Визуализация влияния питательных сред в реальном времени на развитие биопленки Pseudomonas aeruginosa с использованием микрофлюидической системы

Краткое содержание

Этот протокол оценивает влияние богатых (TSB) и минимальных (FAB) питательных сред на развитие биопленок Pseudomonas aeruginosa PAO1 и PA14 в условиях устойчивого потока в микроканале.

Аннотация

Патогенная бактерия Pseudomonas aeruginosa является основной причиной многочисленных нозокомиальных инфекций, и её растущая антимикробная устойчивость делает её серьёзной угрозой для общественного здоровья. В этой статье представлен комплексный протокол, подробно описывающий использование микрофлюидной системы для визуализации и количественной оценки в реальном времени проработки биопленки в двух ключевых штаммах P. aeruginosa — PAO1 и PA14. Метод использует оптически прозрачные, многоканальные микроканальные пластины для подвержения бактериальных культур непрерывному, стабильному потоку среды, включая триптический соевый бульон (TSB) или модифицированный минимально требовательный анаэробный бульон (FAB) с изменяющимися концентрациями источников углерода, что имитирует условия, характерные в клинических условиях. В течение 24 часов автоматизированная визуализация в реальном времени фиксирует рост и созревание биопленок в виде покрытия поверхности, толщины и шероховатости поверхности биопленки с высокой воспроизводимой способностью. Цель эксперимента — использовать полученные результаты для демонстрации того, что образование биопленки для обоих штаммов существенно зависит от изменений состава питательных материалов. Цель этого визуализированного протокола — предоставить исследователям метод изучения динамики биоплёнки в условиях устойчивого ламинарного потока, а полученные знания могут быть использованы для разработки альтернативных, неантимикробных стратегий уничтожения биопленок P . aeruginosa на ранних стадиях в нозокомиальных условиях.

Введение

Цель этого метода — наблюдать влияние двух различных культурных сред, то есть триптического соевого бульона (TSB) и модифицированного минимально придирчивого анаэробного бульона (FAB), на рост биопленки двух штаммов Pseudomonas aeruginosa , а именно PAO1 и PA14. Хотя P. aeruginosa PAO1 и PA14 являются распространёнными лабораторными эталонными штаммами, штамм PA14 заражает большую долю хозяев — от растений до беспозвоночных¹. Питательный бульон TSB — это универсальная культурная среда с 2,5 г/л глюкозы в качестве источника углерода, способный выращивать широкий спектр бактерий благодаря составу казеина и соевых пептонов для органического азота и природного сахара, а также хлорида натрия для поддержания осмотического^{равновесия 2}. Минимальная среда FAB, напротив, формируется с минимальными концентрациями (50-кратное уменьшение) одного источника углерода на уровнях 0,05 г/л для изучения потребностей в росте анаэробных бактерий. Деформации PAO1 и PA14 подвергались однонаправленному ламинарному потоку, что приводило к низкому сдвигающему напряжению стенки 0,01 Па. Это значение сдвигового стресса часто присутствует в участках, колонизированных P. aeruginosa, включая бронхи пациентов с муковисцидозом и желудочно-кишечный тракт. Рост биопленки измерялся в течение 24 часов путём оценки процентной площади покрытия поверхности в реальном времени, толщины и среднего арифметического значения шероховатости поверхности.

Биопленки P. aeruginosa ответственны за значительный процент нозокомиальных инфекций и являются ведущей причиной смерти у людей с муковисцидозом ^3,4,5. Предыдущие исследования влияния уровней углеродных источников на развитие бактериальной биоплёнки игнорировали критическую роль гидродинамического потока в развитии биопленки, использовали значения сдвигового напряжения, не соответствующие местам заражения P. aeruginosa, или проводили только кинетический и морфологический анализ биопленки после^{эксперимента 6,7}. Эти ограничения устраняются в этом методе с помощью изображения развития биопленки в реальном времени при условиях устойчивого потока в микрофлюидном канале, который близко воспроизводит физиологическую среду, характерную для пациентов с муковисцидозом.

Этот метод обладает значительными преимуществами по сравнению с альтернативными методами, используемыми для изучения развития биопленки. Применение изображения в реальном времени в течение 24-часового периода роста биопленки обеспечивает ненарушаемость развивающейся биопленки, поскольку не требуется сушка или химические изменения, что позволяет избежать изменений в её составе и даёт более характерные результаты, чем методы, требующие манипуляций^{образцом 8}. Кроме того, применяя устойчивые гидродинамические условия потока и изменяя концентрацию источников углерода в больших масштабах, эта процедура более точно воспроизводит физиологические условия, обнаруженные в местах инфекций P. aeruginosa nosocomial. Это делает его более репрезентативным по сравнению с методами, использующими статические анализы, такие как 96-луночные микротитровые пластины или купоны, которые не отражают критическое влияние потока жидкости на развитие^{биопленки 9,10,11}.

