Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Анализ маммосферы выявил стволость, индуцированную Api5, в неопухологенных эпителиальных линиях клеток молочной железы

742 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69999

⸱

24 февраля 2026 г.

 , 
1Biology Department, Indian Institute of Science Education and Research

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает метод установки анализа образования маммосферы для изучения индуцированной стволости рака ингибитора апоптоза 5 (Api5) в неопухологенных эпителиальных клетках молочной железы. Лизаты, собранные из маммосфер первичного поколения, анализируются на наличие различных маркеров ствола для оценки индукции свойств, похожих на стволовые клетки.

Аннотация

Рак молочной железы остаётся самым распространённым видом рака среди женщин в мире, с самой высокой возрастной стандартизированной заболеваемостью и смертностью. Несмотря на достижения в терапии, направленной против рака молочной железы, у 20% пациентов наблюдается рецидив заболевания, что может быть связано с популяцией устойчивых к терапии стволовых клеток рака (CSC). Эти CSC могут выживать при традиционном лечении, оставаясь в состоянии покоя или сохраняться из-за неполной резекции опухоли, что приводит к рецидиву на более поздней стадии. Поэтому недавние исследования сосредоточены на выявлении, изоляции и целенаправленности на эту устойчивую популяцию клеток. In vitro анализ формирования маммосферы служит надёжной трёхмерной системой суспензии для обогащения и размножения стволоподобных клеток внутри эпителиальных популяций молочной железы. Здесь мы представляем подход, использующий мамосферный анализ для оценки фенотипа, похожего на раковые стволовые клетки, который возможен в неопухологенных эпителиальных клетках молочной железы из-за сверхэкспрессии ингибитора апоптоза 5 (Api5). Протокол включает распространение маммосфер через последовательные проходы для оценки эффективности формирования маммосфер и их способности к самообновлению. Кроме того, белковые лизаты, собранные из маммосфер, обследуются на наличие установленных маркеров ствола с помощью иммуноблотинга. Этот анализ позволяет исследовать новые регуляторы, такие как Api5, свойства, похожие на стволовые клетки рака, в популяциях эпителиальных клеток молочной железы. Описанный подход может быть адаптирован для сравнительных исследований молекулярных вмешательств или для скрининга терапевтических агентов, направленных на CSC in vitro.

Введение

Рост числа онкологических заболеваний, устойчивых к химиотерапии, привёл к всё большему акценту на выявление и устранение основной причины устойчивости к терапии и рецидива — популяции раковых клеток, известных как стволовые клетки рака. Эти клетки характеризуются способностью избегать дифференцировки и оставаться в покое, что позволяет им сопротивляться различным методам лечениярака 1,2. Для идентификации стволовых клеток рака молочной железы могут использоваться различные методы, включая анализ формированиямаммосферы 3,4,5, сортировку клеток по маркерамповерхности клеток 6,7, выделение по свойствам вытока, анализ опухолигенности in vivo 7 и оценку модуляторов ядра стволовых клеток, таких как Oct48,Nanog 9, Sox210 иBMI 11. Обычно идентификация и изоляция стволовых клеток рака включает комбинацию одного или нескольких из этих методов.

Ингибитор апоптоза 5 (Api5) — это антиапоптотический белок, который был обнаружен как повышенный в нескольких видах рака, включая рак молочнойжелезы 12,13,14, рак шейки матки 15,16,17, B-клеточную хроническую лимфоиднуюлейкемию 18 и немелкоклеточный раклёгких 19. Высокие уровни Api5 связаны с резистентностью к химиотерапии при16-м отрезке шейки матки и тройной отрицательной ракемолочной железы 12. Появляется всё больше доказательств того, что устойчивость к терапии и рецидив часто вызваны раковыми стволовымиклетками 20,21. Интересное исследование Сонга и др.22 показало, что избыточная экспрессия Api5 в клетках рака шейки матки приводит к повышению уровня Nanog, что способствует увеличению ствола рака. Предыдущие исследования нашей лаборатории показали, что избыточная экспрессия Api5 приводит к трансформации неопухологенных эпителиальных клеток молочной железы, выращиваемых в 3D-культурах, поддерживаемых Матригелем. Эти трансформированные клетки демонстрируют нарушенную полярность, увеличение пролиферации, рост, независимый от якоря, и частичный фенотип, похожий на переход от эпителия к мезенхиме (EMT). Фенотипические изменения, наблюдаемые при сверхэкспрессии Api5 в трёхмерных культурах, сохранялись после диссоциации сфероидов в монослойныекультуры 14. Учитывая, что Api5 повышен при устойчивых к химиотерапии тройной негативной раковой железы, мы предполагаем, что Api5 также может регулировать свойства стволизации рака в эпителиальных клетках молочной железы.

