Методическая статья

Эксперименты по иммуноокрашиванию и проникновению красителя для определения белков соединения ядра с плиссированными септатами в эмбриональном эпителии дрозофилы

DOI:

10.3791/69986

⸱

27 февраля 2026 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Case Western Reserve University, 2Admissions Counselor, Case Western Reserve University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эти протоколы описывают, как охарактеризовать организацию и окклюзионную функцию соединений с плиссированными перегородками в контроле и мутантном эмбриональном эпителии Drosophila.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель этих протоколов — оценить организацию и барьерную функцию плиссированных септатных соединений (pSJ) в эпителиальных тканях эмбрионов Drosophila, полученных из эктодермальности. pSJ образуют окклюзионный барьер на латеральной мембране эктодермальных тканей, включая эпидермис, слюнные железы, трахею и заднюю часть кишечника, который функционально схож с плотным соединением в тканях позвоночных. У дрозофилы выявлено 30 белков, необходимых для формирования pSJ. Белки core pSJ изначально локализованы вдоль длины латеральной мембраны, но к 16-й стадии эмбриогенеза сильно обогащаются в апикальной латеральной области соединения, непосредственно базально от соединения адгеренов. К поздней стадии 15 эмбриогенеза эти ткани имеют полностью функционирующий окклюзионный переход. В этой статье будут описаны протоколы иммунокрашивки и проницаемости красителя, которые можно использовать для изучения организации и функций pSJ в контрольных и мутантных эмбрионах. Успешное применение этих протоколов позволяет продемонстрировать окклюзионную функцию pSJ и проверить, кодирует ли неизвестный ген основной компонент соединения.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Критически важной функцией эпителиальных тканей является разделение отдельных областей внутри организма. Создание этих уникальных сред жизненно важно для функционирования органов и защиты организма от внешних угроз. Окклюзионное соединение, образовавшееся между клетками эпителия, отвечает за создание и поддержание этих условий, предотвращая поток парацеллюлярных растворённых веществ между апикальной и базальной сторонами этогоэпителия 1,2. У позвоночных организмы окклюзионное соединение называют узким соединением, а у беспозвоночных, таких как Drosophila melanogaster 1,3 — септатным соединением (SJ). У членистоногих существует два типа SJ, различающихся по распределению тканей иультраструктуре 4. Складчатые септатные соединения (pSJs) встречаются в тканях, образованных эктодермально, таких как эпидермис, слюнные железы, трахея и задняя часть кишечника. Они характеризуются ультраструктурно лестничным массивами электронно-плотного материала в внеклеточном пространстве между клетками, который находится непосредственно базально от соединенияадгеренов 3,5. В отличие от этого, гладкие септатные соединения (sSJ) обнаруживаются в энтодермальных тканях, таких как средняя кишечница и мальпигиевые канальцы, и не имеют электронно-плотных септ междуклетками 6.

Генетические исследования на Drosophila выявили 30 белков, необходимых для структуры и функции pSJ, а также дополнительные белки, находящиеся в соединении, но, по-видимому, не выполняют функции в их формировании или поддержании (рассмотрено в7). На основе этих анализов учёные разделили белки SJ на три класса. Основные белки SJ находятся в соединении и необходимы для установления и поддержания соединения. Семнадцать белков были идентифицированы как белки Core pSJ, включая Coracle (Cora), Neurexin IV, комплемент-связанный с макроглобулином (Mcr), Kune-kune и ATPазуальфа 8,9,10,11,12. Девять белков были идентифицированы как вспомогательные pSJ-белки, необходимые для установления и/или поддержания соединения, но не обязательно находящиеся в этом соединении. В этот класс входят белки, такие как Rab5, Rab11 иCoiled 13,14. Наконец, белки-резиденты pSJ локализируются в pSJ, но они ненужны для установления и поддержания соединения. Примеры четырёх участников этой группы включают Discs Large и Fasciclin III15, 16.

Формирование функционально цельного pSJ — это многоступенчатый процесс, который начинается в середине эмбриогенеза, когда все основные белки pSJ полностью экспрессируются. Некоторые основные гены pSJ экспрессируются матерински, но все демонстрируют сильную зиготную экспрессию к стадии 1217. На 12-й стадии основные белки pSJ локализуются вдоль всей длины латеральной мембраны. На стадиях 13–16 белки pSJ ядра эндоцитозируются и затем возвращаются обратно в латеральную мембрану в области pSJ. Для этого процесса требуется сопутствующие белки pSJ, включая Rab5 и Rab1114. К 16-й стадии основные белки pSJ плотно локализованы в области pSJ вдоль латеральной мембраны. В соответствии с этими наблюдениями, полная окклюзионная функция соединения происходит на поздней стадии 15 эмбриогенеза12. Лучше всего это продемонстрировать с помощью анализа проницаемости красителя. До образования соединения через параклеточное пространство между клетками может пройти декстранная шарика мощностью 10 кДа, помеченная флуоресцентным маркером, такой как родамин. Если маркированный декстран ввести в гемокоэль, он быстро накапливается в просвете трубчатых эпителий, таких как трахея, слюнная железа и задняя часть кишечника. После физиологического сжатия pSJ в конце 15-й стадии введенный декстран ограничивается базальной стороной эпителия и не может накапливаться в просвете (апикальном домене) этих органов.

