плагина (Одноразовая установка)
      1. Запусти Фиджи. Перейдите к Плагинам > Установке в строке меню.
      2. В файловом браузере выберите файл File_7_Kalman_Stack_Filter_Compiled.jar (Supplementary Coding File 7), предоставляемый с этим протоколом.
      3. Когда вам попросят сохранить плагин, убедитесь, что цель назначения — это папка с плагинами по умолчанию в вашей инсталляционной папке Fiji, и нажмите Сохранить.
      4. Перезапусти Fiji , чтобы завершить установку.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Эта скомпилированная версия плагина идентична встроенной версии Fiji, но устраняет необходимость отдельной установки Java Development Kit (JDK), упрощая процесс настройки.
   2. Коррекция и снятие шума с отбеливателем:
      1. Откройте Fiji, затем откройте каждый файл с помощью плагина импортера Bio-Formats
      2. Компенсируйте затухание флуоресценции со временем, запустив плагин Bleach Correction, используя коррекцию отбеливателя Simple-Ratio (фон = 0).
      3. Запустите скомпилированный фильтр стека Калмана (acquisition_noise = 0,1; смещение = 0,7) для подавления случайного фотонного шума при сохранении истинной динамики сигнала со временем
      4. При желании обрезать итоговый размер времени изображения, чтобы сократить время обработки.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги создают изображение без шума, которое позже появляется как канал 1 в конце шага 1 (4.1.5) (рисунок 3A). Рекомендуется исключать первые 5–10 кадров (временных точек), так как скользящее окно фильтра Калмана лишь частично фильтрует эти начальные кадры.
   3. Различия в улучшении функций Гаусса (DoG):
      1. Повторите изображение из 4.1.2.4 дважды (кликните правой кнопкой мыши по изображению и нажмите Дубликатировать).
      2. Примените плагин Gaussian Blur к одной копии с помощью низкой сигмы (σ = 1).
      3. Примените плагин Gaussian Blur к другой копии с помощью высокого сигма (σ = 8).
      4. Откройте плагин Image Calculator и вычтите изображение с высокой сигмой (= Low – High), чтобы выделить мелкие детали.
      5. Уберите фон, используя фиджийскую программу Math > Subit, и выберите значение (порог DoG = 100), чтобы при необходимости сохранить только истинный сигнал.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги создают изображение разницы гаусса, которое позже появляется как канал 2 в конце шага 1 (4.1.5) (рисунок 3B).
   4. Усиление сигнала EB1-GFP:
      1. Выберите изображение из версии 4.1.2.4 и используйте плагин Reslice с настройками: top, No Interpolation.
      2. Используйте плагин Convolve 2D с ядром [–1 0 1] для улучшения подсказок по MT.
      3. Используйте плагин Reslice с теми же настройками, чтобы восстановить исходные размеры изображения.
      4. ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги сгенерируют изображение с усиленным сигналом EB1-GFP. Это изображение позже появится как канал 3 в конце шага 1 (4.1.5) (рисунок 3C).
      5. Объединение каналов и экспорт изображения:
         1. Объедините образ MT EB1-GFP (4.1.2.4) с изображением Difference of Gaussians (4.1.3.5) и изображением усиления сигнала EB1-GFP (4.1.4.3) с помощью плагина Merge Channels. Убедитесь, что изображение, используемое для дальнейшего анализа, размещено на канале 3 во время процесса слияния.
         2. Сохраните полученный файл в виде .tif файла, используя формат именования: "filename"_processed.tif. Убедитесь, что изображение, используемое для дальнейшего анализа, заканчивается на _processed.tif
2. Регионы, представляющие интерес (ROI) — ШАГ 2
   На этом этапе вдоль переднезадней оси яйцеклетки определяются три ROI: передняя (ROI1), средняя (ROI2) и задняя (ROI3). Выполните эту пространственную сегментацию для анализа динамики МТ в различных областях яйцеклетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг 2 можно выполнить для каждого «имени файла»_processed.tif перетаскивая макрофайл File_2_Step2_MTs_macro.ijm (Supplementary Coding File 2) на Fiji и нажав Run. Макрос подсказывает пользователю нарисовать прямоугольник в яйцеклетке вручную. Область, ближайшая к началу полигона (первый клик), соответствует первому ROI. Выбранная прямоугольная область автоматически будет разделена на равные прямоугольные ROI. Если возврат не сохраняется, следующие шаги будут выполнены на полном изображении.
   1. Определение возврата инвестиций:
      1. Откройте целевой файл через Plugins → Bio-Formats → Bio-Formats Importer.
      2. Используйте инструмент Polygon, чтобы нарисовать интересующую область, охватывающую нужную область.
      3. Добавьте выбранный регион в ROI Manager (нажмите клавишу T).
      4. Повторите шаг 4.2.1, чтобы определить, сколько ROI вам нужно.
   2. Зона измерения и экспорта:
      1. Выберите первый возврат инвестиций
      2. Запустите Analyze → Measure и сохраните значение Area в виде файла с именем: "filename"_processed_RoiArea.csv
         ПРИМЕЧАНИЕ: Имя файла должно совпадать с оригинальным именем изображения и заканчиваться на: _processed_RoiArea.csv
      3. Используйте менеджер ROI для сохранения ROI. Используйте то же имя файла с продление ROI для одного ROI или продление .zip для нескольких ROI.
3. Обнаружение и отслеживание комет EB1-GFP — ШАГ 3
   Используйте плагин^{TrackMate 25} , чтобы обнаружить кометы EB1-GFP и отслеживать их движение со временем.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ШАГ 3 можно применить к каждому «именю файла»_processed.tif перетащив макрофайл File_3_Step3_MTs_macro_tracking.py (Дополнительный кодировочный файл 3) в Фиджи и нажав RUN. Затем выберите папку для обработки. Возвраты инвестиций будут загружаться автоматически, и анализ будет выполняться для каждого файла, генерируя соответствующие результаты для точек и треков. Перед пакетной обработкой рекомендуется проанализировать 2–3 репрезентативных изображения, чтобы визуально убедиться, что стандартные настройки детектора и трекера соответствуют размеру и динамике комет. Если настройки подходят, пользователь может корректировать соответствующие параметры для точного отслеживания наконечников EB1, минимизируя ложноотрицательные и ложноположительные результаты.
   1. Откройте целевой файл через Plugins → Bio-Formats → Bio-Formats Importer