В этом контексте мы описываем анализ формирования маммосферы для идентификации раковых стволовых клеток из 3D-диссоциированных неопухологенных эпителиальных клеток молочной железы, трансформированных из-за чрезмерной экспрессии Api5, а затем вестерн-блоттинг для маркеров стволовых клеток для подтверждения идентичности этих клеток. Анализ маммосферы включает культивирование эпителиальных клеток молочной железы в условиях, не связанных с присоединением, недифференцирующих факторов, что позволяет обогащать стволоподобные/предшественнические клетки в трёхмерных структурах, известных как маммосферы. Эпителиальные клетки молочной железы, не обладающие стволовыми свойствами, обычно подвергаются аноикис; Однако клетки со стволоподобными характеристиками дают началомаммосферам 4,5. Этот метод был изначально разработан Донту исоавт. 3 и вдохновлён нейросферным анализом, который используется для изучения и идентификации нейронных стволовых клетоки предшественников 23. Описанный здесь анализ маммосферы позволяет оценить активность стволовых клеток и способность к самообновлению в минимальной среде, дополненной витамином B27 без витамина A и рекомбинантным эпидермическим фактором роста человека (EGF). Переэкспрессирующие 3D-диссоциированные клетки Api5 размещаются редко на пластинах, покрытых Poly(2-гидроксиэтилметакрилатом) (pHEMA). Это позволяет клеткам расти в неадгезентных условиях, так что каждая последующая маммосфера имеет клональное происхождение. Маммосферы могут расти до седьмого дня, после чего рассчитывается эффективность формирования маммосферы. Чтобы отличить настоящие стволовые клетки от нестволовых клеток, которые со временем теряют свою пролиферационную способность, проводятся последующие поколения формирования маммосферы. Серийное проходжение маммосфер включает диссоциацию сфер, собранных при первичном потомлении, и воспроизведение отдельных клеток для образования вторичных (и последующих поколений) маммосфер. Это определяет, могут ли клетки многократно инициировать формирование сфер, и количественно измеряется как способность к самообновлениюклеток 5.

Этот метод можно использовать для идентификации стволовых клеток рака молочной железы в опухологенных или трансформированных эпителиальных клетках молочной железы. Метод также может быть адаптирован для выделения стволовых клеток рака молочной железы из образцов пациентов. Система помогает выявлять новые мишени против стволовых клеток рака молочной железы, которые могут быть связаны с устойчивостью к химиотерапии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Покрытие пластин для культуры тканей поли(2-гидроксиэтилметакрилатом), pHEMA

  1. Растворите 1,2 г pHEMA (молекулярная масса ̴ 300 000) в 100 мл этанола 95% путём постоянного помешивания при 65 °C для получения раствора pHEMA с содержанием 1,2% (см. таблицу материалов).
  2. Покрытие стандартных пластин для культуры тканей pHEMA путём нанесения 1 мл на каждую лунку пластины с 6 лунками. Объём раствора pHEMA можно регулировать в зависимости от размера сосуда для культуры тканей.
  3. Дайте тарелкам высохнуть в духовке при 40 °C при стерильных условиях.
  4. Подвергайте пластины ультрафиолетовому излучению в течение 15 минут, затем трижды промывайте с помощью фосфатно-буферного физиологического раствора Dulbecco (DPBS), прежде чем использовать их для подготовки анализа образования маммосферы.