Белки core pSJ имеют характерную особенность, при которой каждый белок core pSJ требует присутствия всех остальных основных pSJ-белков для правильной субклеточнойлокализации 18,19. Эта взаимозависимость в формировании pSJ является определяющей чертой основных белков pSJ и лежит в основе протоколов, представленных в этой статье. Мутации в основных или вспомогательных pSJ-генах приводят к эмбриональной летальности и характеризуются неправильной локализацией других белков pSJ core вдоль латеральной мембраны у эмбрионов 16-й стадии, а не точной локализацией в их нормальной апикальной латеральной области. В отличие от этого, мутации в генах, резидентных в pSJ, не приводят к неправильной локализации белков pSJ core15. Функциональное нарушение pSJ в мутациях генов pSJ основного и вспомогательного pSJ выявляется при накоплении меченого декстрана 10 кДа в просвете трахеи, слюнных желез или задних кишечников у мутантных эмбрионов 16 или 17 стадии. Наконец, отличительной чертой между ядром и вспомогательным pSJ-белком является их субклеточная локализация. Основные белки pSJ тесно связаны с pSJ после их формирования, тогда как вспомогательные pSJ-белки критически важны для сборки соединения, но не обязательно находятся в этом соединении. Лучшие примеры вспомогательных pSJ-белков — Rab5 и Rab11. Оба — это цитоплазматические белки, которые помогают перемещать груз от плазматической мембраны к ранней стадии и перерабатывать эндосомы, а затем обратно к плазматическоймембране 14. Чтобы определить, является ли новый потенциальный белок pSJ основным или вспомогательным белком, обычно полезно создать специфическое антитело или экспрессировать флуоресцентно помеченный рекомбинантный белок для определения локализации этих белков в разные моменты процесса созревания pSJ.

Цель этих протоколов — однозначно отличать потенциальные основные и вспомогательные pSJ-белки от белков, состоящих в pSJ. Несколько исследований выявили дополнительные, неокклюзирующие роли белков pSJ в процессе развития, включая роль в морфогенезе и апикально-базальнойполярности 17,20,21,22. По мере роста интереса к биологии pSJ и выявления новых потенциальных белков pSJ, простые и легко интерпретируемые протоколы, представленные здесь, помогут исследователям правильно охарактеризовать организацию pSJ и окклюзионные функции этих белков. В литературе описано множество дополнительных экспериментальных подходов к характеристике белков pSJ, включая восстановление флуоресценции после фотоотбеливания (FRAP) и трансмиссионную электроннуюмикроскопию 6,23. Хотя эти подходы часто очень полезны, представленный здесь иммуно-окрашивающий анализ обеспечивает быструю визуализацию локализации белка pSJ без дорогостоящих и трудоёмких ультраструктурных методов, тогда как анализ проницаемости красителя предлагает функциональное измерение целостности pSJ, недостижимое только визуализацией. Кроме того, эти анализы могут проводиться с использованием стандартного лабораторного оборудования, такого как качественный флуоресцентный микроскоп и примитивная микроинъекционная система. Следует отметить, что эти анализы оптимизированы для анализа эмбрионов Drosophila стадии 16 и не подходят для оценки организации или функции sSJs.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Стадия эмбрионов

  1. Скрещивайте здоровых самцов и самок соответствующих генотипов (см. Таблицу материалов для примеров) и поместите их в клетки для сбора эмбрионов с тарелками свежего яблокового сока, смазанными дрожжевым соусом. Дайте мухам привыкнуть к клеткам для сбора яиц на день-два, прежде чем начать сбор эмбрионов.
  2. Соберите эмбрионы на тарелках с яблочным соком и дайте им развиться до стадии 16 (~13 часов после откладки яиц (AEL) до 16 ч AEL при 25 °C). Дайте взрослым особям откладывать оплодотворённые яйца в течение 1-2 часов на тарелках с яблочным соком, затем вынимите пластину из клетки для сбора яиц, а затем выдержите их до 13-16 AEL при 25 °C. В качестве альтернативы собрать эмбрионы ночью при 25 °C, а затем выбрать эмбрионы 16-й стадии до фиксации или во время визуализации после фиксации и иммунокрашивки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбриональное стадирование можно оценить по морфологии кишечника, которую проще всего визуализировать с помощью автофлуоресценции в ультрафиолетовом спектре (то есть канал DAPI). У эмбрионов на 16-й стадии кишечник выглядит как три параллельных длинных овала, перпендикулярных длинной оси тела (рисунок 1H).