   2. Откройте плагин TrackMate. Выберите ДА, если попросят поменять T и Z.
   3. Выберите Log Detector. Установить диаметр частицы на 0,5 мкм (регулировать по необходимости)
   4. Установите порог качества на 30 (корректируйте по необходимости). Активируйте локализацию субпикселей и предобработку с помощью медианного фильтра.
   5. Уберите дополнительную пятнистую фильтрацию. Выберите метод отслеживания Калмана
   6. Установите начальный радиус поиска 0,5, радиус поиска 0,7 и максимальный разрыв кадров 2 (корректируйте по необходимости: начальный радиус поиска передаёт трекер, радиус поиска определяет, насколько далеко точка может двигаться между кадрами, а максимальный разрыв в кадрах позволяет короткие исчезновения на траектории).
   7. Пропустите фильтрацию треков, которая появится. После завершения трека перейдите в раздел Spots → Export to CSV и наименуйте файл: "filename"_ROI01_spots.csv
   8. ПРИМЕЧАНИЕ: Название файлов должно отражать количество анализируемых ROI. Если используется несколько ROI, сохраняйте каждый выходной файл с соответствующим идентификатором, таким как _ROI01, _ROI02 и т.д.
4. Визуализация данных и количественный анализ — ШАГ 4
   Используйте скрипты Python для обработки данных отслеживания и расчёта ключевых параметров, включая количество комет, скорость, срок службы, угловую согласованность и ориентацию. Эти скрипты генерируют сводные таблицы (CSV-файлы), графики и статистический анализ для поддержки количественного анализа динамики MT (Рисунок 4).
   1. Настройка программной среды:
      1. Установите дистрибутив Python (3.12). Убедитесь, что установлены следующие внешние библиотеки на Python (через pip install pandas, numpy scipy matplotlib seaborn, ipython statsmodels notebook): Pandas и NumPy (для обработки структур данных и численных вычислений), SciPy и Statsmodels (в частности, scipy.stats, для круговой статистики и тестирования гипотез), Matplotlib и Seaborn (для генерации розовых графиков и статистических столбчатых диаграмм), IPython (для инструментов отображения внутри блокнота), Jupyter Notebook (для использования блокнота).
      2. Поместите пользовательские аналитические модули (File_5_MTModule1.py и File_6_MTModule2.py — Дополнительные файлы кодирования 5 и 6) в корневой каталог рядом с аналитическим блокнотом (Файл 4_Step4_MTs_results.ipynb — Дополнительный файл кодирования 4).
      3. Откройте Jupyter notebook, выполнив команду «jupyter notebook» в Python-терминале, и загрузите File 4_Step4_MTs_results.ipynb – Supplementary Coding File 4 notebook.
   2. Входные данные и определение параметров:
      1. Заполните базу данных, чтобы сопоставить биологические репликации с их экспериментальными метаданными.
      2. Предоставьте следующее для каждого эксперимента: Базовое имя: уникальная строка идентификатора, найдённая в названиях файлов, Условие: Экспериментальная группа (например, «Контроль», «Обработан»), Угол коррекции: Угол, необходимый для выравнивания ROI с биологической осью (например, Передний = 0°).
      3. Отрегулировать параметры: экспортировать формат изображения и dpi, построить цвета и определить стандартный размер бин для угловых расчётов
      4. Установите параметры фильтрации данных так, чтобы исключить короткие треки: Минимальная длина трека: треки короче этой длительности отбрасываются
   3. Выполнение аналитического конвейера:
      1. Читайте и выполняйте все кодовые ячейки для обработки необработанных данных отслеживания. Скрипт проходит через список базы данных, выполняя следующие процедурные шаги:
         1. Идентифицируйте все CSV-файлы, специфичные для ROI, связанные с каждым именем базы.
         2. Фильтрует трассы на основе минимальной длины (сохраняются только траектории, сохраняющиеся более 3 кадров), рассчитывает мгновенные скорости, вычисляет общее смещение и применяет корекцию опорного угла ко всем траекториям.
         3. Нормализуйте количество комет по площади ROI (загруженной из метаданных) для расчёта плотности комет.
      2. Агрегировать обработанные данные в основной набор данных (df_all) и вычислять общие сводные статистические данные (средняя скорость, длительность трассы и длина вектора угловой согласованности) для каждого ROI.
      3. Выполните функцию make_combined_rose_panel для генерации сгруппированных розовых графиков. Это создаёт сравнение угловых распределений по панелям бок о бок для всех ROI в каждом экспериментальном состоянии. Выполните create_comprehensive_analysis_plots_enhanced для создания столбчатых диаграмм для скалярных метрик.
      4. Выполните функцию run_angle_analysis_pipeline для анализа конкретной ориентации:
         1. Классифицировать трассы по ориентационным блокам с помощью двух стратегий: Кардинальное биннинг (4 бин шириной 90°: север/передняя, восточная/правая, южная/задняя сторона, запад/левый) и передний/задний биннинг (2 яма с углом 180° впереди против задних).
         2. Вычислите процент треков, движущихся в каждой определённой ориентации на каждый ооцит.
   4. Статистический анализ и генерация результатов:
      1. Итерация по очерченным скалярным метрикам: среднее число кометы на кадр на площадь, средняя продолжительность следа кометы и средняя скорость кометы. Для каждой метрики он выполняет следующие характеристики:
         1. Проведите тесты Крускаля-Уоллиса или Манна-Уитни U для независимых сравнений в экспериментальных условиях.
         2. Проведите тесты Фридмана или Уилкоксона для оценки согласованности между ROI.
         3. Проведите тесты Фридмана и Уилкоксона на знаковый ранг (с использованием метода Пратта) для оценки ориентационных предпочтений (например, Север против Юга) в каждом ROI.
         4. Экспортируйте следующие результаты в каталог результатов : сводные CSV (metrics_table.csv, track_table.csv, roi_metrics.csv), статистические отчёты (например, средняя комета velocity_mwu.csv) и графики (PNG-файлы высокого разрешения).
            ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 4 можно выполнить только на Python. Откройте File_4_Step4_MTs_results.ipynb и прочитайте и выполните все ячейки. Каждая ячейка содержит инструкции для выполнения и соответствующий ожидаемый результат.