Использованное микрофлюидное устройство было выбрано специально, поскольку его размеры схожи с частями лёгких, такими как бронхиолы и^{бронхи-12}. Кроме того, инфекции P. aeruginosa являются серьёзной проблемой для пациентов с тяжёлыми ожогами, где уровень глюкозы может значительно колебаться от нормального^{диапазона 13,14}.

Хотя этот протокол использует конкретно два штамма P. aeruginosa, метод также применим для исследований ранних стадий развития других бактерий, вызывающих инфекции или колонизирующих участки в схожих условиях. Кроме того, с помощью той же методологии можно исследовать другие составы питательных сред, а также условия потока (например, пульсативные и колеблющиеся потоки или более высокие значения сдвига стенок).

Протокол

1. Чистка стеклянной посуды

1. Погрузите две стеклянные бутылки по 200 мл для использования для среды и агара, а также три стеклянные бутылки по 1 л в ванну с 10% соляной кислотой (HCl) примерно на 5 минут при комнатной температуре.
   ВНИМАНИЕ: Соляная кислота коррозийна. Всю работу с кислотой выполняйте в капюшоне с химическим паром, надевая соответствующие средства индивидуальной защиты (лабораторный халат, перчатки и защита глаз).
2. Затем вынимите стеклянную посуду из ванны HCl и дважды прополосните водопроводной водой и один раз дистиллированной водой (_{dH 20}).

2. Подготовка среды из триптического соевого бульона

1. Приготовьте раствор TSB, взвесьте 6 г/200 мл порошка TSB с помощью чистой весовой лодки и точный вес.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Состав используемого порошка TSB следующий: декстроза (2,5 г∙^L-1), дикалийфосфат (2,5 г∙^L-1), панкреатический дигест казеина (17 г∙^L-1), папаев дигест соевого шрота (3,0 г∙^L-1) и хлорид натрия (5,0 г∙^L-1).
2. Измерьте 200 мл_{dH 20}с помощью измерительного цилиндра и налейте в одну из ранее промытых стеклянных бутылок.
3. Добавьте 6 г TSB в чистую стеклянную бутылку с 200 мл_{dH 2}O, плотно запечатайте бутылку и перемешайте примерно 2 минуты, чтобы растворить порошок, создавая среду раствора TSB.
4. Раствор в среде для автоклава TSB в течение 15–20 минут при температуре 121 °C и давлении 1,5 атм для стерилизации раствора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: (ТОЧКА ПАУЗЫ) РАСТВОР TSB можно хранить при комнатной температуре (примерно 20 °C) между использованием и использовать для будущих экспериментов.

3. Тщательное приготовление анаэробного бульона для среды

1. Приготовьте раствор из следовых металлов FAB.
   1. Используйте отдельные чистые весовые лодки и лопатку, а также точный вес при массах от 0,5 до 210 г и аналитический вес при массах от 0,001 до 0,5 г. Измерьте следующие компоненты и их количества: CaSO_{4,2H 2}O (200 мг∙^L-1), FeSO_{4,7H 2}O (200 мг∙^L-1),_{MnSO 4}. H₂O (20 мг∙^L-1), CuSO 4,5H₂O (20 мг∙^L-1), ZnSO_{4,7H 2}O (20 мг∙^L-1), CoSO_{4,7H 2}O (10 мг∙^L-1), NaMoO₄. H₂O (10 мг∙^L-1) и_{H 3}BO₃ (5 мг∙^L-1)^7,9.
   2. Добавьте каждый компонент в прочистенную стеклянную бутылку объёмом 1 л с_{1 л dH 20}и тщательно перемешайте с_{dH 20}.
   3. Добавьте по 1 мл смеси в каждую из двух оставшихся 1 л стерилизованной стеклянной бутылки с 1 л_{dH 20}и тщательно перемешайте.
2. Приготовьте 20 мМ FAB, дополненный цитратом натрия, для ночных культур
   1. Измерьте следующие компоненты и их количество с помощью отдельных чистых весовых судов и лопатки, точного веса при взвешивании масс от 0,5 до 200 г и аналитического веса при взвешивании масс от 0,001 до 0,5 г: цитрат натрия (20 мМ), (_{NH 4)2}SO₄ (2 г∙^L-1), Na_{2HPO 4,2H 2}O (6 г∙^L-1), KH₂PO₄ (3 г∙^L-1), NaCl (3 г∙^L-1), MgCl₂ (93 мг∙^L-1) и CaCl₂ (11 мг∙^L-1)^7,9.
   2. Добавьте все компоненты в одну из оставшихся 1 л стерилизованных стеклянных бутылок с 1 л_{dH 2O}с 1 мл раствора следовых металлов.
   3. Тщательно перемешайте.
3. Подготовьте 0,3 мМ глюкозо-дополненного FAB для роста биопленки.
   1. Замените 20 мМ цитра натрия на 0,3 мМ глюкозы. Используйте те же компоненты и массы, что указаны в шаге 3.2.1.
   2. В оставшейся очищенной стеклянной бутылке объёмом 1 л добавьте компоненты глюкозы FAB с концентрацией 0,3 мл к 1 мл_{dH 2O}с 1 мл раствора следовых металлов и хорошо перемешайте.
4. Автоклав на 15-20 минут при температуре пара 121 °C и давлении 1,5 атм для стерилизации среды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: (ТОЧКА ПАУЗЫ) РАСТВОР СРЕДЫ FAB можно хранить при комнатной температуре (примерно 20 °C) между использованием и использовать для будущих экспериментов.