2. Фиксация и иммунная окрашивание эмбрионов

  1. Соберите корзину для сбора эмбрионов из нейлоновой сетки (сетка 120 мм). Закройте отверстие и резьбу корзины нейлоновой сеткой, затем прикрутите крышку.
  2. Аккуратно снимите эмбрионы с тарелки для яблочного сока кистью и раствором для промывания эмбрионов. Вылейте смесь для эмбрионов в корзину для сбора эмбрионов и прополосните эмбрионы дистиллированной водой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, направляйте воду внутрь корзины для сбора эмбрионов и не разбрызгивайте эмбрионы по стенкам корзины, что может привести к потере эмбриона из-за склеяния.
  3. Дехорионируйте эмбрионы, погружая корзину для сбора эмбрионов и их в лоток с 50% коммерческим отбеливателем (конечная концентрация 3,75% гипохлорита натрия). Перемешайте эмбрионы в отбеливателе и держите их погруженными 3-5 минут при комнатной температуре. Вынимите корзину из отбеливателя и прополосните эмбрионы дистиллированной водой, снова направляя поток воды внутрь корзины.
  4. Приготовьте фиксационный флакон, добавив равные объемы свежего раствора параформальдегида 4% и гептана в сцинтилляционный флакон объемом 20 мл. Получите параформальдегидный раствор, растворив соответствующее количество параформальдегида в горячем (~90 °C) 1x фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) в химическом выхлопном растворе. Чтобы ускорить процесс растворения, добавьте 10 мкл гидроксида натрия 14 Н (на 10 мл PBS) в фиксацию до тех пор, пока формальдегид не войдёт в раствор, затем добавьте 10 мкл соляной кислоты 14 Н, чтобы вернуть pH к нейтральному.
    ВНИМАНИЕ: Всегда носите лабораторный халат, очки и перчатки при работе с параформальдегидом и гептаном, и используйте только под капюшоном для химических паров. Параформальдегид является канцерогеном и коррозийным, тогда как гептан очень воспламеняющийся и раздражает кожу и глаза.
  5. Разберите корзину для сбора эмбрионов и погрузите нейлоновую сетку с дехорионированными эмбрионами в гептан. Эмбрионы отстраняются от нейлона и оседают на границе между гептаном (верхним слоем) и фиксированным (нижним слоем). Фиксируйте эмбрионы, встряхивая флакон фиксации на шейкере платформы со скоростью 240 оборотов в минуту (RPM) в течение 20 минут.
  6. Удалите фиксацию из флакона фиксации с помощью пипетки Pasteur в вытяжке с химическим дымом. Утилизация в одобренном контейнере для опасных химических отходов. Добавьте равный объём метанола, закройте камеру фиксации и энергично встряхните камеру в течение 5-10 секунд. Фиксированные эмбрионы вырываются из оболочки вителлина и опускаются на дно метанола (нижний слой). Огибающие Вителлина и любые эмбрионы, которые не смогли вырваться из оболочки Вителлина, останутся на интерфейсе и будут удалены на этапе 2.7.
    ВНИМАНИЕ: Всегда носите лабораторный халат, очки и перчатки при работе с метанолом, так как он токсичен и горючий.
  7. Удалите гептан пипеткой Pasteur и выбросьте его в одобренный контейнер для опасных химических отходов. Затем удалите большую часть метанола, оставив эмбрионы в небольшой бассейне метанола, и выбросьте его в опасные химические отходы. Добавьте 5 мл метанола, перемешайте эмбрионы и дайте им осесть. Снова удалите большую часть метанола и повторите этот процесс ещё два раза.
  8. Перенесите эмбрионы в метаноле в стеклянную пробирку с культурой объёмом 0,8 мл. Удалите метанол и добавьте 750 мл раствора блока (PBS плюс 1% обычная ослиная сыворотка и 0,1% Triton X-100). Промыйте эмбрионы 3 раза в PBS, затем инкубуйте их в блочном растворе 30 минут при комнатной температуре с аккуратным смешиванием на платформе-качалке.
  9. Промывайте эмбрионы ещё раз в PBS, а затем добавьте блок плюс первичные антитела. Используйте антитела против белка pSJ (например, Coracle) и белка соединения адхеренса (например, E-cadherin). Инкубировать эмбрионы в первичных антителах ночью при 4 °C или 3-4 часа при комнатной температуре с аккуратным смешиванием на платформе-качалке.
  10. Удалите блок с первичными антителами и трижды промывайте эмбрионы в PBS. Добавьте блок и помойте эмбрионы 30 минут при комнатной температуре на платформе-качалке.
  11. Промыть эмбрионы ещё раз в PBS, затем добавить блокирующий раствор и флуоресцентно маркированные вторичные антитела, специфичные к первичным антителам, используемым на шаге 2.9. Инкубировать эмбрионы при комнатной температуре в течение 3-4 часов или ночью при 4 °C.
  12. Удалите блок вторичными антителами и промывайте эмбрионы три раза в PBS. Добавьте блок и помойте эмбрионы 30 минут при комнатной температуре на платформе-качалке.
  13. Снова прополосните эмбрионы в PBS, затем перенесите их на микроскопическое стекло с помощью пипетки Пастера. Убирайте лишние PBS с помощью маленьких полосок бумаги Whatman, стараясь не трогать эмбрионы. Покройте эмбрионы монтажным материалом (коммерчески доступным или изготовленным из 90% глицерила, 10% 1 M Tris, pH 8,0, с 0,5% n-пропилгаллатом в качестве противовыцветающего агента). Накройте стекло соответствующего размера с номером 1.5 и запечатайте края лаком для ногтей.