5. Статистический анализ:

ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за негауссовского распределения данных отслеживания для всех сравнений использовались непараметрические статистические тесты.

1. Оценить независимые различия между экспериментальными условиями (например, контрольные и обработанные) с помощью теста Манна-Уитни U (для двух групп) или теста Крускаля-Уоллиса, после чего следуют пост-хок парные сравнения Манна-Уитни (для >2 групп)).
2. Оценить ориентационные предпочтения в рамках одинаковой отдачи инвестиций с помощью теста Фридмана (глобальная разница), а затем теста Wilcoxon Signed-Rank (попарно).
3. Обрабатывайте ничьи с нулевой разницей с помощью метода Пратта.
4. Сообщайте попарные сравнения как некорректированные p-значения для сохранения статистической мощности. Используйте предоставленные скрипты для отчёта как исходных, так и скорректированных p-значений, при этом значимость установлена на уровне 0.05. Указывайте все сводные статистические данные как Средние ± стандартные ошибки среднего значения (SEM), если не указано иное.

Results

Этот протокол был успешно использован для анализа динамики роста и полярности МТ в яйцеклетках Drosophila melanogaster на промежуточных стадиях оогенеза с использованием EB1-GFP — белка для отслеживания плюс-концов, который отмечает участки активной полимеризации^{МТ 17,18}. При снимке лазерной сканирующей конфокальной микроскопией EB1-GFP выглядит как яркие, пунктированные «кометы», движущиеся в ориентации роста MT^17,18 (рисунок 3A; Дополнительное видео 1). Отслеживание и количественная оценка этих комет позволяют точно оценить нуклеацию, удлинение и организацию МТ внутри ооцита. Используя этот протокол рабочего процесса, динамика МТ оценивалась в контрольных яйцеклетках и в яйцеклетках, подвергшихся экспериментальным возмущениям сети МТ. В частности, поведение кометы EB1 сравнивалось в трёх условиях: необработанные контрольные яйцеклетки, холодно-обработанные контрольные яйцеклетки и гетерозиготные мутантные ооциты сп-атронином ^12,26. Холодная обработка вызывает деполимеризацию МТ, что позволяет оценить их повторный рост во время восстановления. Гетерозиготные мутантные ооциты сп-атронином (+/patr⁰⁵²⁵²) были включены в положительный контроль для нарушенной динамики МТ. Патронин является консервативным стабилизатором МТ^{минус конца 27} и основным компонентом ncMTOCs в^{яйцеклетках 12} и других^{тканях 2}. Предыдущие исследования показали, что патронин-мутанты, подвергшиеся деполимеризации МТ, демонстрируют значительное снижение числа комет EB1 после^{регенерации 12}. Таким образом, включение гетерозиготных патрониновых мутантов позволило подтвердить метод с учётом известного фона, связанного с дефектом рероста МТ. Ооциты стадий 7–8 были изображены при атенуации центросом, а МТ генерируются через ацентросомные пути.

