Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Модель термического повреждения с помощью монополярного радиочастотного устройства на седалищном нерве у мышей

201 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69998

⸱

3 апреля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pain Management, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, 2National Medical Center for Neurological Diseases, 3National Clinical Research Center for Geriatric Diseases

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании применялись радиочастотные системы к седалищным нервам мышей, установив модель радиочастотной абляции термического повреждения нервов. Этот подход решает вопросы контроля в моделях термических повреждений периферических нервов у мышей, предоставляя практический метод моделирования для исследований восстановления повреждений нервов и нейропатической боли.

Аннотация

Повреждение периферических нервов часто вызывает невропатическую боль и запускает процессы восстановления нервов. Хотя управляемые модели физических травм уже хорошо зарекомендованы, существующие модели термических повреждений остаются исследовательскими и демонстрируют слабую управляемость. В клинической практике системы радиочастотной абляции (RFA) часто применяются для индуцирования термических повреждений тканей и нервов. RFA — это терапевтический метод, который доказал эффективную эффективность блокировки передачи боли, вызывая термические повреждения нервов. Степень абляции может быть изменена путём корректировки определённых параметров, а также степени онемения и моторной функции в области распределения нервов. В этом исследовании использовалась монополярная радиочастотная система для создания стабильной, контролируемой модели повреждения нервов в седалищном нерве мышей путём применения 75°C в течение 30 секунд. Значительное повышение порога механической отмены (MWT) наблюдалось с 7 по 14 день после операции, а восстановление наступило к 28-му дню. Это исследование решает существующий пробел в моделях повреждения нервов РВА, воспроизводит клинические повреждения нервов после процедур РВА и предоставляет методологическую основу для последующих исследований повреждения нервов, вызванных РФА.

Введение

Невропатическая боль представляет постоянные трудности в клиническом лечении, поскольку её болевые механизмы продолжают изучаться. Для изучения молекулярных и клеточных механизмов невропатической боли, успешно применяются методы связки спинномозгового нерва (SNL)1, хронического сужения травмы (CCI)2, частичной связки седалищного нерва (pSNL)3, пересечения седалищного нерва (SNT)4 и повреждения спасённого нерва (SNI)5 у грызунов для имитации периферического физического повреждения нервов. Для повышения управляемости и устойчивости модели предыдущие исследования предлагали улучшения, такие как манометры и селективные повреждения, которые были реализованы.

Хотя радиочастотные технологии дали благоприятные клинические результаты, они также связаны с рядом побочных эффектов. Например, радиочастотная абляция (RFA), используемая для гемостаза вовремя операции 6, может вызвать термические повреждения окружающих тканей и создавать риск термического повреждения периферических нервов из-за высокой температурыкончика 7 инструмента. Кроме того, РФА для лечения тройничной невралгии8, постгерпетическойневралгии 9 и других невропатических болевых состояний снижает первичную боль после операции, но сопровождается длительной послеоперационной онемением в иннервированной области, поверхностной гипералгезией и другими дискомфортами10,11. В результате исследования термических повреждений периферических нервов постепенно привлекают внимание. Однако существующие модели на животных не способны точно контролировать температуру, продолжительность и место термического повреждения, что ограничивает однородность тяжести травмы.

В предыдущих исследованиях использовались теплопроводящие стержни, соединённые с водянойбаней постоянной температуры 12 , или насос горячей воды для впрыска горячей воды в резиновую трубку, непосредственно контактирующую снервом 13, с целью имитации теплового воздействия РЧА на повреждение нервов. Однако предыдущие модели термических повреждений вызывали только термические повреждения, тем самым устраняя влияние радиочастотного тока и его параметров на нервы. Остаётся ли изучено, связано ли повреждение от РЧА исключительно тепловым воздействием или же такие факторы, как изменения параметров радиочастоты, также оказывают определённое воздействие на нервы. В настоящее время отсутствие животных моделей, напрямую использующих радиочастотные системы термического свертывания при повреждении нервов, препятствует развитию исследований повреждений нервов, связанных с RFA. В этом исследовании напрямую использовалась монополярная система RFA для моделирования повреждения нервов, связанной с процедурами RFA в клинических условиях, индуцируя повреждение радиалисом у мышей. Она предоставляет методологический справочник для фундаментальных исследований повреждения периферических нервов от РЧА.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эксперименты на животных были одобрены Комитетом по этике животных Центра экспериментальных животных, больницы Сюаньу, Столичного медицинского университета, и проводились в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных14. Взрослые самцы мышей C57BL/6 (8–10 недель, 20–25 г) содержались в группах (по 4–5 в клетке) в контролируемых условиях окружающей среды (22 ± 2 °C, влажность 50%–60%, 12-часовой цикл свет/темнота с включением света в 07:00) с иммиграционным доступом к стандартной еде и воде для грызунов. Все поведенческие оценки проводились в световой фазе между 08:00 и 12:00. Подробности о реагентах, программном обеспечении и оборудовании приведены в Таблице материалов.