3. Визуализация и анализ данных иммунокрашеных эмбрионов

  1. Для наилучших результатов снимайте эмбрионы на конфокальном микроскопе с масляным погружением 40x. Используйте контрольные эмбрионы, чтобы задать лазерную интенсивность и усиление на конфокальном элементе, чтобы добиться сильного флуоресцентного сигнала без перенасыщения пикселей. Определить выбранные эмбрионы 16-й стадии (то есть те, что не экспрессируют балансировочно-кодируемый GFP для идентификации мутантных эмбрионов) с помощью морфологии среднекишечника. Сосредоточьте сканирование на слюнной железе или заднем кишечнике, так как эти органы поляризованы и имеют длинные боковые оболочки, идеально подходящие для определения соединения адхеренсов, pSJ и оставшейся латеральной поверхности. Снимите изображение в позиции Z, которая будет включать максимально возможный диаметр просвета слюнной железы или задней части кишечника, чтобы наблюдать всю боковую мембрану эпителиальной клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пример, показанный на рисунке 1C , был снят на конфокальном микроскопе с масляной иммерсионной линзой HC PL APO 40x/1.3 CS2 с лазерной интенсивностью 1,59 и усилением 3,3 для лазера 561 нм, интенсивностью лазера 2,0 и усилением 21,7 для лазера 638 нм (см. таблицу материалов).
  2. Сфотографируйте поляризованную ткань как минимум в 20 контрольных и мутантных эмбрионах 16-й стадии. Фиксируйте данные только с эмбрионов, в которых маркер соединения адгеренса плотно локализован в апикальной латеральной области мембраны, чтобы обеспечить правильную фиксацию и окрашивание эмбриона. Далее запишите распределение маркера pSJ вдоль латеральной мембраны. В эмбрионах 16-й стадии дикого типа ищите сильное обогащение белков pSJ вдоль ~10-15% латеральной мембраны, непосредственно базально от соединения адхеренсов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Неправильная локализация даже 10-20% белка pSJ вдоль длины латеральной мембраны является диагностическим фактором для дефекта организации pSJ. Дефекты организации pSJ сильно проникают во всех основных и вспомогательных эмбрионах с мутантами pSJ, поэтому следует ожидать, что 75-100% мутантных эмбрионов будут демонстрировать явно нелокализованный pSJ-белок.

4. Подготовка к инъекции красителя

  1. Приготовьте свежий раствор красителя, растворив родамино-маркированный 10 кДа декстран до 1 мг/мл в 0,5 м натрия с pH 7,5 и 5 мМ хлорида калия.
  2. Втяните капиллярную трубку (1,0 мм OD x 0,5 мм ID с волокном) в стеклянную иглу с помощью игольного механизма.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вытягивающие иголки отличаются своими особенностями, и настройки идеальных игл часто меняются каждый день. Хорошие спицы имеют постепенное сужение до острого наконечника и должны попадать между формами, показанными на рисунке 2A. Игла слева длиннее и может сгибаться, когда её вводят в эмбрион. Это можно исправить, переломив иглу дальше от точки. Игла справа хороша, но при первоначальном сломе будет иметь больший отверстие и может протолкнуть слишком много жидкости в эмбрион. Если это случится, переходите на новую иглу с более тонкой точкой. Лучше всего вытаскивать несколько игл одновременно, когда условия на иголке создают правильную форму. Излишки игл можно хранить в закрытом контейнере с кусочком пенопласта или скотча для закрепления игл отдельно.
  3. Загрузите иглу в держатель для игл на микроманипуляторе. Разместите микроманипулятор рядом с перевёрнутым микроскопом (рисунок 2F). Направите иглу максимально параллельно стеклу микроскопа и опустите её так, чтобы она находилась в той же плоскости Z, что и боковая часть затвора.
  4. Сломайте кончик иглы, ударив по боковой части стекла микроскопа. Поднимите иглу выше уровня затвора и снимите её для загрузки.
  5. Заполните капиллярную трубку красителем с помощью самого маленького наконечника пипетки (наконечник P2 или P10) или капиллярным действием, поместив задний конец иглы в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл вместе с красителем.
  6. Перезарядьте заполненную иглу в держатель иголки и проверьте поток декстрахена, введя немного в каплю галоуглеродного масла на поверхности стекла микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошо сломанная игла не будет протекать без увеличения давления, а скорость потока можно регулировать в зависимости от того, сколько давления прикладывается к поршню шприца.