4. Подготовка агара TSB

1. Измерьте 8 г/200 мл агара TS с помощью прецизионного веса и промытых весовых лодок и лопатки.
2. Измерьте 1 г/200 мл агара по бактериологическому сорту на отдельной весовой лодке, используя тот же точный вес.
3. Используя измерительный цилиндр, измерьте 200 мл_{dH 20}и вылейте в финальную, ранее вымытую стеклянную бутылку.
4. Залейте оба компонента агара в 200 мл_{dH 20}и хорошо перемешайте.
5. Автоклав на 15–20 минут при температуре 121 °C и давлении 1,5 атм для стерилизации среды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: (ТОЧКА ПАУЗЫ) TSB агар можно хранить при комнатной температуре (примерно 20 °C) между использованием и требует повторного нагрева перед использованием в будущих экспериментах.

5. Чашка Петри Pseudomonas Aeruginosa культивирование

1. Растопите агар в микроволновке примерно 5 минут или пока раствор не станет жидким.
2. Откройте и продезинфицируйте поверхность защитного шкафа класса II раствором этанола 70%, готовую к использованию. Выполните все шаги ниже в этом разделе внутри этого защитного шкафа класса II.
3. Измерьте 25 мл раствора агара в флакон объёмом 50 мл и налейте его в чашу Петри диаметром 90 мм, дождитесь, пока агар застынет.
4. Извлечь замороженные запасы P. aeruginosa PAO1 и PA14 из морозильника при температуре -80 °C. Поместите бульён в инкубатор при 37 °C примерно на 5 минут или пока содержимое полностью не оттает.
5. Окуните инокуляционную петлю внутрь одного из размороженных запасов P. aeruginosa и распределите образец по агару.
6. Повторите шаг 5.5 для другого штамма P. aeruginosa , создавая две отдельные культуры чашек Петри P. aeruginosa : одну с штаммом PAO1, другую — со штаммом PA14.
7. Маркируйте каждую чашку Петри с штаммом P. aeruginosa , датой возрождения и инициалами, затем поместите в инкубатор на 16–18 часов при 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: (ТОЧКА ПАУЗЫ) P. AERUGINOSA PAO1 и PA14 Чашки Петри можно хранить при 4 °C до 4 недель и использовать для будущих экспериментов.

6. Запасы глицерилов Pseudomonas aeruginosa PAO1 и PA14

1. Откройте и продезинфекцируйте шкаф класса II безопасности для использования, выберите восемь флаконов по 50 мл для хранения ночных культур.
2. Используя ранее изготовленную среду TSB и цитрат натрия FAB (раздел 3), наливайте 5 мл среды TSB в четыре из восьми флаконов и минимальную среду с цитратом натрия в оставшиеся четыре.
3. Используя ранее инкубированные чашки Петри и инокуляционную петлю, коснитесь пяти отдельных колоний в чашке Петри P. aeruginosa PAO1 и перенесите в одну из флаконов TSB. Повторите это для среды FAB с цитратом натрия и для чашки Петри штамма P. aeruginosa PA14.
4. Погрузите чистую инокуляционную петлю непосредственно в оставшиеся четыре флакона FAB с TSB и цитратом натрия, формируя контрольные элементы.
5. Инкубировать все восемь флаконов в трясущемся инкубаторе 16–18 часов при 200 об/мин и 37 °C и чётко маркировать.
6. Достать флаконы для культуры, убедиться, что вакцинированные P. aeruginosa мутные, а используемые для контроля остаются чистыми.
7. Центрифугуйте четыре флакона, инокуленные P. aeruginosa, при 4000 × г в течение 5 минут при 20 °C, чтобы отделить P. aeruginosa от культурных сред. Убедитесь, что центрифуга сбалансирована.
8. Проигнорировать супернатант и ресуспензировать гранулу P. aeruginosa после центрифугирования с 1 мл раствора с 15% глицерила, 150 мкл глицерина и 850 мкл свежей среды TSB или натрия цитра FAB.
9. Перенесите вновь взвешенные культуры в флаконы объёмом 1 мл и поместите в морозильник при температуре -80 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: (ТОЧКА ПАУЗЫ) Запасы глицерила могут храниться при -80 °C для длительного хранения и использовать для будущих экспериментов.