2. Посев маммосфер первичного поколения

  1. Культура 3D диссоциировала клетки MCF10A (контрольная и Api5 гиперэкспрессия), полученные путём диссоциации 3D-культур 16-го дня в ростовойсреде 14.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Состав растительной среды: ДМЭМ с высоким содержанием глюкозы без пирувата натрия, дополненный 5% лошадиной сывороткой, 10 мкг/мл инсулина, 0,5 мкг/мл гидрокортизона, 20 нг/мл рекомбинантного эпидермального фактора роста человека (EGF), 100 нг/мл холерного токсина и 200 единиц/мл пенициллин-стрептомицина (см. Таблицу материалов).
  2. Удалите отработанную среду, промыйте клетки 1 мл DPBS, затем добавьте 500 мкл 0,05% трипсин-ЭДТА и инкубуйте при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5%CO2 в течение 12-15 минут, пока все клетки не будут трипсинированы.
  3. После того как все клетки выведены, добавьте 2 мл ресуспензионной среды для нейтрализации активности трипсина, и вращите суспензию клетки при 112 × г в течение 10 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Состав среды для повторной суспензии: ДМЭМ с высоким содержанием глюкозы без пирувата натрия с добавлением 20% лошадиной сыворотки и 200 единиц/мл пенициллин-стрептомицина.
  4. Аспирировать супернатант и реуспензировать клеточную гранулу в 1 мл мамосферной среды. Пропустите подвеску ячейки через иглу на 25 G, чтобы получить подвеску с одной ячейкой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Состав маммосферной среды: DMEM/F12 с добавлением эпидермального фактора роста 20 нг/мл (EGF), 1 × B27 без витамина A и 200 единиц/мл пенициллин-стрептомицина (см. Таблицу материалов).
  5. С помощью гемоцитометра подсчитайте количество клеток и рассчитывайте объём суспензии клеток, необходимый для засева 0,2 × 104 клеток в каждой скважине.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте низкую плотность посева для точного определения эффективности формирования маммосферы, минимизируя влияние агрегации клеток. При сборе белковых лизатов для иммуноблотинга плотность клеток может быть увеличена до 2,5 ×10,5 клеток на колодцу.
  6. Разбавьте необходимый объём суспензии ячейки в 2 мл мамосферной среды и семя в каждой яме пластины с шестью ямеками. Семенные клетки в тройных экземплярах для каждого состояния.
  7. Инкубировать при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5%CO2 в течение 7 дней.
  8. После семи дней в культуре вручную подсчитайте количество маммосфер диаметром более 50 мкм в каждой яме, используя микроскоп с решёткой или используя сетку в квадрантах под световым микроскопом.
  9. Снимите мамосферы с помощью цифровой камеры, установленной на световом микроскопе с увеличением в 20 раз.
  10. Рассчитайте эффективность формирования маммосферы (MFE) по следующейформуле 5
     Уравнение 1

3. Посев маммосфер вторичного поколения

  1. Соберите маммосферы, сформированные в первом поколении, в трубку объёмом 15 мл и центрифугу при 300 × г в течение 10 минут при комнатной температуре.
  2. Аспирируйте супернатант, оставляя мамосферную гранулу позади.
  3. Промой гранулы DPBS.
  4. Добавьте 200 мкл 0,05% трипсин-ЭДТА в гранулу маммосферы и инкубуйте при 37 °C в увлажнённом инкубаторес содержанием CO2 5% в течение 2-3 минут. Пропустите мамосферы в растворе трипсина через иглу на 25 G три раза, чтобы получить суспензию с одной ячейкой.
  5. Добавьте 0,5 мл ресуспензионной среды для нейтрализации активности трипсина, и вращите ячейку при 112 × г в течение 10 минут при комнатной температуре.
  6. Аспирируйте супернатант и ресуспензируйте клеточную гранулу в 0,5 мл мамосферной среды.
  7. С помощью гемоцитометра подсчитайте количество клеток и рассчитывайте объём суспензии клеток, необходимый для засевания 0,2 × 104 клеток на колодцу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте низкую плотность клеток для оценки способности к самообновлению, минимизируя эффект агрегации клеток.
  8. Разбавьте необходимый объём суспензии ячейки в 2 мл мамосферной среды и семя в каждой яме пластины с шестью ямеками. Семенные клетки в тройных экземплярах для каждого состояния.
  9. Инкубировать при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5%CO2 в течение 7 дней.
  10. После 7 дней в культуре подсчитайте количество маммосфер диаметром более 50 мкм в каждой пластине с помощью микроскопа с решёткой или квадрантной сетки.
  11. Снимите мамосферы с помощью цифровой камеры, установленной на световом микроскопе с увеличением в 20 раз.
  12. Рассчитайте способность самообновления по следующейформуле 5
    Уравнение 2

4. Вестерн блоттинг для выявления изменений маркеров плюрипотентности при гиперэкспрессии Api5