5. Монтаж эмбрионов и инъекция красителя

  1. Выберите эмбрионы 16 или 17 стадий (контрольные и мутантные), используя морфологию средней кишки в качестве маркера стадии.
  2. Создайте вмятинную линию на тарелке с яблочным соком, используя накладку толщиной 22 x 22 #2. Выровняйте примерно 25 стадий эмбрионов на тарелке яблочного сока, их задние концы соприкасаются с линией, а вентральная поверхность — вверх.
  3. Наклейте кусок двустороннего скотча на накладку размером 22 x 22 #2. Коснитесь лентой линии эмбриона и слегка потрите накладку, чтобы переместить эмбрионы с пластины на двустороннюю ленту на накладке (рисунок 2B).
  4. Прикрепите каплю к стеклу микроскопа, добавив каплю галоуглеродного масла и используя капиллярное действие, чтобы создать связь. Ориентируйте коверслип ближе к боковой стороне горки, противоположной какой-либо матовой части. Высушить эмбрионы в течение 3-5 минут в контейнере с осушителем или в воздухе на лабораторном столе 10-15 минут (рисунок 2C-E). Полностью покройте эмбрионы галоуглеродным маслом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы будут немного менее тяжёлыми после высыхания, но не сильно вялыми. Эмбрионы, показанные на рисунке 2E , были оставлены сушиться на воздухе 15 минут в комнате с относительной влажностью 42% при 21,2 °C.
  5. Закрепите стекло с эмбрионами на перевёрнутый микроскоп так, чтобы эмбрионы были направлены вверх (вдали от объектива). Выровняйте микроманипулятор так, чтобы игла была обращена к заднему концу эмбрионов под углом, максимально параллельным эмбриону (рисунок 2G). Настройте ось z микроманипулятора так, чтобы кончик иглы был выровнен с серединой эмбриона (вдоль дорсально-вентральной оси).
  6. Вводите эмбрионы, быстро перемещая стадию в иглу так, чтобы кончик иглы вошёл в гемокоэль эмбриона. Введите небольшое количество красителя (~0,2-0,5 nL) с помощью шприца на 10, 25 или 50 мл. Быстро вынимите иглу, перенесите стадию к следующему эмбриону и повторите процесс. Вводите как можно больше эмбрионов за 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы игла была введена примерно на 25% пути в эмбрион, чтобы краситель не вводился напрямую в перивителлинное пространство, которое непрерывно связано с просветом передней и задней кишки. Введённый краситель должен казаться «надувающим» эмбрион, делая его более тяжёлым. Чрезмерная инъекция приводит к появлению пузыря красителя и гемолимфы, выходящей из места инъекции, и этого следует избегать.
  7. Добавьте дополнительное галоуглеродное масло и покройте эмбрионы покрытием 22 x 22 #2 coverslip. Дополнительное галоуглеродное масло образует более однородный слой между двумя прикрытиями, предотвращая раздавление эмбрионов.