В соответствии с предыдущими наблюдениями, наибольшая плотность комет EB1 была обнаружена в передней области ооцита с постепенным снижением к задней^{части 14,15} (рисунок 5B; Таблица 1; Дополнительные таблицы 1 и 2). Для различия между подлинными MT-полимеризационными событиями и стационарными или внеплоскими сигналами этот протокол различает общее количество обнаруженных очагов EB1-GFP и подмножество подвижных фокусов. Неподвижная дробь, вероятно, обозначает неподвижные кометы или кометы, движущиеся преимущественно в осевой плоскости (рисунок 5A,B). Анализ длины дорожки MT и скорости роста проводился исключительно на мобильных кометах EB1-GFP, чтобы избежать включения стационарных сигналов или осевых движений, которые могли бы мешать оценке длины и скорости пути. Общие фокусы EB1-GFP и подвижная доля представлены на отдельных графиках для прямого сравнения общего обнаружения и динамического поведения (рисунок 5A,B). В контрольных ооцитах протокол измерял 0,189 ± 0,02 SEM EB1 подвижных комет/мкм² (18,9 EB1 комет/100 мкм²) в передней области, затем 0,064 ± 0,02 SEM и 0,043 ± 0,01 SEM EB1 подвижных комет/мкм² соответственно (6,4 и 4,3 EB1 комет/100 мкм²) (рисунок 5B; Таблица 1; Дополнительные таблицы 1 и 2). В предыдущем^{исследовании 28} комет, измерявших кометы EB1 на той же стадии развития, было обнаружено 48,54 кометы EB1/100 мкм², что выше, чем значения, обнаруженные здесь для подвижных EB1-GFP комет. Однако измеренные значения согласованы с учётом общего числа обнаруженных EB1-GFP комет (рисунок 5A; Таблица 1; Дополнительные таблицы 1 и 2). Раздел «Материалы и методы» этого исследования не уточняет, сколько z-стеков было использовано для изображения яйцеклетки. Поэтому возможно, что в анализ было включено более одного z-стека, что могло способствовать большему числу обнаруженных комет EB1-GFP. Ещё одним фактором, который может влиять на представленные значения, является область ооцита, выбранная для количественной оценки комет. Если бы области интереса были выбраны ближе к самому переднему полюсу, где плотность комет EB1 самая высокая, это могло бы увеличить среднюю плотность кометы по сравнению с представленными здесь измерениями. Тем не менее, полученные здесь результаты того же порядка величины и стабильно отражают снижение плотности комет EB1 в сторону задней области, как ранее^{сообщалось 14,15}.

После холодно-индуцированного восстановления МТ контрольные яйцеклетки показали количество комет, сопоставимых с нелечёнными контролями, что свидетельствует о устойчивом восстановлении МТ. В отличие от этого, в соответствии с предыдущими^{отчетами 12}, патронин-мутанты показали значительное уменьшение числа подвижных EB1 комет в передней области (ROI1) по сравнению с обеими контролями (рисунок 5B; Таблица 1; Дополнительные таблицы 1 и 2). Хотя количество комет в средних и задних областях (ROI 2 и 3) также снизилось, эти различия статистически не были значимы (см. рисунок 5B). Снижение, наблюдаемое здесь, было менее выраженным, чем в анализах на основе нокодазола¹². Это, вероятно, отражает использование гетерозиготных патронинов мутантов, у которых мутировал только один аллель. Кроме того, холодно-индуцированный протокол деполимеризации может не полностью деполимеризовать все МТ, а интервал в 5–15 минут между удалением льда и визуализацией, вероятно, позволяет некоторое нуклеирование и восстановление МТ до сбора данных. В отличие от этого, анализы на основе нокодазола проводятся сразу после инактивации колцемида с помощью микроскопа^{УФ-лазера 12}. Тем не менее, эти результаты демонстрируют, что этот протокол способен выявлять биологически значимые, специфичные для региона изменения в организации МТ. Они также совпадают с обогащением ncMTOCs и патронином, основным компонентом ncMTOC, в передней части яйцеклетки. Более слабое снижение числа комет в средних и задних областях также может отражать развитие исключения ncMTOCs и патронина из задней коры на этих^{стадиях 12}.

Анализ длины дорожки EB1 в контрольных ооцитах выявил более длинные следы кометы в передней области ооцита (0,613 мкм ± 0,04 SEM) и более короткие кометы в средней и задней областях (0,463 мкм ± 0,04 SEM и 0,488 мкм ± 0,05 SEM соответственно) (Рисунок 5C; Таблица 1; Дополнительные таблицы 1 и 2). Это открытие согласуется с предыдущими данными, показывающими, что МТ сохраняются на заднем полюсе короче, чем на переднем, что говорит о том, что МТ на заднем полюсе^{короче 14}. В гетерозиготных патрониновых мутантных оооцитах, обработанных холодом, длина кометы EB1 значительно сократилась по сравнению с контролируемыми группами в передней и задней областях. Аналогичная нестатистически значимая тенденция наблюдалась в среднем регионе (рисунок 5C; Таблица 1; Дополнительные таблицы 1 и 2), что указывает на частичное снижение стабильности MT. В совокупности эти результаты подтверждают известную роль патронина как стабилизатора МТ минус-конца и согласуются с предыдущими наблюдениями в клетках, культивируемых дрозофилой, где потеря патронина приводит к укорочению веретена^{МТ 12,27}. Эти результаты также подчёркивают чувствительность этого протокола к обнаружению тонких, но биологически значимых возмущений в динамике МТ.

