Профилирование мутаций ДНК рецепторов эпидермальных факторов роста в циркулирующих редких клетках с помощью системы изоляции клеток и цифровой ПЦР с каплями

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол, иллюстрирующий выделение редких раковых клеток из искусственно сформированного образца, содержащего цельную кровь и поднятого в клетках рака лёгких. Протокол использует полуавтоматизированную платформу изоляции клеток без меток. Обогащённые клетки затем анализируются на наличие мутаций рецепторов эпидермальных факторов роста с помощью капельной цифровой ПЦР.

Аннотация

Мутации, обнаруженные в гене эпидермального фактора роста (EGFR), имеют решающее значение для определения наиболее эффективного лечения пациентов с раком лёгких. Рутинное тестирование на мутации EGFR может быть проведено в виде биопсий опухоли или анализа ctDNA из плазмы у пациентов с раком лёгких. Хотя анализ крови у пациентов с раком лёгких проводится рутинно для выявления наличия или рецидива рака легких с помощью обнаружения ctDNA или CTC, обычно это не включает последующий молекулярный анализ захватываемых клеток. Обнаружение отдельных мутаций в гене EGFR, присутствующих в редких циркулирующих опухолевых клетках (CTC), может дать дополнительное понимание потенциальной эффективности таргетной терапии и, помимо этого, прогноза пациентов, особенно при немелкоклеточном раке лёгких (НМРЛ). К сожалению, редкость таких циркулирующих опухолевых клеток и отсутствие упрощённых процедур для анализа их геномной информации представляют собой серьёзную проблему для обнаружения.

Цель этого протокола — продемонстрировать реалистичный потенциал захвата CTC из цельной крови и оценки их молекулярного содержания с помощью ddPCR. Для захвата циркулирующих опухолевых клеток использовалась полуавтоматизированная платформа изоляции клеток на основе размера, которые впоследствии были извлечены для дальнейшего молекулярного анализа. Для определения наличия специфических мутаций EGFR в геномной ДНК захваченных клеток была проведена ddPCR с использованием анализов на EGFR pT790M и EGFR pL858R.

Две отдельные линии рака лёгких (A549 и H1975) были активно обогащены цельной кровью, а точная количественная оценка мутаций внутри клеточных линий H1975 была проведена с помощью ddPCR.

Введение

С продолжающимися трансляционными исследованиями ценности жидких биопсий, а также недавними публикациями, специально иллюстрирующими клиническую ценность мониторинга ctДНК в терапии^{первого} выбора, жидкие биопсии становятся всё более популярными. Жидкие биопсии предоставляют альтернативный, менее инвазивный метод мониторинга и прогноза рака по сравнению с традиционными методами биопсии ткани. Обширные исследования были сосредоточены на фрагментированной ДНК, обнаруженной в крови (ДНК без клеток, cfDNA), а в частности на подкомпартменте, производящемся из опухоли, известном как циркулирующая опухолевая ДНК (ctDNA). ctДНК была широко изучена за последние два десятилетия и показала, что содержит мутации генов, специфичных для опухоли, такие как SNV и структурные варианты, а также маркеры метилирования и характерный фрагментный рисунок по сравнению с неопухолевой cfDNA. Эти специфические характеристики ctДНК теперь используются для мониторинга молекулярного состояния пациентов с раком в области раннего выявления, ответа на терапию, минимального остаточного заболевания (MRD) и устойчивости к терапии. Аналогично, циркулирующие опухолевые клетки (КТК), отделённые от первичного опухолевого центра в кровеносные сосуды, недавно эволюционировали как перспективные биомаркеры, наличие и количество которых в крови тесно связаны с прогрессированием заболевания и потенциалом рецидивов. В то время как самые ранние исследования КТК в основном опирались на экспрессию белковых маркеров и^{перечисление 2}, был достигнут значимый прогресс в изучении КТК на молекулярном уровне, включая обнаружение геномных мутаций в эстрогеновых рецепторах 1 (ESR1) для рака молочной железы и гена эпидермального фактора роста (EGFR) для различных видов рака.

