Этот протокол представляет распад Рэлея как мягкий процесс аэрозолизации невирусных мРНК-векторов. Региональное осаждение для аэрозольных мРНК-векторов оценивается с помощью модели Alberta Idealized Nasal Inlet (AINI). Экспрессия зелёного флуоресцентного белка (GFP) в клетках лёгких человека отражает поддержание физико-химических и биологических функций постаэрозольных мРНК-векторов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Интраназальная доставка мРНК-полиплексов с помощью аэрозолей для расщепления Рэлея: метод in vitro для назательного отложения и функционального тестирования
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Интраназальная доставка мРНК-терапевтических средств — это перспективная стратегия вакцинации и лечения респираторных заболеваний, обеспечивающая прямую иммунную активацию в месте попадания патогена. Однако традиционные методы аэрозолизации (например, ультразвуковые или небулайзеры высокого давления) разрушают невирусные мРНК-векторы из-за чрезмерных сдвиговых сил, что приводит к потере структурной целостности и биологической активности мРНК. Для плавной аэрозолизации мРНК-векторов полиэтиленимина (ПЭИ) в равномерные капли использовался назальный атомайзер для распада Рэлея. МРНК, кодирующая зелёный флуоресцентный белок (GFP), была сформулирована в катионные полиплексы и охарактеризовала период до и после аэрозолизации. Процесс разрушения Рэлея образует непрерывную микрострую капель с минимальным сдвигом, сохраняя тем самым физико-химические свойства наночастиц. Наблюдались стабильные размеры частиц, низкий индекс полидисперсности и стабильный зета-потенциал до и после аэрозолизации, что подтверждало хорошо сохранение физико-химических свойств мРНК-полиплексов благодаря расщеплению Рэлея для аэрозолизации. Используя модель Alberta Idealized Nasal Inlet (AINI) носовых дыхательных путей, были доставлены аэрозоли PEI-mRNA. Аэрозольные мРНК в основном отлагались в носовых раковинах. Незначительные фракции были обнаружены в носоглотке или сечениях, эквивалентных лёгким. Кроме того, постаэрозольные мРНК-полиплексы были успешно доставлены в эпителиальные клетки лёгких человека A549 и провели обнаруживаемую экспрессию GFP. Этот протокол демонстрирует неразрушительный метод доставки интраназальной мРНК с использованием аэрозолизации расщепления Рэлея. Он эффективно сохраняет физико-химические свойства и биологические функции невирусных мРНК-векторов, распыляя водную фазу в капли подходящих размеров для целенаправленного назального отложения. Этот протокол раскрывает новый подход к эффективной аэрозолизации мРНК и оценке их регионального отложения в носовой полости.
Введение
Доставка вакцин в слизистую слизисую носа (входной портал для многих респираторных патогенов) может вызвать сильный локальный иммунитет и блокировать инфекции в их источнике. Успех интраназальных вакцин против гриппа и недавнее одобрение интраназальных вакцин против COVID-19 подчёркивают эффективность носового пути для вызова как слизистых, так и системных иммунныхответов 1. Интраназальная доставка мРНК-вакцин вызывает большой интерес как стратегия профилактики респираторных вирусных инфекций. Однако одной из главных технических задач является преобразование хрупких мРНК-полиплексов в ингаляемый аэрозоль без ущ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные линии HEK293T и A549 в полной среде, состоящие из модифицированной среды Eagle Medium (DMEM) от Dulbecco, дополненной 10% плодовой сывороткой крупного рогатого скота (FBS) и 2% пенициллин-стрептомицином перед трансфекцией ПЭИ-мРНК. Проходите обе клеточные линии примерно каждые 48 часов при достижении слияния. Семенные клетки с плотностью 40 000 клеток на см² и культивирование в течение ~48 час. Удалите культурную среду и промывайте клетки фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) непосредственно перед трансфекцией для удаления остаточной сыворотки и стандартизации условий трансфекции. Автоклав всех колб к....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Как рукопись, ориентированная на методы, подробные результаты не являются основной целью; однако представлены репрезентативные результаты, иллюстрирующие ожидаемые результаты каждой части протокола. Приведённые ниже рисунки показывают примеры данных (например, графики или изображения), подтверждающие валидность метода, но новых количественных анализов, кроме демонстрации, не включены.