6. Визуализация и анализ данных

  1. Проводите визуализацию на флуоресцентном соединенном микроскопе или конфокальном микроскопе (достаточно 10 или 20x воздушных объективов для однозначных результатов). На конфокале z-стек визуализация примерно на четверть глубины (вдоль дорсальной вентральной оси) эмбриона покажет, вошёл ли маркированный декстран в просвет трахеи и задних кишок (для вида слюнных желез необходимо более глубокие срезы или переориентацию эмбрионов с вентральной поверхностью вверху).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Примеры, показанные на рисунке 3 , были сняты на конфокальном микроскопе с сухой линзой HC PL APO 10x/0.4 CS2 с интенсивностью лазера 2.0 и усилением 13.6 для лазера 561 нм. Получено 24 z-среза с шагом z 2,4 нм (см. таблицу материалов).
  2. Дайте введённому эмбриону постариться 10 минут, а затем осмотреть просвет трахеи, слюнной железы или заднего кишечника на предмет накопления меченого декстрана. Запишите генотип и стадию каждого эмбриона, а также определите, накапливается ли маркированный декстран в какой-либо трубчатый орган. Обратите внимание на эмбрионы, у которых перивителлиальное пространство также сильно окрашено красителем, так как это могут быть эмбрионы, случайно введенные в это пространство.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представленные здесь протоколы используются для изучения организации и функции pSJs в эктодермальных тканях эмбрионов Drosophila на стадии 16. Эти протоколы применимы только к pSJ и не могут использоваться для допроса sSJ. Мутация в гене, которая приводит к неспособности локализовать другие белки pSJ в области pSJ у эмбрионов 16-й стадии и создать окклюзионный переход на 16-й стадии, находится либо в основном гене pSJ, либо в дополнительном гене pSJ. Главное различие между ними заключает...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для идентификации основных и вспомогательных pSJ-белков с помощью двух относительно простых анализов, которые можно выполнить в умеренно оборудованных лабораториях с возможностями флуоресцентной микроскопии. Первый анализ изучает молекулярную организацию pSJ в зрелых поляризованных эпителиях с помощью конфокальной визуализации фиксированных мутантных эмбрионов. Второй анализ проверяет целостность окклюзионной функции pSJ путём введения молекул декстран с ме...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликтов интересов, которые нужно раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Центр по изучению дрозофилы в Блумингтоне за использованные в этом исследовании нахлыстовые. Мы благодарим Developmental Studies Hybridoma Bank за антитела, использованные в исследовании. Мы также благодарим кафедру биологии Университета Кейс Вестерн Резерв за использование их флуоресцентного стереомикроскопа Leica MZ10F для генотипирования и стадирования эмбрионов для диссекции, а также их инвертированного флуоресцентного микроскопа DMi8 для экспериментов с инъекцией красителей. Мы благодарим Хелен Зальц, профессора генетики и геномных наук Медицинской школы CWRU, за предоставление микроманипулятора и за извлечение нескольких игл, использованных в эксперименте с инъекцией красителя, представленном в этом исследовании. Этот проект был поддержан грантом Национального научного фонда (IOS 2111069) для REW.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Капиллярная трубка для игл (Boro 1 x 0.5/волокно)FHC30-30-1
Конфокальный микроскопLeicaStellaris 5 
Крышное стекло толщиной 22 x 22 2 для инъекцийFisher Scientific12-540-B
Стекло 22 x 30 толщиной 1,5 для изображенияКорнинг2980-233
Посевная трубка для иммунокрашивки (6 x 50 мм) Fisher Scientific14-958-A
Клетка для сбора эмбрионовGenesee Scientific59-100
Флуоресцентный стереомикроскопLeicaMZ10 F
Галоуглеродное масло (700)Genesee Scientific59-131
ГептанFisher ScientificH350-4
Инвертированный флуоресцентный микроскопLeicaDMi8
Сетчатые корзины для дехорионирующих эмбрионовGenesee Scientific46-101
МетанолFisher ScientificA412-4
МикроманипуляторНарисигэMN151
Микроскопические стеклиFisher Scientific12-544-2
Вытягивающий иголочный механизмИнструменты Дэвида КопфаМодель 720
Обычная ослиная сывороткаJackson ImmunoReseaerch017-000-121
Нейлоновая сетка (120 мм)Genesee Scientific57-102
Объективная линза HC PL FLUOTR 10X/0.32 pH 1Leica11506537
Объективный объектив HC PL APO 10x/0.40 CS2Leica15506407
Объективный объектив HC PL APO 40x/1.30 CS2Leica15506358
Пластины Петри 60 x 15 ммКорнинг351007
Платформенный качалкаGlobe ScientificGTR-FS
Первичное антитело (коракл)DSHBC566.9