Мутации EGFR критически важны как для определения патогенеза и прогноза, так и для определения наиболее эффективного лечения пациентов с раком^{лёгких 3}. Рутинное тестирование на мутации EGFR может осуществляться в виде биопсии солидной опухоли при диагностике или прогрессировании, а в более позднее время — отбора проб ctDNA из плазмы у пациентов с рецидивом/рефрактерным раком^{лёгких 4}. Однако, в отличие от подходов на основе ctDNA, анализ геномного материала, полученного из CTC, позволяет напрямую оценить целостные опухолевые клетки и их мутационные профили. Вместе с исследованиями ctDNA MRD обнаружение мутаций в гене EGFR редких КТК может дать дополнительное понимание потенциальной эффективности схем лечения, а также прогноза пациентов, особенно при немелкоклеточном раке лёгких (НМРЛ). Редкость CTC и отсутствие упрощённых протоколов с использованием удобных инструментов для клиник являются серьёзным препятствием для более широкого внедрения. Это ограничение подчёркивает необходимость стандартизированного и доступного рабочего процесса, который обеспечивает как эффективную изоляцию CTC, так и последующий молекулярный анализ. Поэтому цель данного исследования — представить воспроизводимый рабочий процесс для обогащения циркулирующих опухолевых клеток и последующего обнаружения мутаций EGFR с использованием комбинированной изоляции клеток и цифровой ПЦР.

Система изоляции клеток Genesis с микрофлюидными капсулами для захвата клеток может захватывать CTC в полуавтоматическом процессе с высокой жизнеспособностью и эффективностью захвата, исходя из их большего размера и сниженной деформируемости по сравнению с первичной популяцией белых и эритроцитов ^5,6. Захваченные КТК затем можно извлечь из микрофлюидных клеток с помощью обратного потока от затвора для дальнейшего геномного анализа. Для определения наличия специфических мутаций EGFR в геномной ДНК захваченных клеток была проведена ddPCR на геномной ДНК, полученной из CTC, с использованием анализов на EGFR T790M и L858R.

Этот протокол, использующий модельный образец CTC и коммерчески доступные ddPCR-анализы, предназначен для примера входной точки для целенаправленного обнаружения мутационных мутаций, связанных с раком, в CTC. Этот протокол предоставляет практический подход к выявлению мутаций, связанных с раком, в циркулирующих опухолевых клетках, и может способствовать дальнейшим исследованиям применения жидкой биопсии.

Протокол

Этическое заявление:

Образцы крови были взяты из авторизованных источников для исследовательского использования, а письменное информированное согласие всех доноров было получено перед забором образцов. Все экспериментальные протоколы, связанные с образцами человеческой крови, были рассмотрены и утверждены Институциональным обзорным советом поставщика крови Discovery Life Sciences (Алабама, США). Все процедуры, связанные с человеческими образцами крови, проводились в соответствии с этическими стандартами институционального исследовательского комитета и Хельсинкской декларацией.

1. Обогащение раковых клеток с помощью полуавтоматической системы изоляции клеток

Примечание: В этом разделе описывается обогащение циркулирующих опухолевых клеток (CTC) с помощью полуавтоматической платформы изоляции клеток, за которым следует обнаружение мутаций EGFR с помощью цифровой ПЦР с помощью капельной цифровой ПЦР. Модельный образец CTC используется для демонстрации осуществимости, и рекомендуется валидация анализа перед клиническим применением. Использовались две немелкоклеточные линии рака лёгких (НМРЛ): NCI-H1975 (мутации EGFR L858R/T790M) и A549 (EGFR дикого типа), которые служили отрицательным контролем для обнаружения мутаций.