  1. Соберите мамосферы, сформированные в первом поколении, в трубку объёмом 15 мл и центрифугуйте при 300 × г в течение 10 минут при комнатной температуре.
  2. Аспирируйте супернатант, оставляя мамосферную гранулу позади.
  3. Промой гранулы DPBS.
  4. Соберите гранулу в ледяной буфер RIPA для получения белкового лизата и проведите иммуноблотинг согласно стандартномупротоколу 24.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Состав буфера RIPA: 50 мМ трис-HCl (pH 8,0), 150 мМ NaCl, 1% тритон X-100, 0,5% дезоксихолата натрия, 0,1% додецилсульфата натрия (SDS), 1 мМ этилендиаминиететрауксусной кислоты (EDTA), 1 мМ фенилметисульфонилфторида (PMSF), 10 мМ фторида натрия, 1 мМ натрия ортованадат.
  5. Зонд для маркеров ствола — Oct3/4, Nanog, Sox2 и Bmi1, а также контроля нагрузки GAPDH (см. таблицу материалов для разбавления антител).
  6. Количественно измерить уровень белка с помощью денситометрического анализа на ImageJ. Выберите интересующий регион на изображениях Western Blot и сгенерируйте профиль плотности для каждой полосы.
  7. Нормализуйте относительные плотности интересующего белка относительно плотностей GAPDH для каждой полосы. Вычислите изменение складки для каждого белка.
  8. Отображайте изменения уровня белка в складках с помощью любого программного обеспечения для построения графиков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для оценки эффективности формирования маммосферы при неадгезентных условиях контрольные и сверхэкспрессирующие 3D-диссоциированные MCF10A клетки MCF10A были посеяны на пластины, покрытые полиHEMA, согласно протоколу. Клетки, переэкспрессирующие Api5, продемонстрировали среднюю эффективность формирования маммосферы в 1,58 раза по сравнению с контролями (рисунок 1B,C). Это увеличение демонстрирует, что более высокая экспрессия Api5 увеличивает долю предшественников, похожих на...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Хотя монослойные культуры устоявшихся раковых клеток или клеток, полученных от опухолей, дают представление о различных молекулярных путях, регулирующих фенотипы рака, исследования, ориентированные на стволовые клетки рака, нельзя проводить в двумерных культурах. Поскольку считается, что стволовые клетки рака являются основным фактором рецидива после текущих методов лечения, необходимо провести надёжные анализы для изучения этихклеток ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не объявляют потенциального конфликта интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантом от SERB-POWER (SPG/2021/002661-G) и частично финансированием IISER, Pune Core. S.B. финансировалось стипендией UGC-SRF. Мы хотели бы поблагодарить профессора Рэймонда С. Стивенса (Институт исследований Скриппса, США) за щедрое предоставление клеток MCF10A и доктору Абхиджиту К. (Ahammune Biosciences Pvt. Ltd.) за его ценные вклады в подготовку рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0.05% Trypsin EDTA  Invitrogen25300062
37 °C humidified incubatorNew BrunswickGalaxy 170 R
Anti-Bmi1 Rabbit pAbABclonalA134721:1000 разбавление, инкубация на ночь при 4 °C
Anti-GAPDH antibodySigmaG9545-200UL1:10000 разбавление, 1 час инкубации при комнатной температуре
Anti-Nanog Rabbit mAbABclonalA226251:5000 разбавление, инкубация на ночь при 4 °C
Anti-Oct3/4 Antibody (C-10)Santa Cruzsc-52791:300 разбавление, инкубация на ночь при 4 °C
Anti-Sox2 Antibody (E-4)Santa Cruzsc-3658231:300 разбавление, инкубация на ночь при 4 °C
B-27 Supplement (50x), minus vitamin AInvitrogen12587010
CentrifugeBeckman CoulterAllegra X-15R
Cholera toxin Sigma C8052-1MG 1 мг/мл запас в dH2O
DMEM/F12Thermo11330032
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)Invitrogen14190-144
Epidermal growth factor (EGF) Sigma E9644-0.2MG 100 мг/мл запас в dH2O
Ethanol absolute 99.9%Jebsen & Jessen GmbH & Co. Germany58051 L05
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)SRL43272
High glucose DMEM without sodium pyruvateInvitrogen11965126
Horse Serum  Invitrogen16050122
Hydrochloric acid (HCl)QualigensQ29145Используется для корректировки pH Tris-HCl (pH 8.0)
Hydrocortisone Sigma  H08881 мг/мл запас в этаноле
ImageJ Программное обеспечение для обработки изображений
ImageQuant LAS 4000 Cytiva
Immobilon Western chemiluminiscent HRP substrateMerckWBKLS0500
Insulin Sigma I1882 10 мг/мл запас в 1% ледяной уксусной кислоте
Nikon Eclipse TS-100 microscopeNikonBM-1919
MCF10A cellsПодарок от профессора Raymond C. Stevens (Scripps Research Institute, USA)
Penicillin-Streptomycin Lonza 17-602E
Phenylmethysulphonyl fluoride (PMSF)Sigma78830-5G
Plotting software GraphPad Prism 10
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (pHEMA)Santacruzsc-2532841.2% pHEMA в 95% этаноле
Sodium chloride (NaCl)SRL41721
Sodium deoxycholateAmresco0613-100G
Sodium dodecyl sulphate (SDS)SRL54468
Sodium fluoride (NaF)HiMediaRM1081-500G
Sodium orthovanadateSigma-AldrichS6508-10G
Tris bufferSRL71033
Triton X-100SigmaT8787-250ML