Первичное антитело (коракл)DSHBC615.16
Первичное антитело (E cadherin)DSHBDCAD2
Первичное антитело (Mcr)Лаборатория Уорд, CWRUПоликлональная морская свинка
Родамин с меткой 10 кДа декстраномМолекулярные зондыD1824
Вторичные антитела (осла, антиморская свинка, Cy3)Jackson ImmunoReseaerch706-165-148
Вторичное антитело (осла против мышей Cy2)Jackson ImmunoReseaerch715-225-151
Вторичные антитела (осла против крыс Cy5)Jackson ImmunoReseaerch712-175-150
Настольный шейкерНью-Брансуик СайентификШейкер платформы C2
Тегосепт (метил4-гидроксибензоат)TCIH0216
Triton X-100Fisher ScientificBP151500
Флаконы для фиксации (20 мл жидких сцинтилляционных флаконов WHEATON)Fisher Scientific03-341-73C
Whatman 3MM  Статья по хроматографииFisher Scientific05-716-6H
<Сильные>Муховые стоки<сильный>полный генотип<Сильный>запас< и сильный><Сильный>Источник
cor4w*; P{neoFRT}43D cora4/CyO52232BDSC
W1118w[1118]5905BDSC
SolutionRecipe
10x PBSСмешайте 90 г NaCl, 20 г Na2HPO4 и 8,3 г NaH2PO4.H2O и dH20 до 1 литра. Простерилизуйте фильтром. Разведите до 1 раза с помощью dH2O для этапов промывания иммунного окрашивания.
10% раствор Triton X-100Смешайте 1 мл Triton X-100 до 9 мл dH2O на платформенном рокере до растворения. Храните при комнатной температуре.
50% отбеливателяСмешайте 10 мл коммерческого отбеливателя (7,5% гипохлорита натрия) с 10 мл воды перед дехорионированием эмбрионов.
Тарелки с яблочным сокомВарите 15 г агара Drosophila в 725 мл dH2O. Добавьте 25 г сахара и 250 мл яблочного сока и перемешайте до перемешивания. Дайте раствору остыть до 55°C, затем добавьте 1,3 г тегосепта и аккуратно перемешайте. Вылейте в 60 x 15 пластин Петри и дайте остыть. Магазин при 4°C.
Решение блокировкиСмешайте 9,8 мл 1X PBS с 100 уль 10% Triton X-100 и 100 уль Normal Donkey Serum в 15-конической трубке.
Раствор промывания эмбрионовПриготовьте раствор для промывки эмбрионов 10X, смешав 70 г NaCl и 2 мл Triton X-100 до 1 л dH2O. Разбавьте до 1 раза dH2O для рабочего раствора.
ИсправлениеПредварительно разогрейте 10 мл 1X PBS в микроволновке. Добавьте 0,4 г  параформальдегида и пипета для смешивания. Добавьте 10 уль 14N NaOH к скоростному растворению. Поставьте на нагревательный блок при 90°C до растворения. Когда твёрдый параформальдегид не остаётся, добавьте 10 уль 14N HCL, чтобы отрегулировать pH на нейтральный. Всегда носи лабораторный халат, перчатки и гугл при использовании параформальдегида.
Монтажные носителиСмешайте 9 мл глицерина и 1 мл 1M Tris, pH 8.0. Добавьте 0,05 г n-пропил-галлата и nbsp; Перемешайте и нагрейте, чтобы раствориться. Аликвот 0,5 мл в трубки Эппендорфа. 
Раствор родамина декстранСоздайте свежий раствор красителя, растворив родамино-маркированный 10 кДа декстран до 1 мг/мл в 0,5 млн натриевом фосфате, pH 7,5 и 5 мМ хлорида калия.
Дрожжевая пастаСмешайте 50 г коммерческих дрожжей (Red Star) с щепоткой сахарозы и достаточной водой, чтобы получилась густая паста. Магазин при 4°C.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Farquhar, M. G., Palade, G. E. Junctional complexes in various epithelia. J. Cell Biol. 17, 375-412 (1963).
  2. Lord, B. A., DiBona, D. R. Role of the septate junction in the regulation of paracellular transepithelial flow. J. Cell Biol. 71 (3), 967-972 (1976).
  3. Noirot-Timothée, C., Smith, D. S., Cayer, M. L., Noirot, C. Septate junctions in insects: comparison between intercellular and intramembranous structures. Tissue Cell. 10 (1), 125-136 (1978).
  4. Rouka, E., et al. The Drosophila septate junction beyond barrier function: review of the literature, prediction of human orthologs of SJ-related proteins and identification of protein domain families. Acta Physiol. 231 (1), e13527(2021).
  5. Poodry, C., Schneiderman, H. The ultrastructure of the developing leg of Drosophila melanogaster. Roux Arch. Dev. Biol. 166, 1-44 (1970).
  6. Tepass, U., Hartenstein, V. The development of cellular junctions in the Drosophila embryo. Dev. Biol. 161 (2), 563-596 (1994).
  7. Rice, C., De, O., Alhadyian, H., Hall, S., Ward, R. E. Expanding the junction: new insights into non-occluding roles for septate junction proteins during development. J. Dev. Biol. 9 (1), 11(2021).
  8. Baumgartner, S., et al. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).
  9. Fehon, R. G., Dawson, I. A., Artavanis-Tsakonas, S. A Drosophila homologue of membrane-skeleton protein 4.1 is associated with septate junctions and is encoded by the coracle gene. Development. 120 (3), 545-557 (1994).