1. Образец крови
   1. Убедитесь, что перед забором крови получено информированное согласие доноров и пациентов. Получить одобрение Институционального наблюдательного совета (IRB), где это необходимо, для исследований, связанных с человеческими образцами, включая кровь.
   2. Для теста на осуществимость возьмите образец крови у авторизованного стороннего поставщика только для исследований.
   3. Соберите периферическую кровь в пробирках с этилендиаминтетрауксусной кислотой (EDTA) и обработайте образец по протоколу Genesis Enrichment в течение 48 часов.
      Примечание. Для дальнейшего анализа и протокола обогащения Genesis рекомендуются EDTA-трубки. Streck и EDTA-трубка могут использоваться для иммунокрашивки на слайдах с протоколами Genesis Enumeration (прямой или косвенной).
   4. Храните собранные образцы крови в пробирках ЭДТА при температуре 2–8 °C до применения. Для выделения клеток Genesis предварительное лечение не требуется, и для протокола обогащения можно использовать цельную кровь до 10 мл.
2. Модельная подготовка образцов CTC/клинических образцов
   1. Приготовьте раствор клеточного запаса в концентрации 100–1 000 клеток в соответствующей среде 10 мкл или в буфере с фосфатным буфером (PBS). Пропустите этот шаг, если используются клинические образцы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые в данном исследовании концентрации резкого давления выше обычно наблюдаемых клинических уровней CTC и предназначены исключительно для демонстрации методов.
   2. Добавьте 10 мкл клеточного раствора в до 10 мл цельной крови от здорового донора для подготовки модельного образца CTC. Для клинических образцов не включайте раковые клетки в целостные образцы крови пациентов.
   3. Смешайте образец крови с равным объёмом PBS (1 раз) и аккуратно перемешивать на кровяном рокере при комнатной температуре до использования. Если хранение превышает один час, храните при 4 °C.
3. Обогащение CTC
   1. Включите систему изоляции ячеек Genesis и дождитесь инициализации системы. Это может занять до 5 минут.
   2. Поставьте банку с отходами у основания отсеков станции и прикрепите трубку для отходов к контейнеру.
   3. Вдавите трубку в защитный клапан, пока не почувствуете щелчок, и подключите трубку Genesis System к выходу банки для отходов.
   4. Проведите самотестирование, нажав «старт» на главном экране и коснувшись «Самотестирования» на экране.
   5. Когда самотестирование завершено, выберите «2.0 Kit Enrichment » из опций протокола.
   6. Следуйте инструкциям на экране, заполните необходимые поля для ввода данных и завершите процедуру Priming and Assembly (Грунтование и сборка). Успешное праймирование с использованием 70% этанола и 1x PBS обеспечивает наилучшую производительность захвата клеток и восстановление при извлечении ДНК. Грунтовка занимает около 20 минут.
   7. Убедитесь, что выбрана правильная программа обогащения (2.0 Kit Enrichment) и что все соединения труб и расположение затворов надёжно закреплены перед началом работы. Избегайте появления пузырьков воздуха при загрузке пробы, так как это может повлиять на стабильность потока и эффективность захвата.
   8. Аккуратно введите модельный образец, подготовленный по шагу 1.2.3 (Модельный образец CTC/Клиническая подготовка), в воронку и продолжите процедуру обогащения, нажав «Продолжить» на экране системы.
   9. После завершения захвата CTC полуавтоматическая система изоляции ячеек предложит пользователю снять банку для отходов и подключить резервуар для запуска.
   10. Отсоедините трубку системы Genesis от банки для отходов и пипеты 4 мл буфера разведения в резервуар для грунта.
   11. Подключите адаптер обратного потока к резервуару для запуска и снова подключите его к трубке системы Genesis. Нажмите «Возобновить» на экране, чтобы продолжить протокол обогащения. Это высвобождает захваченные клетки из микрофлюидного затвора в воронку впуска, применяя обратный поток.
   12. Собирайте восстановленные клетки, вытягивая из впускной воронки в трубку Эппендорфа объёмом 5,0 мл. Убедитесь, что вы собираете все водные образцы из впускной воронки, которая часто превышает 4 мл.
   13. Центрифугуйте восстановленный образец при 600 г в течение 5 минут, чтобы пеллетировать захваченные клетки перед лизисом.
   14. Аккуратно удалите супернатант и переходите к протоколу экстракции ДНК (раздел 1.4).
4. Экстракция ДНК
   Внимание: ДНКзол BD вреден при контакте с кожей или при проглатывании. Избегайте контакта с кожей и глазами. Используйте только в химической вытяжке и не вдыхайте туман, пар или спреи. В случае контакта с кожей немедленно промывайте воду.
   1. Добавьте 1 мл ДНКзола BD непосредственно в пробирку с шага 1.3.14.
   2. Перенесите весь объём образца в новую микроцентрифугу LoBind объемом 1,5 мл Eppendorf DNA и энергично встряхните.
   3. Инкубировать трубку при комнатной температуре в течение 5 минут. Интенсивно закрутите трубку и инкубуйте при комнатной температуре минимум 4 минуты.
   4. Обеспечьте полное смешивание во время лизиса и этапов осадков для максимального восстановления ДНК. Опциональное лечение РНазой может быть включено, если существует угроза загрязнения РНК.
   5. Добавьте 400 мкл изопропанола непосредственно в смесь образцов лизата ДНКзола BD-клеток.
   6. Центрифугуйте пробирку при 10 000 г в течение 6 минут, чтобы получить осаждение ДНК.
   7. После центрифугирования удалите супернатант и аккуратно добавьте 0,5 мл ДНКзола BD в гранулированную ДНК.
   8. Закрутите трубку, пока ДНК-гранула не будет полностью рассеяна.
   9. Центрифугуйте смесь при 10 000 г в течение 5 минут.
   10. Удалите супернатант и промыйте ДНК-гранулу пипеткой 1 мл этанола 75%.
   11. Повторяйте шаги 9–10, всего получается два промывания.
   12. Удалите остатки этанола на дне пробирки с помощью микропипетки.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что гранулы не высохнут полностью.
   13. Добавьте 20 мкл деионизированной (DI) воды без ДНКаз/РНазы для растворения ДНК из образцов CTC.
   14. Количественно определите двухцепочечную ДНК (dsDNA) в образце с помощью наборов/платформ для количественного анализа dsDNA, таких как Qubit 1x dsDNA High Sensitive Assay Kit или Bioanalyzer High Sensitive DNA Analysis.
   15. Храните экстракционные образцы ДНК при 4 °C или -20 °C для предотвращения разрушения.
       Точка паузы: Извлечённые образцы ДНК могут храниться при -20 °C для краткосрочного хранения или при -80 °C для длительного хранения перед переходом к дальнейшему анализу.