7. Измерение оптической плотности ночных культур

1. Повторите шаги 6.1–6.5 только для двух средних флаконов TSB: один в качестве контроля, другой — штамм PAO1 P. aeruginosa .
2. Пипетте 1 мл среды TSB в флакон спектрофотометра объёмом 1 мл в камере безопасности класса II и переместите 0,9 мл среды TSB во второй флакон с добавлением 0,1 мл ночной культуры.
3. Установить спектрофотометр на длину волны света 600 нм и, используя флакон TSB для калибровки машины объёмом 1 мл, измерить оптическую плотность подвесного^{флакона 15} объёмом 0,1 мл.
   1. Если измеренная поглощённость не показывает 0,1, пересчитайте необходимый объём подвески.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объём подвески, необходимый для достижения показания поглощения 0,1 (_V1), можно рассчитать, используя начальный показатель поглощения флакона подвески объемом 0,1 мл, C₁, желаемой поглощённости, на которую регулируется подвеска, C₂, и необходимого объёма концентрированной ночной подвески, V₂:
      C₁V₁ = C₂V₂
      В приведённом выше примере, если C₁ = 3,59, C₂ = 0,1 и V₂ = 10 мл, то объём ночной подвески будет 0,279 мл в растворе 10 мл.
4. Измерите 10 мл среды TSB в флакон объёмом 50 мл и удалите тот же объём среды TSB, сколько необходимый объём подвески для создания подвески 10 мл 0,1 OD 600 Нм. Используя ночную культуру, добавьте рассчитанный объем суспензии и вихрь примерно на 5 секунд для смешивания.
5. Перенесите 1 мл из регулируемой подвески на 10 мл в флакон спектрофотометра и повторно измерите поглощение, чтобы убедиться, что она равна 0,1.
6. Повторите вышеуказанные 7,1–7,5 для среды PA14 и TSB, а также для обоих штаммов P. aeruginosa и среды FAB с цитратом натрия.

8. Жизнеспособное количество клеток

1. Переместите_{dH 2}O в квадратную чашку Петри внутри защитного шкафа класса II и используйте многоканальную пипетку для передачи 180 мкл в колонки 2–9 прозрачной полистироловой^{пластины 16} на 96 лунок (16).
2. Переместить подвеску объемом 10 мл 0,1 OD 600 в отдельную квадратную чашку Петри и, используя многоканальную пипетку, перевести 200 мкл подвески в колонну 1 полистироловой пластины с 96 лунками.
3. Пересадите более 20 мкл суспензии с помощью многоканальной пипетки из колонки 1 полистироловой пластины с 96 лунками в канал 2, затем переведите 20 мкл разбавленной суспензии из канала 2 на канал 3, повторяя на канал девять, создавая разбавление суспензии от 10 ^до 10 ^{до 10-8}.
4. Переместите 50 мл ТС-агар (раздел 4 и шаг 5.1) в защитном шкафу класса II с помощью флакона в квадратную чашку Петри и оставьте до помутнения агара.
5. Перенесите по 10 мкл из каждой скважины вдоль колонн 2–9 на тарелку Петри ТС агар в форме столбцов, используя многоканальную пипетку, чтобы столбцы не соприкасались друг с другом.
6. Инкубировать ТС-агар в течение 24 часов при 37 °C, после ожидания, пока перенесённые разбавления утихнут.
7. Рассчитайте единицы формирования колоний (CFU) на миллилитр (мл), определив, является ли чашка Петри счётной (от 30 до 300 колоний).
8. Определите коэффициент разбавления используемой 10 мл подвески; в этом случае подвеска была разбавлена до 1/10 (0,1 OD 600).
9. Рассчитайте индивидуальные коэффициенты разбавления каждой покрытой колонны. Это количество разбавленной суспензии, добавленной в каждую колонку, делённое на общий объём столбца после добавления подвески. В случае столбца 2 пластины с 96 лунками (столбец 1 чашки Петри) 20 мкл/200 мкл = 1/10.
10. Вычислите общий коэффициент разбавления серии, умножая каждый отдельный коэффициент разбавления столбцов вместе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В данном случае, поскольку 20 мкл передавалось из каждой колонки в следующую, что делает общий объём каждой колонки 200 мкл, каждое разбавление отдельной серии составляло 1/10. Общее разбавление серии составляет 1 × ^10-8.
11. Определите коэффициент разбавления брони по мере переноса разбавления с 96-ямеченной пластины в чашку Петри. Для определения CFU/mL разделите объём каждой колонки, покрытой (10 мкл) на 1 мл. В данном случае: .
12. Определите итоговый коэффициент разбавления, умножив исходный коэффициент разбавления суспензии (0,1) на общий коэффициент последовательного разбавления (1 × ^10-8) и коэффициент разбавления пластины ().
13. Вычислите CFU∙^mL-1 в исходном образце, умножьте CFU на пластине на обратный коэффициент разбавления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае, если учесть 200 КФУ, это означало бы выполнение 200 × 1/1 × ^10-8 , в результате чего CFU/mL будет 2 × 10¹⁰ CFU∙^{mL-1 17}.