1. Анестезия и подготовка мышей

  1. Анестезируйте мышей путём внутрибрюшинной инъекции раствора триброметанола 20 мг/мл при дозе 0,2 мл на 10 г массы тела.
  2. Закройте оба глаза глазной мазью с помощью аппликатора из ваты.
  3. Положите мышей в левое боковое положение. Удалите волосы с правой стороны тела (1 см × 1 см) электрической бритвой (рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап увеличивает площадь контакта между торсом и отрицательной пластиной цепи для снижения сопротивления цепи.
  4. Поместите часть торса мыши в контакт с металлической отрицательной электродной пластиной в правом боковом положении. Нанесите несколько капель ионной жидкости (0,9% NaCl или модифицированный раствор Рингера; см. Таблицу материалов для состава) к зоне контакта между торсом и пластиной для повышения электрической проводимости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что голова и лицо остаются вне отрицательной пластины, чтобы предотвратить непреднамеренное воздействие тока на глаза или другие органы.
  5. Закрепите левую заднюю конечность в положении вверх, согнув колено с помощью клейкой ленты на отрицательной пластине электрода. Удалите волосы в области левого бедра и трижды продезинфекцируйте место операции этанолом 75%.
  6. Подтвердите достаточную глубину анестезии перед продолжением, проверив отсутствие реакции на отмену на щипкающий стимул, приложенный к задней конечности или хвосту.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте введения местных анестетиков (например, лидокаина) или нестероидных противовоспалительных препаратов (например, ацетаминофена) в периоперационном периоде, так как эти препараты могут влиять на послеоперационную нейроповеденческую оценку.

2. Радиочастотная абляционная хирургия

  1. Используйте бедренную кость в качестве ориентира. С помощью микроножниц вырезают разрез на коже диаметром 1 см в направлении длинной оси бедренной кости с латеральным сдвигом 0,5 см в хвостовую сторону (рисунок 2).
  2. Грубо рассечьте мышцу бицепса бедра (BFM) вдоль кожного разреза и найдите основной ствол седалищного нерва с помощью микрощипцев. Седалищный нерв разделяется на две части возле коленного сустава (рисунок 3).
  3. С помощью микрощипцев расчленяют ствол седалищного нерва от окружающей ткани примерно на 2 мм выше бифуркации седалищного нерва, до длины примерно 5 мм. Избегайте повреждений кровеносных сосудов при тупом разделении.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В случае случайного повреждения сосудов используйте стерильную ватную палочку, чтобы впитать кровь и приложить соответствующее давление для остановки кровотечения. Продолжайте операцию после того, как кровь не будет просачиваться.
  4. Подключите иглу коагуляции RFA к устройству радиочастотной обработки. Положите кончик иглы ровно на мышечную ткань, чтобы проверить сопротивление. Если сопротивление превышает 1 кОм, добавьте ионную жидкость между телом мыши и отрицательной пластиной с помощью капельницы, пока сопротивление не опустится ниже 1 кОм.
  5. Аккуратно поднимите отделённый седалищный нерв стеклянной минутной стрелкой. Поместите иглу RFA под седалищный нерв, при этом открытый металлический кончик расположен в 3 мм от бифуркации седалищного нерва (рисунок 4).
  6. Параметры радиочастотного терапевтического прибора установите следующим образом: режим термической коагуляции, 75 °C, 30 с, частота 2 Гц и ширина импульса 1 мс. Активируйте подачу энергии RFA.
  7. Аккуратно убрате стрелку RFA. Переместить седалищный нерв с помощью пинцета для поднятия мышечной ткани. Закройте мышцу швом 6-0 ассорбуемой полигликолевой кислоты (PGA). Закройте кожный разрез швом 4-0 впитывающейся PGA.
  8. После операции положите мышей на теплое одеяло с циркуляцией (38 °C) или термостатически контролируемую грелку (37–38 °C), покрытую туалетной бумагой или полотенцем, чтобы волосы высохли и предотвратили прямое повреждение от тепла.
  9. Верните мышей в клетку и дождитесь восстановления после наркоза. Регулярно следите за содержанием и ежедневно проверяйте целостность разреза, а также следите за потреблением пищи, водой и общим состоянием тела.