Ссылки

  1. Li, X., et al. Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy. J Natl Cancer Inst. 100 (9), 672-679 (2008).
  2. Creighton, C. J., et al. Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (33), 13820-13825 (2009).
  3. Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
  4. Grimshaw, M. J., et al. Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells. Breast Cancer Res. 10 (3), R52(2008).
  5. Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
  6. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  7. Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Res. 65 (13), 5506-5511 (2005).
  8. Kim, R. J., Nam, J. S. OCT4 expression enhances features of cancer stem cells in a mouse model of breast cancer. Lab Anim Res. 27 (2), 147-152 (2011).
  9. Lu, X., Mazur, S. J., Lin, T., Appella, E., Xu, Y. The pluripotency factor nanog promotes breast cancer tumorigenesis and metastasis. Oncogene. 33 (20), 2655-2664 (2014).
  10. Leis, O., et al. Sox2 expression in breast tumours and activation in breast cancer stem cells. Oncogene. 31 (11), 1354-1365 (2012).
  11. Paranjape, A. N., et al. Bmi1 regulates self-renewal and epithelial to mesenchymal transition in breast cancer cells through Nanog. BMC Cancer. 14 (1), 785(2014).
  12. Bousquet, G., et al. High expression of apoptosis protein (Api-5) in chemoresistant triple-negative breast cancers: an innovative target. Oncotarget. 10 (61), 6577-6588 (2019).
  13. Basset, C., et al. Api5 a new cofactor of estrogen receptor alpha involved in breast cancer outcome. Oncotarget. 8 (32), 52511-52526 (2017).
  14. Kuttanamkuzhi, A., Panda, D., Malaviya, R., Gaidhani, G., Lahiri, M. Altered expression of anti-apoptotic protein Api5 affects breast tumorigenesis. BMC Cancer. 23 (1), 374(2023).
  15. Cho, H., et al. Apoptosis inhibitor-5 overexpression is associated with tumor progression and poor prognosis in patients with cervical cancer. BMC Cancer. 14 (1), 545(2014).
  16. Jang, H. S., et al. API5 induces cisplatin resistance through FGFR signaling in human cancer cells. Exp Mol Med. 49 (9), e374(2017).
  17. Song, K. H., et al. Apoptosis inhibitor 5 increases metastasis via Erk-mediated MMP expression. BMB Rep. 48 (6), 330-335 (2015).
  18. Krejci, P., et al. The antiapoptotic protein Api5 and its partner, high molecular weight FGF2, are up-regulated in B cell chronic lymphoid leukemia. J Leukoc Biol. 82 (6), 1363-1364 (2007).
  19. Koci, L., et al. Apoptosis inhibitor 5 (API-5; AAC-11; FIF) is upregulated in human carcinomas in vivo. Oncol Lett. 3 (4), 913-916 (2012).
  20. Phi, L. T. H., et al. Cancer stem cells (CSCs) in drug resistance and their therapeutic implications in cancer treatment. Stem Cells Int. 2018 (1), 5416923(2018).
  21. Zhou, H. M., Zhang, J. G., Zhang, X., Li, Q. Targeting cancer stem cells for reversing therapy resistance: mechanism, signaling, and prospective agents. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 62(2021).
  22. Song, K. H., et al. API5 confers cancer stem cell-like properties through the FGF2-NANOG axis. Oncogenesis. 6 (1), e285(2017).
  23. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
  24. Bodakuntla, S., Libi, A. V., Sural, S., Trivedi, P., Lahiri, M. N-nitroso-N-ethylurea activates DNA damage surveillance pathways and induces transformation in mammalian cells. BMC Cancer. 14 (1), 287(2014).
  25. Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open:a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).
  26. Eyre, R., et al. Patient-derived mammosphere and xenograft tumour initiation correlates with progression to metastasis. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 21 (3-4), 99-109 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Api5
Анализ маммосферы выявил стволость, индуцированную Api5, в неопухологенных эпителиальных линиях клеток молочной железы
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.