9. Установка микрофлюидической системы и экспериментальный запуск

1. Инокуляция 5 мл культурного материала в бульон с каждым штаммом P. aeruginosa , чтобы сформировать ночную культуру и инкубировать 16–18 часов при 37 °C.
2. Настройте микрофлюидную систему и сопутствующее программное обеспечение.
   1. Активируйте компоненты микрофлюидной системы в следующем порядке: блок питания, контроллер микрофлюидной системы, CMOS-камера, нагреватели корпуса, микроскоп, компьютер и сопутствующие мониторы.
   2. Активируйте микрофлюидное программное обеспечение и инициируйте интерфейс сопутствующего управляющего модуля, вводя 48-ядренный штрих-код 0–2 Па, связанный с многоканальной пластиной, расположенный на боковой стороне многоканальной пластины.
3. Установите процедуру инокуляции пластинчатой колодцы P. aeruginosa .
   1. Отрегулируйте оптическую плотность ночной культуры на 0,1_{OD 600}.
   2. Передайте 50 мкл подвески 0,1 OD 600 в выходную яму, расположенную параллельно каждому из шести каналов, внутри защитного шкафа класса II.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шесть каналов одновременно запускались параллельно для максимизации вероятности выявления аномальных результатов.
   3. Замените многоканальную крышку пластины на 48 лунок и перенесите её на подвижную ступень, расположенную внутри системного инкубатора, и закрепите её.
4. Установите процедуру инокуляции многоканальных пластинчатых каналов у P. aeruginosa .
   1. Засейте микрофлюидные каналы с помощью модуля управления микрофлюидной системой, выбрав: Ручной > столбцов 1–4 > Жидкость: TSB при 37 °C > максимальное сдвиг (Pa): 0,1 (1 dyne∙^cm-2 = 0,1 Pa) и выберите выходную яму, выбранную для схемы многоканальной пластины с 48 колодцями 0–2 Pa.
   2. Нажмите кнопку прекращения , чтобы остановить поток через 2–4 секунды, и оставите пластину на 30 минут, чтобы ячейки прикрепились к субстрату канала перед началом непрерывного потока.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длительность 30 минут позволяет гравитационной силе помочь прикреплять планктонную бактерию P. aeruginosa к нижней стенке канала. Это время зависит от бактерии и типа питательной среды.
   3. Снимите многоканальную пластину из подвижного инкубатора и передайте 1 мл свежего TSB в впускную яму, расположенную в каждом из шести каналов в камере безопасности класса II.
   4. Перенесите многоканальную пластину на подвижную ступень внутри инкубатора и закрепите её на месте.
5. Настройте AutoRun.
   1. Убедитесь, что поток, используемый в течение 24-часовых экспериментов, соответствует месту обнаружения P. aeruginosa в природе, перейдя к ручному > сдвиговому напряжению: 0,01 Па и записывая объёмную скорость расхода (μL⋅^h-1). Убедитесь, что это значение для микроканальной пластины с 48 лунками составляет 8,2 мкл⋅^ч-1.
   2. Преобразуем объёмную скорость расхода в^{м 3}∙^s-1, рассчитайте площадь поперечного сечения канала (^{м 2}) и определите скорость потока при гидродинамическом сдвиговом напряжении 0,01 Па.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используя и перестраивая уравнение объёмного расхода жидкости по каналу, можно вычислить скорость течения через канал:
      
      Где U — скорость жидкости (m∙^s-1), а A — площадь поперечного сечения микроканала (m²) каналов в многоканальной пластине.
   3. Вычислите число потока Рейнольдса с использованием плотности ρ и динамической вязкости (μ) среды TSB и убедитесь, что биопленки P . aeruginosa находятся в пределах диапазона потока жидкости. При гидродинамическом сдвиговом напряжении 0,01 Па убедитесь, что число Рейнольда — 0,0117 и 0,0165 для сред TSB и FAB соответственно. Если это вне этого диапазона, проверьте, установлены ли условия жидкости на TSB.
      