3. Экспериментальная группа

  1. Группа РФА: выполните полный протокол хирургической процедуры РФА, описанный в шагах 2.1–2.9.
  2. Фиктивная группа: выполните те же процедуры, что и группа RFA (шаги 2.1–2.5 и 2.7–2.9), но не активируйте доставку системы RFA на шаге 2.6. Удержите иглу RFA под седалищным нервом в течение 30 секунд без активации тока, затем переходите к шагу 2.7.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Группа Sham контролирует хирургическую травму, анестезию, манипуляцию нервами и установку игл независимо от термических повреждений.

4. Оценка фон Фрея для MWT

  1. Перед каждым тестом случайным образом помещайте мышей на тестовую платформу фон Фрея. Дайте акклиматизации 15 минут, пока исследовательское поведение не прекратится.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Платформа состоит из металлической сетки с отверстиями размером 0,6 см × 0,6 см внизу и несколькими красными прозрачными контейнерами для мышей, которые размещаются в разных контейнерах, не мешая друг другу.
  2. Проведите оценку фон Фрея с помощью методавверх-вниз 15. Примените волокнистую проволоку фон Фрея, чтобы пробудить середину подошвы левой задней лапы с достаточной силой, чтобы вызвать лёгкий сгиб. Держитесь 3 секунды или до реакцииотмены 16.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начните тестирование с филамента весом 0,4 г. Нанесите следующий более высокий филамент после отрицательного ответа или следующий нижний филамент после положительного. Продолжайте для четырёх дополнительных заявок после первой смены направления. На практике в этом исследовании был установлен верхний предел 2 g, потому что при такой силе волокно фон Фрея поднимало переднюю лапу над землёй, не проявляя реакции на побег или отступление.
  3. Записывайте ответы и рассчитывайте 50% MWT с помощью калькулятора метода вверх-вниз (метод вверх-вниз для экспериментов фон Фрея, https://bioapps.shinyapps.io/von_frey_app/).
  4. Проводите тесты фон Фрея на начальном уровне (до операции) и в послеоперационные дни 7, 14, 21, 28 и 35.

5. Сбор тканей DRG и иммунофлуоресцентное окрашивание

  1. На 7-й день после операции собирайте L4–L6 DRG из групп RFA и Sham.
  2. Зафиксируйте ткани в 10% сахарозно-параформальдегиде при 4 °C в течение 6–12 часов.
  3. Криопротектив ткани в 30% сахарозе-PBS при 4 °C на ночь.
  4. Внедрить ткани в оптимальную температуру резки17.
  5. Вырезать криосечения диаметром 13 мкм и проникнуть срезы неионным поверхностно-активным веществом.
  6. Блокировать с помощью блокирующего реагента и инкубировать на ночь поликлональными антителами при 4 °C.
  7. После мытья инкубировать с вторичным антителом 2 часа при комнатной температуре.
  8. Крепите с помощью антифейд-медиума.