При измерении скорости кометы EB1 в контрольных ооцитах анализ выявил средние скорости 0,208 ± 0,01 мкм/сек, 0,207 ± 0,01 мкм/сек и 0,202 ± 0,01 мкм/сек в передней, средней и задней областях соответственно (рисунок 5D; Таблица 1; Дополнительные таблицы 1 и 2), что соответствует предыдущим работам^14,15. Контрольные яйцеклетки показали небольшое снижение скорости роста МТ от передней к задней области. Это может отражать обогащение ncMTOCs, а также потенциально других неидентифицированных микротрубочков-ассоциированных белков (MAPs) в передне-латеральных областях, которые способствуют росту и расширению MT, тем самым способствуя наблюдаемому уменьшению заднего тела. В ооцитах, обработанных холодом, патронин-гетерозиготные мутанты показали нестатистически значимую тенденцию к незначительному снижению скорости роста МТ по сравнению с контрольными группами, хотя эта разница не достигла статистической значимости (Рисунок 5D; Таблица 1; Дополнительные таблицы 1 и 2). Это открытие согласуется с предыдущими наблюдениями у нейрональных стволовых клеток Drosophila, экспрессирующих патрониновых ^{мутантов 29}.

Локализация ncMTOCs в передне-латеральной области яйцеклетки, а также их исключение из задней части приводит к тому, что большинство MT выращиваются с их минусовыми концами, закреплёнными на передне-латеральной коре. В результате внутри яйцеклетки устанавливается антеро-задний градиент МТ с небольшим смещением ориентации: 60% МТ растут к задней части и 40% — к передним¹⁴. Наш протокол успешно обнаружил это смещение в контрольных яйцеклетках во всех областях ооцита (рисунок 5E). Смещение ориентации МТ было более выраженным в задней области, как ранее^{сообщалось 14}. Примечательно, что это заднее обогащение ориентационного смещения было утрачено после холодного лечения в контрольных и гетерозиготных патрониновых мутантных ооцитах (рисунок 5E,F). В контрольных яйцеклетках, обработанных холодом, ориентация МТ сместилась в сторону переднего роста во всех областях. Этот сдвиг проявился как тенденция в передних и средних областях и стал статистически значимым в задней области (см. рисунок 5F). Одно из возможных объяснений этой потери смещения в сторону задней стороны заключается в том, что при холодной обработке недавно полимеризированные МТ могут потребовать времени для ассоциации с MAPs, такими как моторные белки, которые способствуют стабилизации и/или перекрёстной сшиване MT. Задержка рекрутирования этих факторов может ухудшать усиление заднеориентированных МТ. В заключение, этот протокол позволяет проводить чувствительный количественный анализ роста, длины, скорости и ориентации МТ внутри яйцеклетки. Он надёжно обнаруживает регионально-специфические, биологически значимые изменения динамики МТ, в соответствии с предыдущими исследованиями, и демонстрирует чувствительность к разрешению тонких различий в поведении МТ, что иллюстрируется наблюдениями у гетерозиготных мутантовп-атронина.