      где D_h — гидравлический диаметр используемого микроканала, полученный с использующим:
      
      Где w и h обозначают ширину (m) и высоту (m) используемого микроканала.
   4. Рассчитайте длину проявления жидкости, чтобы обеспечить полное развитие потока жидкости в области получения изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длину проявления ламинарной жидкости через канал можно рассчитать с помощью числа Рейнольдса Re, Re, и гидравлического диаметра каналов, D_h:
      L_dev = 0.06_{ReD h}
   5. Настройте автозапуск: Редактировать AutoRun > Протокол > длительность 24 часа, с повторением 1 и сдвиговым напряжением 0,01 Па. Сохраните протокол.
   6. Создайте новую последовательность во вкладке «Настройка последовательности », применив новый протокол с одним повторением к каналам 1–6, и выберите жидкость: TSB при 37 °C. Сохрани эту последовательность.
6. Настройте получение изображений с помощью окна многомерного приёма .
   1. Выберите «Многомерное получение » с помощью системного программного обеспечения, затем нажмите кнопку «Живой режим» (в левом нижнем углу окна «Многомерное получение »). Перемещайтесь по этапу микроскопа, чтобы посмотреть каналы 1–6 с помощью кнопки живого просмотра и увеличения камеры с 5× до 40× на сенсорном экране микроскопа, показывая по одному каналу в поле зрения камеры за раз.
   2. Подготовьте камеру к захвату изображений: многомерное получение > сохранение: выберите каталог для сохранения изображений в > Таймлапс: продолжительность: 24 часа, сравнена с гидродинамическим потоком > Интервал времени: время между каждым полученным изображением, установлен на 10 минут.
   3. Введите настройки камеры, выбрав длину волны > освещение: яркое поле 50% камера 50%: чёрно-белый > автоэкспозицию: каждое получение > приобрети: каждый момент точки > автофокус: никогда.
   4. Определите положение камеры для захвата изображений биопленки, установив увеличение на 20×, чтобы получить поле зрения размерами 665,6 мкм × 665,6 мкм, и перейдите к середине области просмотра канала, где номер канала будет выгравирован в центре.
   5. Добавьте позицию сцены, чтобы она была запечатлена камерой, перейдите в Stage , пометьте позицию и выберите кнопку добавления, чтобы добавить её в каталог.
      1. Повторите это для точек выше по течению 0,9984 мм и нижних точек в 3,0016 мм от входа в область обзора канала, где позиция представляет среднюю точку поля зрения камеры.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Эти изображения были выбраны для получения представления роста биопленки вдоль области обзора, при этом обеспечивая полное развитие потока внутри. В результате получается по три изображения на каждый микроканал, в данном случае — 18 изображений каждые 10 минут.
7. Проведите экспериментальный заезд
   1. В окне модуля управления системой выберите AutoRun > Run Setup > Sequence: выберите созданную последовательность 0,01 Pa, затем старт.
   2. Сразу после этого перейдите к окну многомерного приобретения > Приобрети. Это запускает сбор 18 изображений каждые 10 минут 24-часовой экспериментальной процедуры, что приводит к 2610 изображениям после завершения эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вышеуказанный раздел был воспроизведен ещё на шести микроканалах примерно в течение 48 часов после первоначального эксперимента с аналогичными условиями.

10. Накопление Z-стека

1. В конце каждого экспериментального запуска выберите три канала и получите z-стеки из трёх секций вдоль них с увеличением 40× откройте Multidimensional Acquisition > Main: отмечьте все опции, кроме «Z Series».
2. Перейдите к серии Z после того, как участок вдоль канала выбран в Multidimensional Acquisition , и измените > Интерактивные настройки: Increment: 0.5 и снимите галочки с обеих галочок.
3. Используйте ручку фокусировки микроскопа и вращайте её до тех пор, пока биопленка не станет в фокусе, и введите z-расстояние, выбрав Set Top To Current. Повторите эту процедуру, но повернув фокусировочную ручку в противоположную сторону и выбрав Set Bottom To Current. Это даёт микроскопу дальность для захвата z-стека.
4. Выберите папку в окне «Сохранение », чтобы сохранить z-стек, и выберите «Приобрети » в правом нижнем углу окна, чтобы начать приобретение.