2. Анализ мутаций EGFR с использованием ddPCR

Цифровая ПЦР — подходящий метод для обнаружения редких мутаций с высокой чувствительностью и точностью. Анализы обнаружения мутаций ddPCR, предлагаемые в одной пробирке, обычно включают зонд, маркированный FAM, направленный на мутантный аллель, и второй зонд, маркированный HEX, направленный на аллель дикого типа.

1. Настройка реакции и генерация капель
   1. Размораживание ddPCR Supermix, ddPCR Mutation Detection Tests на льду.
   2. Закрутите каждую трубку, чтобы обеспечить однородность содержимого, так как при хранении при -20 °C может образоваться градиент концентрации.
   3. Кратко центрифугуйте содержимое осадка на дне трубки и поставьте её на лёд.
   4. Подготовьте экстракционные образцы ДНК в нужной концентрации перед приготовлением реакционной смеси согласно рецепту в таблице 1.
   5. Сделайте готовую смесь с суперсмесью, анализами и рестрикционными ферментами, а также водой для всех необходимых образцов для тестирования и добавьте образец ДНК отдельно как последний компонент реакции. Убедитесь, что конечная концентрация образцов ДНК составляет 50 fg–100 ng.
      Примечание: рекомендуется фрагментация ДНК путём рестрикционного расщепления перед генерацией капель для повышения точности, снижения вязкости и улучшения доступности шаблонов. Рекомендуется прямое переваривание с использованием 2–5 U рестрикционного фермента во время установки ddPCR. Для анализов точечных мутаций EGFR (T790M/L858R) рекомендуется MseI; Перед настройкой обратитесь к техническим характеристикам анализов для совместимых ферментов. Технические листы доступны для скачивания отдельных анализов через портал цифровых анализов Bio-Rad (Bio-Rad Droplet Digital PCR Assays | Главная)
   6. Подготовьте отрицательный контроль хотя бы для одной скважины, содержащей только шаблон дикого типа при концентрации, сопоставимой с концентрацией неизвестных образцов.
   7. Закрутите реакционные трубки для тщательного смешивания и кратковременно центрифугайте, чтобы осадить все образцы на дно каждой реакционной трубки. Дайте реакционным трубкам уравновеситься при комнатной температуре в течение 2 минут.
   8. Загрузите 20 мкл каждой реакционной смеси в пробную скважину микрофлюидного картриджа (DG8), затем 75 мкл масла для генерации капель для зондов в нефтяные скважины.
   9. Закройте картридж прокладкой и поместите его в генератор капель QX200.
   10. Нажмите кнопку сверху генератора капель, чтобы закрыть крышку. Когда крышка закрыта, генерация капель начинается автоматически. Эта процедура объединяет образцы и масло в микроканалах микрофлюидического картриджа, создавая эмульсию размером ~20 000 нанолитровых капель для каждого образца.
2. Усиление ПЦР (условия термического циклирования)
   1. Запрограммируйте условия термического цикла на термическом циклере, как рекомендовано в таблице 2
   2. Когда генерация капель завершена, все индикаторы на приборе загораются постоянно зелёным. Откройте инструмент, снова нажав кнопку на генераторе капель, и снимите держатель и картридж.
   3. Удалите одноразовую прокладку и аспирируйте 45 мкл капель из картриджа, стараясь сделать небольшой угол наконечника пипетки, чтобы избежать разрыва капель.
   4. Впустите капли в пластины ddPCR 96-Well и запечатайте пластину с помощью PCR Plate Sealer с помощью PCR Plate Sealer.
   5. После герметизации пластины с 96 лунками, содержащей капли, аккуратно перенесите 96-ядровую пластину в термоциклер, подготовленный на шаге 2.2.1, и начните термический цикл.
3. Считывание капель и анализ данных
   1. Запустите инструмент ddPCR Droplet Reader (QX200 Droplet Reader или QX600 Droplet Reader) и подключённый компьютер, на который установлено и настроено программное обеспечение QX Manager.
   2. После завершения этапа термического цикла переместите герметичную 96-ядровую пластину к прибору Droplet Reader.
   3. Откройте QX Manager Software для настройки новой компоновки пластины на основе экспериментального дизайна. Нажмите вкладку «Добавить тарелку », и программа включит кнопку «Настроить пластину». Нажмите на «Configure Plate », чтобы назначить образцы для пластины.
   4. Заполните детали пластины и информации о скважине, выберите скважины, обозначите состояние образца, тип эксперимента, имя цели, тип мишени и ссылку: ch1 для FAM и ch2 для HEX-цвета.
   5. Нажмите «Применить», чтобы загрузить скважину, а после завершения выберите «OK».
   6. Когда раскладка пластин для всех образцов готова, выберите «Запустить», чтобы начать процесс чтения капель.
   7. После сбора данных выберите образцы в селекторе ямы в разделе «Анализ» и установите соответствующий порог для анализа обнаружения мутаций ddPCR, чтобы отличить мутантные и дикие сигналы.
   8. Для анализов дуплексных мутаций, подобных используемым в этом протоколе, пороги могут устанавливаться автоматически с помощью стандартных настроек программного обеспечения QX Manager (см. fig in results).
   9. Альтернативно, пороги могут устанавливаться вручную с помощью методов прицела или лассо, что гарантирует, что пороги или границы лассо разделяют положительные и отрицательные кластеры и позиционируются в зависимости от расположения кластеров, определённых как положительными, так и отрицательными контролями, включёнными в каждый пробег.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пороги должны устанавливаться последовательно по выборкам в партии с использованием положительных и отрицательных контролей, чтобы обеспечить воспроизводимые вызовы мутаций.
   10. Сообщаемая концентрация — это копии на мкл финальной 1x ddPCR-реакции.