Рисунок 1: Ооогенез Drosophila melanogaster (A) Обзор оогенеза в яичнике Drosophila. Каждый яичник содержит 12–16 яйцеклетников, которые функционируют в качестве линии производства яйцеклеток. Оогенез начинается в гермарии, где 2–3 зародышевые стволовые клетки делятся асимметрично, образуя стволовую клетку и дочернюю клетку, которая начинает дифференцироваться. Эти клетки проходят 4 митотических деления для образования 16-клеточной кисты, соединённой кольцевыми каналами. Из этих клеток одна становится яйцеклетками, а остальные служат медсестрой, поддерживая рост и развитие яйцеклетки до стадии 14 на заднем конце. (B) Схема камеры яйца дрозофилы стадии 9. МТ образуются из ncMTOCs, локализованных в передне-латеральной коре, которые исключаются с задней стороны^{ооцита 12}. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Диаграмма протокольного рабочего процесса.Обзор основных этапов — от диссекции яичников и живой визуализации до отслеживания комет и количественного анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Репрезентативные изображения, полученные при обработке ооцитов 7–8 стадий. (A-E) Репрезентативные изображения, иллюстрирующие процесс обработки изображений на этапе 1, применяемые к ооцитам 7–8 стадий из контрольных, контрольных, холодно-обработанных и гетерозиготных патронатов⁰⁵²⁵² ооцитов, обработанных холодом. Каналы — это репрезентативное изображение из максимальной проекции в 2 кадра из 150-кадрового таймлапс-фильма, полученного с частотой 0,5 с за кадр. (A) Канал 1, который соответствует созданию дешумированного изображения из соответствующего изображенного ооцита. (B) Канал 2, что соответствует генерации разницы гауссового изображения. (C) Канал 3, который соответствует генерации изображения, в котором сигнал комет EB1-GFP был усилен для показа кончиков комет. (D) Слияние каналов 2 и 3, что помогает визуализировать полученные кончики кометы при обработке канала 2. (E) Траектории комет EB1-GFP, генерируемые из таймлапса C в FIJI с использованием плагина Temporal Color Code для иллюстрации динамики MT. Цветовой код показывает временную проекцию для 20 кадров (0,50 с между кадрами). Шкала = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Скриншот раздела в блокноте Jupyter STEP 4. Блокнот состоит из ячеек Markdown, которые предоставляют самопонятные инструкции, за которыми следуют кодовые ячейки, выводящие результаты и логи в реальном времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: Анализ динамики комет EB1-GFP в контрольных и холодно-обработанных яйцеклетках стадии 7-8 .Данные представляют среднее ± SEM на ROI (ROI1–ROI3) для контроля, контроля холодно-обработанных и патронина⁰⁵²⁵² холодно-обработанных яйцеклетки. Измерения комет EB1-GFP были получены на основе таймлапс-изображений, обработанных в FIJI; если не указано иное, анализы проводились на изображениях, обработанных на канале 3. Общее количество комет EB1-GFP было проанализировано по изображениям Channel 2 (изображение DoG). Статистическая значимость оценивалась с помощью теста Крускаля–Уоллиса, за которым следовали постфактические сравнения Манна–Уитни, или теста Фридмана, а затем тестов с парами Уилкоксона, по мере необходимости (p < 0,05; p < 0,001; p < 0.0001). (A) Рассеяная точечная диаграмма, показывающая среднее количество общих номеров комет EB1-GFP. (B) График рассеяния, показывающий среднее количество подвижных EB1-GFP комет. (C) Рассеяная точечная диаграмма, показывающая среднюю длину дорожки кометы EB1-GFP. (D) Рассеяная точечная диаграмма, показывающая среднюю скорость кометы EB1-GFP. (E) Роузовые графики, показывающие ориентацию дорожек EB1-GFP внутри ROI1–ROI3 в контрольных (n = 14), контрольных холодно-обработанных (n = 12) и патронина⁰⁵²⁵² холодно-обработанных (n = 11) ооцитах. Средний процент каждого трека на яйцеклетку, ориентированный на переднюю (A) или заднюю (P), указывается для каждого состояния и ROI. (F) Столбчатая диаграмма, показывающая средний процент углов следа кометы EB1-GFP, ориентированных к передним и задним сторонам яйцеклетки. Проценты рассчитывались на каждый ооцит и отражают относительное распределение ориентации кометы внутри каждой ROI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Метрика	ROI	Контроль (n=14)	Контроль холодной обработкой (n=12)	патронин05252 холодно обработанный (n=11)
Общее число кометы EB1-GFP (#/μm2)	ROI 1 (передний)	0,667 ± 0,18	0,691 ± 0,20	0,570 ± 0,17
	ROI 2 (в центре)	0,394 ± 0,11	0,532 ± 0,15	0,400 ± 0,12
	ROI 3 (задняя часть)	0,353 ± 0,09	0,561 ± 0,16	0,378 ± 0,11
Подвижное число кометы EB1-GFP (#/μm2)	ROI 1 (передний)	0,189 ± 0,02	0,175 ± 0,03	0,099 ± 0,03
	ROI 2 (в центре)	0,064 ± 0,02	0,091 ± 0,02	0,056 ± 0,02
	ROI 3 (задняя часть)	0,043 ± 0,01	0,104 ± 0,03	0,047 ± 0,02
Длина дорожки кометы EB1-GFP (мкм)	ROI 1 (передний)	0,613 ± 0,04	0,621 ± 0,03	0,478 ± 0,07
	ROI 2 (в центре)	0,463 ± 0,04	0,535 ± 0,03	0,410 ± 0,05
	ROI 3 (задняя часть)	0,488± 0,05	0,543 ± 0,04	0,393 ± 0,05
Скорость кометы EB1-GFP (мкм/сек)	ROI 1 (передний)	0,208 ± 0,01	0,198 ± 0,01	0,188 ± 0,01
	ROI 2 (в центре)	0,207 ± 0,01	0,199 ± 0,01	0,186 ± 0,01
	ROI 3 (задняя часть)	0,202 ± 0,01	0,194 ± 0,01	0,177 ± 0,01

Таблица 1. Сводка измерений кометы EB1-GFP в передних–задних областях в анализируемых яйцеклетках. Измерения были получены на основе контрольных, контрольных, обработанных холодом и гетерозиготных патронатов⁰⁵²⁵² ооцитов, обработанных холодом. Области интереса были определены как ROI1 (передний), ROI2 (средний) и ROI3 (задний).

Дополнительная таблица 1. Статистический анализ измерений комет EB1-GFP между экспериментальными условиями. P-значения показывают различия между контрольными, контрольными холодными и гетерозиготными патронитами ⁰⁵²⁵², обработанными холодом для каждого ROI (ROI1-ROI3). Глобальные сравнения между тремя состояниями проводились с помощью теста Крускаля–Уоллиса, а затем последовали попарные пост-хок сравнения Манна–Уитни.  Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл

Дополнительная таблица 2. Статистическое сравнение измерений комет EB1-GFP между ROI в каждом экспериментальном состоянии. P-значения указывают на различия между ROI1 (передняя), ROI2 (средняя) и ROI3 (задняя часть) внутри контрольных, контролируемых холодных и гетерозиготных патронатов⁰⁵²⁵² . Общие различия между ROI в каждом состоянии оценивались с помощью теста Фридмана. Впоследствии были проведены парные сравнения между ROI с помощью тестов Уилкоксона с парами со знакомым рангом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл

Дополнительное видео 1. Таймлапс-визуализация белка с плюс-эндом отслеживания EB1-GFP в контрольной стадии 7–8 ооцита, демонстрирующая репрезентативное приобретение, подходящее для последующего анализа МТ (связанного с рисунком 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл

Дополнительный файл кодирования 1: File_1_Step1_MTs_macro.ijm. Макрос Fiji/ImageJ для предварительной обработки изображений. Он автоматизирует коррекцию фотоотбеливания, фильтрацию Калмана и фоновый вычитание с помощью фильтра различий Гаусса (DoG). Также применяется временное градиентное усиление (слайсинг и одномерная свёртка) для остроты передних краёв наконечников MT для улучшения точности отслеживания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл

Дополнительный файл кодирования 2: File_2_Step2_MTs_macro.ijm. Макрос Fiji/ImageJ для полуавтоматического определения региона интереса (ROI). Он предлагает пользователю определить границу яйцеклетки и автоматически сегментирует отбор на равноудаленные зоны (в нашем примере три зоны: передняя, центральная и задняя), чтобы обеспечить региональную стратификацию анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл

Дополнительный файл кодирования 3: File_3_Step3_MTs_macro_tracking.py. Python-скрипт (исполняемый внутри Fiji/ImageJ), который автоматически отслеживает комет EB1 с помощью Trackmate. Он пакетно обрабатывает заранее обработанные изображения, обнаруживает кометы с помощью заданных параметров качества, связывает их по траекториям и экспортирует исходные координаты в CSV-файлы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл

Дополнительный файл кодирования 4: File_4_Step4_MTs_results.ipynb. Jupyter Notebook, который служит основным интерфейсом для количественного анализа. Он загружает исходные данные отслеживания, выполняет конвейер анализа и генерирует все конечные результаты, включая розовые графики, статистические сводные таблицы и сравнительные диаграммы плотности, скорости и срока службы комет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл

Дополнительный файл кодирования 5: File_5_MTModule1.py. Пользовательский модуль на Python, содержащий базовые функции полезности, используемые для извлечения данных и базовых геометрических вычислений. Он включает функции поиска файлов ROI, расчёта мгновенных скоростей и вычисления базовых угловых смещений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл

Дополнительный файл кодирования 6: File_6_MTModule2.py. Пользовательский модуль на Python, содержащий продвинутые функции анализа и визуализации. В нём размещены алгоритмы конвейера анализа ориентации (кардинальное против осевого биннинга), надёжного статистического тестирования (метод Фридмана/Уилкоксона с методом Пратта) и генерации полярных (розовых) графиков качества публикации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл

Дополнительный файл кодирования 7: File_7_KalmanStackFilterCompiled.jar. Для этапов снижения шума в макросе предварительной обработки требуется скомпилированный плагин Java Kalman Filter для Fiji/ImageJ. Эта автономная версия устраняет необходимость отдельного Java Development Kit (JDK), упрощая программную настройку пользователя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл

Discussion

Живое изображение динамики МТ в ооцитах представляет собой уникальные задачи, поскольку для извлечения значимой информации необходимы высококачественные наборы данных и количественный анализ. В то время как предыдущие исследования сообщали о подходах к живой^{визуализации} 14,15,16, этапы анализа изображений часто сильно персонализированы, а протоколы не обеспечивают достаточной детализации для воспроизводимости. В результате исследователи без обширных навыков в визуализации или вычислениях могут столкнуться с препятствиями при воспроизведении этих анализов. Для решения этих проблем был разработан упрощённый рабочий процесс, сочетающий высокоразрешающую живое изображение Airyscan с удобными автоматизированными макросами и скриптами. Этот конвейер позволяет эффективно обнаруживать и отслеживать комет EB1, а затем проводить количественный анализ ориентации, скорости и пространственной организации MT. Минимизируя ручное вмешательство и предоставляя чёткие, пошаговые инструкции, рабочий процесс способствует доступности и воспроизводимости анализа МТ динамики в яйцеклетках.

Вскрытие яичника и подготовка образца — важнейшие первые шаги. Яйцеклетки необходимо тщательно вскрыть, чтобы избежать механических повреждений, а длительность визуализации должна быть ограничена 90 минутами для поддержания^{жизнеспособности 20} минут. Выбор стадий важен: после середины оогенеза яйцеклетка увеличивается в размере и накапливает желток в цитоплазме, что усложняет визуализацию сигнала EB1 после 9-й стадии. Поэтому визуализация выше 9-й стадии не рекомендуется²⁰. Кроме того, для воспроизводимых количественных оценок, когда возможно, предпочтительнее яйцеклетки сопоставимого размера, так как это гарантирует, что определённые области интереса соответствуют эквивалентным положениям переднего и заднего в различных образцах.

Контроль температуры необходим для воспроизводимости. Муховые приклады следует поддерживать при стандартных условиях культуры (25 °C) для поддержания нормального развития и стабильной экспрессии EB1-GFP, особенно при использовании системы GAL4/UAS, чувствительной к колебаниям температуры. Стабильность температуры во время съёмки не менее важна, так как изменения могут влиять на динамику МТ. Хотя камера с контролируемой температурой не требуется, рекомендуется избегать колебаний температуры при получении.