6. Статистический анализ

  1. Представлять нормально распределенные непрерывные данные как среднее ± стандартную ошибку среднего значения (SEM).
  2. Проведите сравнения между группами с использованием независимого t-теста выборок.
  3. Анализировать внутригрупповые сравнения в разных временных точках с помощью анализа дисперсии с повторяющимися измерениями (ANOVA).
  4. Примените коррекцию Бонферрони для пост-хок парных сравнений.
  5. Обрабатывайте все данные с помощью статистического программного обеспечения и устанавливайте статистическую значимость в P < 0,05.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Успешное создание модели было подтверждено как внутриоперационными, так и послеоперационными показателями. После завершения РФА (75 °C, 30 с) при отъятии наблюдалась лёгкая адгезия между кончиком иглы RFA и седалищным нервом. Эта адгезия возникает в результате локализованной денатурации и свертывания белков в месте контакта и указывает на соответствующую подачу тепловой энергии наряду с прямым контактом с нервами. Отсутствие спайки может указывать на смещение иглы во время процедуры, что...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

С быстрым развитием малоинвазивной хирургии радиочастотные технологии становятся всё болеераспространёнными 6,7,18. По мере расширения радиочастотных технологий в клинической практике связанные исследования способствовали их широкому распространению. Однако влияние радиочастотного тока на ткани требует дальнейших исследований, особенно после применения радиочастотных технологий для лечения невро...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конкурирующих интересах.

Благодарности

Это исследование поддерживается Программой конвергенции талантов больницы Сюаньу (HZ2025PYDTR009) и фондами Capital for Health Improvement and Research (CFH2024-2-2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Шов 4-0Медицина ЦзиньхуаньC412Закройте кожу
Шов 6-0Медицина ЦзиньхуаньKCR631Закройте мышечный слой
Вторичное антитело Alexa Fluor 488ИнвитрогенA-11008Вторичные антитела
ATF3 к поликлональному антителу кроликаNovus BiologicalsNBP1-85816Поликлональное антитело
Изогнутые тонкие щипцыBeyotime BiotechnologyFS031Разрез мышц и фасции
Монтажный медиум DAPI antifadeBeyotime BiotechnologyP0131Антифейд среда
Стеклянная минутная стрелкаYuyan InstrumentsBLFZ10Поднимите нерв
GraphPad PrismGraphpad Software, LLCверсия 9.0Выходные изображения данных
МикроножницыBeyotime BiotechnologyFS217Разрез кожи
Модифицированное Ringer' s решениеСамоподготовкаН/ДЛактат натрия 3,10 г/л; NaCl 6,00 г/л; KCl 0,30 г/л; CaCl2 и миддот; 2H2O 0,20 г/л
Держатель для иглыYuyan InstrumentsY3210Держите иглы
Решение для блокировки QuickBlockBeyotime BiotechnologyP0260Блокирующий реагент для иммунофлуоресценции
Радиочастотное терапевтическое устройствоCosman MedicalRFG-1AРадиочастотная система
Радиочастотный термокоагуляционный электрод трокарCosman MedicalTCD-10Изолированная радиочастотная стрелка
Инъекция натрия лактата РингераСычуань  Kelun  Pharmaceutical Co.,  Ltd86902180001566Ионная жидкость для уменьшения резистентности
Статистика SPSSIBM CorpВерсия 27.0Программное обеспечение для статистического анализа
Прямые тонкие щипцыBeyotime BiotechnologyFS027Разрез мышц и фасции
Волоконная проволока фон ФреяDanmic GlobalAesthesio Semmes-WeinsteinТест поведения