Результаты

Система изоляции клеток Genesis с микрофлюидными слайдами для захвата клеток выделила в среднем 84% шипованных раковых клеток в образцах крови при концентрации 25–250 клеток·^мЛ-1 (рисунок 3A). Высокая эффективность захвата демонстрирует эффективность этапа обогащения для выделения редких циркулирующих опухолевых клеток из цельных образцов крови. Опциональное иммунное окрашивание клеток, захваченных в микрофлюидных слайдах с использованием протокола системного перечисления, показало редкую идентификацию клеток с использованием двух положительных антител против цитокератина, DAPI для идентификации ядреных клеток и одного отрицательного антитела к CD45, которое экспрессируется на большинстве лейкоцитов, но обычно не экспрессируется на КТК (рисунок 3B). Такой паттерн окрашивания подтверждает успешную идентификацию циркулирующих опухолевых клеток, исключая фоновые лейкоциты.

ddPCR-тесты на обнаружение мутаций позволили выявлять и профилировать мутации EGFR в обогащённых раковых клетках. Это исследование продемонстрировало обнаружение мутаций gDNA в клетках, изначально обогащённых платформой Genesis, с помощью ddPCR и анализов обнаружения мутаций. ddPCR-графики (рисунок 4) линий раковых клеток A549 (дикий тип EGFR) и H1975 (L858R/T790M) для двух протестированных мутаций EGFR показали, что ddPCR может чувствительно обнаруживать мутации в клеточной линии H1975 после увеличения в цельную кровь и последующего обогащения через платформу Genesis. Положительные сигналы мутации были обнаружены в клетках H1975, тогда как в клетках A549 не обнаружены сигналы мутации, что подтверждает специфичность анализа. Образцы с контрольной клеточной линией A549 не показали наличие каплей мутации, что подтверждает, что обнаружение мутаций в L858R и T790M связано именно с линией H1975. Эта демонстрация изоляции CTC на платформе Genesis с последующим молекулярным анализом с использованием ddPCR может стать мощным молекулярным диагностическим инструментом для жидкостных биопсий и доклинических исследований с использованием клинических образцов для мониторинга прогрессирования заболевания и персонализированного лечения. В целом, эти результаты показывают, что совместный рабочий процесс обогащения и ddPCR позволяет надёжно обнаруживать и количественно оценивать мутации EGFR в циркулирующих опухолевых клетках.