11. Анализ изображений и данных после эксперимента

1. Получите данные о покрытии поверхности биопленки в процентах.
   1. Загрузите полученные изображения в системное программное обеспечение, выбрав: Аналитические инструменты > Просмотр многомерных данных > Выберите Базовый файл > Выберите Каталог: перейдите к папке с сохраненными изображениями > Просмотр > длину волны 1 , а в центральной квадратной секции, горизонтально отображающей количество полученных изображений, кликните правой кнопкой мыши по маленькому серому окну вверху, Левый угол.
   2. Загрузите изображения каждого раздела канала по одному, выберите позицию этапа: выберите позицию для просмотра > загрузить изображение. Сохраните серию изображений в формате TIFF.
   3. Определите порог, выбрав Threshold Image > Auto Threshold for Dark Objects, выделяющие биопленку, затем окаймите изображение с помощью инструмента Rectangular Region .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ползунок слева на пороговом изображении можно двигать вверх и вниз, чтобы изменить пороговую интенсивность и лучше различать биопленку от фона. Если на изображении есть тени, оправьте секцию без их выделения, так как тени могли быть выделены по умолчанию, изменяя значения измерения.
   4. Получите данные о процентном покрытии поверхности биопленки на изображении за 24-часовой эксперимент, выбрав MM Standard > Measure > Region Measurements в системном программном окне для создания таблицы данных о выделенной биопленке внутри прямоугольной границы, включая пороговую площадь %. Выберите Open Log , чтобы открыть и сохранить файл журнала, и F9: Log Data для ввода данных в файл журнала.
   5. Откройте таблицу и, используя 24-часовые данные биопленки для каждого участка канала, создайте график, показывающий процент покрытия поверхности биопленки за 24 часа.
2. Определите толщину биопленки и арифметическую среднюю шероховатость поверхности.
   1. Сохранил z-стек в Fiji (ImageJ), перетащив сохранённый файл в панель управления Fiji и конвертируя в 8-битное изображение: Image > Type > 8-bit.
   2. Увеличьте контраст между биопленкой и поверхностью канала, чтобы устранить нежелательный шум: Изображение > Регулировать > яркость/контраст.
   3. Определите порог изображения, установив значение пикселя биопленки 255 (белый) и значение пикселя фона 0 (чёрный): Image > Adjust > Threshold.
   4. Установите масштаб изображения, Проанализируйте > Установите масштаб > Расстояние в пикселях: 2048 > Известное расстояние: 332,8 > Соотношение сторон пикселей: 1,0 > Единица длины: мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Известное расстояние составляет 332,8 мкм, так как используемая камера Hamamatsu имеет поле обзора 2048 × 2048 пикселей, каждый пиксель имеет размер 6,5 мкм, а изображения были сделаны с увеличением 40 ×.
   5. Анализируйте Z-стек с помощью пользовательского^{макроса 18} (Дополнительный файл 1), который вычисляет и суммирует площадь поверхности биопленки на каждом срезе z-стека и использует значения входной шкалы для расчёта толщины серии, что позволяет найти объём. Альтернативно, определите толщину биопленки, разделив рассчитанный объём на площадь поверхности.
   6. Получите арифметические значения средней шероховатости поверхности биопленки из каждой серии z, скачав плагин ImageJ (не Fiji) SurfCharJ и сохраните его в папке плагинов .
   7. Загрузите z-стек в ImageJ, перетащив сохранённый стек на панель управления и преобразовав его в 32-битное изображение: Изображение > Тип: 32-битный.
   8. Создайте график поверхности, показывающий вариацию значений серого по поверхности стека: Проанализировать > профиль графика > Далее: График высокого разрешения. Преобразуйте график высокого разрешения в 32-битный.
   9. Получите арифметическое среднее значение шероховатости поверхности, инициируя плагин SurfCharJ: Плагины > SurfCharJ > Вычисление шероховатости: Средняя длина дискретизации (): 10.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плагин SurfCharJ использует различные значения серых вдоль поверхности z-стека для вычисления арифметической средней шероховатости поверхности. Будет составлена таблица с параметрами шероховатости поверхности, единственным интересующим параметром является арифметическая средняя шероховатость поверхности, R_a. Значения таблицы нужно будет преобразовать в микрометры из пикселей.

Результаты

В этом разделе изложены репрезентативные результаты при применении вышеуказанной протокольной процедуры. Все эксперименты проводились как минимум с тремя независимыми биологическими репликатами, каждая из которых состояла из шести параллельных каналов, и данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Полоски ошибок во всех графиках обозначают стандартное отклонение, как определено в легендах рисунков.

Рост штаммов PAO1 и PA14 при 37 °C в ср...