Размер капель и схема осадки:
Атомайзер разбивания Рэлея.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом протоколе перед аэрозолем мРНК ветвяется с PEI для улучшения клеточного поглощения. Это служит заменой для доставки ЛНП-мРНК во время валидации in vitro 10,15. PEI-мРНК сохраняет большинство функций формул LNP, включая важные биологические и функциональныехарактеристики 10. Положительно заряженные аминные группы в PEI связываются с отрицательно заряженным мРНК посредством электростатических.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы выразили признательность финансовой поддержке King's Undergraduate Research Fellowship (KURF) и Фонда студенческих возможностей, предоставленных King's College London.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Центрифугные трубки объемом 50 мл | Компания Сигма-Олдрич Лимитед | CLS430829-500EA | |
| 50– 1000 & mu; Наконечники L пипетки | Компания Сигма-Олдрич Лимитед | Z740031-1000EA | |
| Линия ячеек A549 | Коллекция американской типографической культуры | ATCC CRM-CCL-185 | |
| Измеритель расхода воздуха | Н/Д | Н/Д | Может использоваться универсальный расходомер воздуха. |
| Модель идеализированного носового входа Альберты (AINI) | TSI Incorporated (через Copley Scientific, Великобритания) | 0001-01-8540 | |
| Лента индикаторов автоклава | Компания Сигма-Олдрич Лимитед | Z744090 | |
| DAPI | Компания Сигма-Олдрич Лимитед | D1306 | |
| DMEM (Модифицированный Eagle Medium от Dulbecco) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11966025 | |
| Этиловый спирт, чистый | Компания Сигма-Олдрич Лимитед | 32221-М | Приобретено через Merck |
| Сыворотка для плода быка (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | A5256701 | |
| Формальдегид | Компания Сигма-Олдрич Лимитед | F8775 | |
| HEK293T Клеточная линия | Коллекция американской типографической культуры | ATCC CRL-3216 | |
| Шкаф биобезопасности Heraeus HERAsafe HS 12 | Гереус | Н/Д | |
| Импактор следующего поколения | MSP — это подразделение TSI | 0170-01-1000 | Этот продукт также представлен в каталоге Copley, номер детали 5201. |
| Монохромная микроскопическая камера Nikon DS-Qi2 | Nikon | Н/Д | |
| Клеточная культура Nunc Multidishs | Термо Фишер Сайентифик | 142475 | |
| Колбы, обработанные культурой клеток Nunc EasYFlask | Термо Фишер Сайентифик | 156340 | |
| Парафильм | Компания Сигма-Олдрич Лимитед | P7793-1EA | |
| Пенициллин-стрептомицин (10 000 U/мл) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140148 | |
| Фосфатно-буферные физиологические таблетки (PBS) | Термо Фишер Сайентифик | 18912014 | |
| Полиэтилениминовый гидрохлорид | Компания Сигма-Олдрич Лимитед | 764965-1G | Приобретено через SLS |
| Назальный атомайзер Rayleigh Jet | Resyca BV Энсхеде | Мягкий назальный спрей | |
| Вода, свободная от РНК | Термо Фишер Сайентифик | J60610. EQC | |
| Размерная кюветка | Malvern Panalytical | ZEN0040 | |
| Складчатая капиллярная клетка | Malvern Panalytical | DTS1070 | |
| Zetasizer Pro | Malvern Panalytical | Zetasizer Pro | |
| Программное обеспечение Zetasizer Ultra-Pro ZS Xplorer | Malvern Panalytical | Н/Д |
Ссылки
- Akula, V. R., et al. Effect of heterologous intranasal incovacc(r) vaccination as a booster to two-dose intramuscular COVID-19 vaccination series: a randomized phase 3 clinical trial. Commun Med (Lond). 5 (1), 133(2025).
- Van Hoeve, W., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