  10. Hall, S., et al. Macroglobulin complement-related (Mcr) encodes a protein required for septate junction organization and paracellular barrier function in Drosophila. Development. 141, 889-898 (2014).
  11. Nelson, K. S., Furuse, M., Beitel, G. J. The Drosophila claudin Kune-kune is required for septate junction organization and tracheal tube size control. Genetics. 185 (3), 831-839 (2010).
  12. Paul, S. M., Ternet, M., Salvaterra, P. M., Beitel, G. J. The Na⁺/K⁺-ATPase is required for septate junction function and epithelial tube-size control in the Drosophila tracheal system. Development. 130 (20), 4963-4974 (2003).
  13. Nilton, A., et al. coiled and crimpled are three Ly6-like proteins required for proper localization of septate junction components. Development. 137 (14), 2427-2437 (2010).
  14. Tiklova, K., Senti, K. A., Wang, S., Gräslund, A., Samakovlis, C. Epithelial septate junction assembly relies on melanotransferrin iron binding and endocytosis in Drosophila. Nat. Cell Biol. 12 (11), 1071-1077 (2010).
  15. Bilder, D., Schober, M., Perrimon, N. Integrated activity of PDZ protein complexes regulates epithelial polarity. Nat. Cell Biol. 5 (1), 53-58 (2003).
  16. Woods, D. F., Bryant, P. J. The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions. Cell. 66 (3), 451-464 (1991).
  17. Hall, S., Ward, R. E. Septate junction proteins play essential roles in morphogenesis throughout embryonic development in Drosophila. G3 (Bethesda). 6 (8), 2375-2384 (2016).
  18. Genova, J. L., Fehon, R. G. Neuroglian, Gliotactin, and the Na⁺/K⁺-ATPase are essential for septate junction function in Drosophila. J. Cell Biol. 161 (5), 979-989 (2003).
  19. Ward, R. E., Lamb, R. S., Fehon, R. G. A conserved functional domain of Drosophila coracle is required for localization at the septate junction and has membrane-organizing activity. J. Cell Biol. 140 (6), 1463-1473 (1998).
  20. De, O., et al. Septate junction proteins are required for cell shape changes, actomyosin reorganization and cell adhesion during dorsal closure in Drosophila. Front. Cell Dev. Biol. 10, 947444(2022).
  21. Laprise, P., et al. The FERM protein Yurt is a negative regulatory component of the Crumbs complex that controls epithelial polarity and apical membrane size. Dev. Cell. 11 (3), 363-374 (2006).
  22. Laprise, P., et al. Neurexin IV and the Na⁺/K⁺-ATPase form a novel group of epithelial polarity proteins. Nature. 459 (7250), 1141-1145 (2009).
  23. Oshima, K., Fehon, R. G. Analysis of protein dynamics within the septate junction reveals a highly stable core protein complex that does not include the basolateral polarity protein Discs large. J. Cell Sci. 124 (Pt 16), 2861-2871 (2011).
  24. Hartenstein, V. Atlas of Drosophila Development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1993).
  25. Lamb, R. S., Ward, R. E., Schweizer, L., Fehon, R. G. Drosophila coracle, a member of the protein 4.1 superfamily, has essential structural functions in septate junctions and developmental roles in epithelial cells. Mol. Biol. Cell. 9 (12), 3505-3519 (1998).
  26. Davis, M. J., Talbot, D., Jemc, J. Assay for blood-brain barrier integrity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (151), e60233(2019).
  27. Laprise, P., et al. Epithelial polarity proteins regulate Drosophila tracheal tube size in parallel to the luminal matrix pathway. Curr. Biol. 20 (1), 55-61 (2010).
  28. Batz, T., Förster, D., Luschnig, S. The transmembrane protein macroglobulin complement-related is essential for septate junction formation and epithelial barrier function in Drosophila. Development. 141 (4), 899-908 (2014).
  29. Behr, M., Riedel, D., Schuh, R. The claudin-like Megatrachea is essential in septate junctions for epithelial barrier function in Drosophila. Dev. Cell. 5 (4), 611-620 (2003).
  30. Wu, V. M., et al. Sinuous is a Drosophila claudin required for septate junction organization and epithelial tube size control. J. Cell Biol. 164 (2), 313-323 (2004).
  31. Wu, V. M., et al. Drosophila Varicose, a member of a new subgroup of basolateral MAGUKs, is required for septate junctions and tracheal morphogenesis. Development. 134 (5), 999-1009 (2007).
  32. Jaspers, M. H., et al. The claudin Megatrachea protein complex. J. Biol. Chem. 287 (44), 36756-36765 (2012).
  33. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
  34. Zirin, J., et al. Large-scale transgenic Drosophila resource collections for loss- and gain-of-function studies. Genetics. 214 (4), 755-767 (2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Drosophila

Похожие статьи