Обсуждение

Несколько критически важных этапов, составляющих этот протокол, позволяют проводить более комплексный и точный анализ образования биопленки по сравнению с альтернативными, более традиционными методами. Ключевым компонентом является использование микроканальной пластины с 48 лунками и микромасштабными каналами размером 350 мкм × 70 мкм × 4 мм (W × H × L). Эти размеры конкретно воспроизводят условия потока и микросреды, встречающиеся в больничных условиях, такие как мочевыводящие катетеры ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
(NH4)2SO4	Acros Organics	7783-20-2	Для модифицированного FAB-среды
Микроканальная пластина с 48 лунками 0-2 Па — стеклянная крышка	Клеточные микросистемы	910-0047-5Pack	Микроканалы для потока медиа и роста биопленки с использованием изображения в реальном времени
-80 и градус; C Freezer	Термо Фишер Сайентифик	1.16057E+15	Хранить запасы глицерила до дальнейшего использования
Агар, бактериологический класс	Acros Organics	443570010	Для агаровых пластин — культивирование бактерий
Аналитический баланс	VWR	VWRI611-2297	Для измерения компонентов используемых носителей
Автоклав	Приорклав	4304	Для стерилизации стеклянной посуды
BioFlux 1000HT	I& L Biosystems	https://il-biosystems.com/cell- microsystems/device/bioflux-1000ht- система сдвигового потока/	Для экспериментов по микроканальному потоку и росту биопленок
Модуль управления BioFlux	I& L Biosystems	https://il-biosystems.com/cell- microsystems/device/bioflux-1000ht- система сдвига потока/	Настраивать и контролировать поток медиа и рост биопленки внутри микроканалов
Программное обеспечение для монтажа BioFlux	I& L Biosystems	https://il- biosystems.com/app/uploads/2025/01/Bi oFlux_Overview_.pdf	Настраивать и контролировать поток медиа и рост биопленки внутри микроканалов
CaCl2	Fisher Scientific	10043-52-4	Для модифицированного FAB-среды
CaSO4.2H2O	ChemCruz	A1719	Для минимального металлического раствора объёмом 1 л
Прозрачная полистироловая пластина с 96 скважинами	Корнинг, Костар	CLS7007	Для жизнеспособного количества клеток
CoSO4.7H2O	Сигма-Олдрич	10026-24-1	Для минимального металлического раствора объёмом 1 л
CuSO4.5H2O	Honeywell	209198-100G	Для минимального металлического раствора объёмом 1 л
Лампы Эппендорфа 3810X	Эппендорф	30125150	Для запасов глицерина P. aeruginosa
FeSO4.7H2O	VWR International Ltd.	284005E	Для минимального металлического раствора объёмом 1 л
Фиджи (ImageJ)	Национальные институты здравоохранения	https://imagej.net/software/fiji/downloa DS	Обработка изображений в Z-стеке
Глюкоза	Сигма-Олдрич	50-99-7	Для глюкозо-модифицированной среды FAB
Глицерин	Сигма-Олдрич	56-81-5	Для запасов глицерина P. aeruginosa
H3BO3	Fisher Scientific	10043-35-3	Для минимального металлического раствора объёмом 1 л
Hamamatsu Orca-Flash 4.0 Камера модели C11440- 42U	Хамамацу	C11440-42U	Для микроканального потока и роста биопленок экспериментируйте с изображением в реальном времени
KH2PO4	Биореагенты Fisher	7778-77-04	Для модифицированного FAB-среды
Метилированный дух	Сигма-Олдрич	2857	Для очистки микробиологического шкафа до и после
MgCl2	Сигма-Олдрич	M8266-100G	Для модифицированного FAB-среды
Кабинет микробиологии II класса	Термо Фишер Сайентифик	42111226	Чтобы выполнить протокольные шаги без загрязнения бактерий, бульона или агара без
Мини-инкубатор	Labnet International	sn03171014	Для оттаивания PAO1 и PA14 после -80 и градусов; C морозильник и для первоначального 24-часового роста бактериальной агарной пластины
MnSO4. H2O	Сигма-Олдрич	10034-96-5	Для минимального металлического раствора объёмом 1 л
Na2HPO4.2H2O	Сигма-Олдрич	10102-40-6	Для модифицированного FAB-среды
NaCl	Сигма-Олдрич	S5886-500G	Для модифицированного FAB-среды
NaMoO4. H2O	Сигма-Олдрич	10102-40-6	Для минимального металлического раствора объёмом 1 л
Прецизионный баланс	VWR	VWRI611-2299	Для измерения компонентов используемых носителей
Рефрижераторная центрифуга	Гереус	40289841	Разделение культуры P. aeruginosa от супернатанта для глицерилов
Полу-микро кюветы	Alpha Laboratories	X72053	Для измерений оптической плотности
Инкубатор «Трясущийся»	INFORS HT	https://infors- ht.com/en/products/incubator- шейкеры/мультитрон стандарт	Для ночных культур
Цитрат натрия	Сигма-Олдрич	71498-250G	Для среды с модифицированным FAB на основе цитратного натрия
Стерильные пластиковые инокуляционные петли	Микроспецификация	15782105	Для инокуляции P. aeruginosa PAO1 и PA14 в агарные пластины и соколиные трубки
Триптический соевый агар, вегетарианский	Миллипор	14432-500G-F	Для агаровых пластин — культивирование бактерий
Триптический соевый бульон	Сигма-Олдрич	T8907	Обезвоженные культурные среды — 6 г/200 мл
Диспенсер типа 1	Термо Фишер Сайентифик	SN42103311	Для дистиллированной воды
ZnSO4.7H2O	Fisher Scientific	7446-20-0	Для минимального металлического раствора объёмом 1 л