Ссылки

  1. Schäfers, M., Cain, D. Single-Fiber Recording: in vivo and in vitro preparations. Methods in molecular medicine. Luo, Z. D. , Humana Press. Totowa, NJ. 155-166 (2004).
  2. Vissers, K., Adriaensen, H., De Coster, R., De Deyne, C., Meert, T. F. A chronic-constriction injury of the sciatic nerve reduces bilaterally the responsiveness to formalin in rats: A behavioral and hormonal evaluation. Anesth Analg. 97 (3), 520-525 (2003).
  3. Malmberg, A. B., Basbaum, A. I. Partial sciatic nerve injury in the mouse as a model of neuropathic pain: Behavioral and neuroanatomical correlates. Pain. 76 (1-2), 215-222 (1998).
  4. Moore, K. A., et al. Partial peripheral nerve injury promotes a selective loss of GABAergic inhibition in the superficial dorsal horn of the spinal cord. J Neurosci. 22 (15), 6724-6731 (2002).
  5. Cichon, J., Sun, L., Yang, G. Spared nerve injury model of neuropathic pain in mice. Bio Protoc. 8 (6), e2777(2018).
  6. Smith, T. L., Smith, J. M. Electrosurgery in otolaryngology–head and neck surgery: Principles, advances, and complications. Laryngoscope. 111 (4 Pt 1), 769-780 (2001).
  7. Advincula, A. P., Wang, K. The evolutionary state of electrosurgery: Where are we now. Curr Opin Obstet Gynecol. 20 (4), 353-358 (2008).
  8. Habib, H. E. A. A., Ellakany, M. H., Elnoamany, H., Elnaggar, A. G. Microvascular decompression versus radiofrequency ablation in trigeminal neuralgia of the maxillary and mandibular divisions. Asian J Neurosurg. 19 (2), 221-227 (2024).
  9. Zhang, H., Ni, H., Liu, S., Xie, K. Supraorbital nerve radiofrequency for severe neuralgia caused by herpes zoster ophthalmicus. Pain Res Manag. 2020, 3191782(2020).
  10. Wu, C., Lv, Y., Wang, C., Zhong, C. Efficacy of semilunar ganglion radiofrequency thermal coagulation in moderate and severe trigeminal postherpetic neuralgia and its impact on serum IL-1β and IL-6 levels. Eur J Med Res. 30 (1), 1005(2025).
  11. Gazelka, H. M., et al. Incidence of neuropathic pain after radiofrequency denervation of the third occipital nerve. J Pain Res. 7, 195-198 (2014).
  12. Dong, Y., et al. Neuropathologic damage induced by radiofrequency ablation at different temperatures. Clinics. 77, 100005(2022).
  13. Konno, S., et al. Acute thermal nerve root injury. Eur Spine J. 3 (5), 299-302 (1994).
  14. National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th ed, Natl. Acad. Press. Washington, DC. (2011).
  15. Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
  16. Christensen, S. L., et al. Von Frey testing revisited: Provision of an online algorithm for improved accuracy of 50% thresholds. Eur J Pain. 24 (4), 783-790 (2020).
  17. He, L., et al. A procedure for mouse dorsal root ganglion cryosectioning. J Vis Exp. (195), e65232(2023).
  18. Odell, R. C. Electrosurgery: Principles and safety issues. Clin Obstet Gynecol. 38 (4), 610-621 (1995).
  19. Zinder, D. J. Common myths about electrosurgery. Otolaryngol Head Neck Surg. 123 (4), 450-455 (2000).
  20. Al-Zain, F., Lemcke, J., Killeen, T., Meier, U., Eisenschenk, A. Minimally invasive spinal surgery using nucleoplasty: A 1-year follow-up study. Acta Neurochir (Wien). 150 (12), 1257-1262 (2008).
  21. Yu, X., et al. Changes of functional, morphological, and inflammatory reactions in spontaneous peripheral nerve reinnervation after thermal injury. Oxid Med Cell Longev. 2022, 9927602(2022).
  22. Boerboom, A., Dion, V., Chariot, A., Franzen, R. Molecular mechanisms involved in Schwann cell plasticity. Front Mol Neurosci. 10, 220(2017).
  23. Zhu, J., Luo, G., He, Q., Yao, M. Evaluation of the efficacy of unipolar and bipolar spinal dorsal root ganglion radiofrequency thermocoagulation in the treatment of postherpetic neuralgia. Korean J Pain. 35 (1), 114-123 (2022).
  24. Chang, M. C., Cho, Y. W., Ahn, S. H. Comparison between bipolar pulsed radiofrequency and monopolar pulsed radiofrequency in chronic lumbosacral radicular pain: A randomized controlled trial. Medicine. 96 (14), e6236(2017).
  25. Elemam, E. M., Abdel Dayem, O. T., Mousa, S. A., Mohammed, H. M. Ultrasound-guided monopolar versus bipolar radiofrequency ablation for genicular nerves in chronic knee osteoarthritis pain: A randomized controlled study. Ann Med Surg (Lond). 77, 103680(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.