Для захвата изображений была выбрана конфокальная визуализация детектора решетки за высокую чувствительность и улучшенную SNR, что минимизировало необходимость в постприобретении шума. Объективы с высокой численной апертурой (как можно выше) в сочетании с соответствующим сопоставлением показателей преломления следует использовать для максимизации бокового и осевого разрешения, что критически важно для разрешения отдельных комет в плотных сетях. Кроме того, критерии отбора проб^{Найквиста-Шеннона 30} следует соблюдать в XYZ и времени, чтобы избежать потери точности при отслеживании комет. Не менее важно тщательное подбор плоскости изображения вдоль оси z. Слишком глубокая съёмка приводит к потере флуоресценции из-за рассеяния света, тогда как ограничение захвата поверхностью коры не позволяет полностью отразить динамику комет EB1. Наиболее информативные данные получаются на промежуточной z-позиции. Яйцеклетки, в которых ядро находится в выбранной плоскости, следует избегать, поскольку ядерный компартмент вытесняет большую часть цитоплазмы и не имеет дорожек EB1, что снижает количество обнаруживаемых комет.

Хотя он оптимизирован для конфокальной визуализации на основе детекторов массива, этот конвейер анализа не зависит от аппаратного обеспечения и совместим с другими методами, такими как конфокальная микроскопия с вращающимся диском. Однако пользователям следует учитывать, что системы с низким NA или SNR могут потребовать корректировки параметров предварительной обработки макроса (например, шумостойкость/сигмы DoG), что может привести к снижению плотности обнаружения комет по сравнению со значениями, представленными в данном исследовании. Тем не менее, хотя абсолютные значения могут различаться между системами, относительные тенденции, наблюдаемые между экспериментальными условиями и ROI, как ожидается, останутся устойчивыми.

Учитывая большую трёхмерную структуру яйцеклетки, двумерная визуализация захватывает только оптический участок MT-сети. В результате кометы, круто движущиеся вдоль оси z, могут выходить из фокальной плоскости, что может привести к недооценке срока службы следа и абсолютной скорости (поскольку измеряется только xy-компонента вектора скорости). Однако высокоскоростная 3D-объемная съёмка всей яйцеклетки потребует меньшего поля зрения (FOV), меньшего времени экспозиции и более быстрого отклика детектора, что снижает SNR и распределяет время обнаружения между несколькими z-срезами, что снижает временное разрешение, необходимое для отслеживания быстрых комет EB1. Для снижения недвижущихся комет и расфокусированных артефактов были применены сверточные и фильтры с минимальной длительностью треков (исключая треки < 3 кадров), чтобы удалить переходные пятна, проходящие по фокальной плоскости. Кроме того, поскольку это геометрическое ограничение действует равномерно в экспериментальных условиях, наблюдаемые относительные различия в плотности, скорости и ориентации комет, остаются устойчивыми. Хотя новые методы, такие как микроскопия светового поля, в идеале должны одновременно захватывать всю 3D-структуру, они пока не широко доступны. Тем не менее, значения, измеренные для всех параметров MT-динамики, соответствуют предыдущим отчетам, что указывает на то, что этот протокол подходит для исследования динамики MT в различных экспериментальных установках.

Перед использованием макросов в этом протоколе рекомендуется вручную обработать первые несколько изображений, чтобы убедиться, что параметры программного обеспечения корректно оптимизированы. Такие факторы, как разрешение изображения, увеличение, отношение сигнал/шум, частота кадров и наличие данных в одноплоскости или z-стеке, могут влиять на точность отслеживания. Итеративно корректируя параметры при визуальном осмотре полученных треков, чтобы минимизировать ложноположительные и ложноотрицательные результаты. После оптимизации применяйте параметры последовательно по всем наборам данных для обеспечения воспроизводимости.

Наконец, следует отметить некоторые ограничения в биологической интерпретации. EB1-GFP избирательно маркирует растущую MT плюс концы и, следовательно, сообщает о участках активной полимеризации MT, а не о всей популяции MT. Стабильные неполимеризующие МТ, присутствующие в период визуализации, не обнаруживаются этим методом. Хотя это ограничение менее ограничительно в ооцитах среднего оогенеза, где большинство МТ очень динамичны, его следует учитывать при применении протокола к другим типам клеток с значительными стабильными популяциями МТ, например, к^{нейронам 31}.

В заключение, этот рабочий процесс позволяет проводить высокоразрешающий, количественный анализ динамики МТ в яйцеклетках Drosophila . Интегрируя оптимизированную диссекция, конфокальное живое изображение детектора массива и автоматизированные инструменты анализа, он предоставляет строгий, но доступный метод для исследования MT-регуляторов в ацентросомном контексте. Хотя в первую очередь валидированы в яйцеклетках, принципы этого подхода адаптируются после оптимизации к другим типам клеток, включая неделящиеся клетки, такие как нейроны и эпителии, предоставляя масштабируемую платформу для генетических скринингов и механистических исследований организации МТ.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
EB1::GFP	From Dr. Antoine Guichet, CNRS, Institut Jacques Monod, France		Генотип: w; +/CyO; UASp-EB1::GFP/TM3
Glass-bottom Petri dishes	MatTek	P35G-1.0-14-C
Matα4-Gal4-VP16	Bloomington Drosophila Stock Center	7062	Генотип: w[*]; P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2H
Oil 10S, VOLTALEF	VWR Chemicals	24627.188
Patronin mutant	Bloomington Drosophila Stock Center	16647	Генотип: y[1] w[67c23]; P{y[+mDint2] w[+mC]=EPgy2}Patronin[EY05252]/CyO
w1118	Bloomington Drosophila Stock Center	3605
Zeiss LSM 980 with Airyscan 2	Zeiss