Рисунок 1: Рабочий процесс жидкой биопсии для профилирования мутаций ДНК EGFR при раке лёгких. (A) Иллюстрация гетерогенности опухолей с различными профилями мутаций EGFR, выявленными с помощью традиционной тканевой биопсии и циркулирующих опухолевых клеток (CTC) из жидкой биопсии. (B) Схематический рабочий процесс для профилирования мутаций ДНК EGFR в циркулирующих опухолевых клетках с использованием жидкой биопсии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Демонстрация профилирования мутаций ДНК EGFR с использованием искусственных образцов. (A) Подготовка модельного образца CTC путём скачки клеточных линий рака лёгких с определённым статусом мутации EGFR в цельную кровь здорового донора. (B) Рабочий процесс, иллюстрирующий обнаружение мутаций ДНК EGFR в циркулирующих опухолевых клетках с использованием коммерчески доступных платформ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Изоляция и идентификация циркулирующих опухолевых клеток без меток. (A) Эффективность захвата линий рака лёгких (A549 и H1975), увеличенных в цельные образцы крови здоровых доноров с использованием полуавтоматической платформы для выделения редких клеток. (B) Иммунная окрашивание захваченных клеток с цитокератин-положительными опухолями. Шкала = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. Профилирование мутаций EGFR с помощью цифровой ПЦР на основе капель . Двумерные амплитудные диаграммы, показывающие обнаружение мутаций EGFR в обогащённых раковых клетках после лизиса клетки и экстракции ДНК. Клетки A549 (дикий тип) демонстрируют отсутствие мутационно-специфических сигналов, тогда как клетки H1975 демонстрируют положительные сигналы на мутации EGFR L858R и T790M. Анализ позволяет проводить чувствительное обнаружение и количественную оценку популяций мутантов и диких типов ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Компонент	Объём на реакцию (мкл)	Итоговая концентрация
2x ddPCR Supermix для зондов (без dUTP)	10	1 раз
Капсули/зонды 20x для мишени (FAM) и дикого (HEX) типа	1	1 раз
Рестрикционный фермент, разбавленный (Msel)	1	2-5 U/реакция
Целевой образец и/или вода без ДНКазы (NTA)	Переменная	Переменная
Общий объём	20	-

Таблица 1: Настройка реакции для обнаружения цифровых ПЦР-мутаций на основе капель.Состав и конечные концентрации реагентов, используемых для обнаружения редких мутаций EGFR в образцах ДНК, полученных из раковых клеток.

Шаг термического цикла*	Температура	Время	Скорость роста	Количество циклов
	(ºC)		(ºC/сек)
Активация ферментов	95	10 мин	2	1
Денатурация	94	30 секунд	2	40
Отжиг/удлинение	55	1 минута	2	40
Деактивация ферментов	98	10 мин	2	1
Охлаждение	4	30 мин	2	1
Удержание (по желанию)	4	∞ (бесконечный)	1	1
Используйте нагретую крышку, установленную на 105ºC, и установите объём образца на 40 мкл для термоциклера C1000 Touch с 96-глубоким модулем реакции скважины.

Таблица 2: Условия термического циклирования для цифрового ПЦР-усиления. Параметры термического цикла, используемые для усиления мишеней мутаций EGFR с использованием термического циклера с 96-лукционным реакционным модулем.

Обсуждение

Наличие циркулирующих опухолевых клеток в крови пациентов с солидными опухолями является предметом исследований более 60^{лет и} признано первичной жидкостной биопсией ещё до их первого включения в коллективный термин в 2010^году. Однако CTC встречаются редко, и их трудно селективно выделить из цельной^{крови 9}. Однако существует множество методов захвата и обогащения CTC, как показано в следующих^{обзорах 10,11}, охватывающих как физические/микрофлюидные методы, так и методы выбора маркеров поверхности клеток. Многие из этих методов требуют много времени, трудоёмки и часто включают несколько этапов и систем для достижения необходимой избирательности.

Захват КТК из цельной крови в этом протоколе зависит от их размера (> 8 мкм) и отсутствия деформаций на фоне фенотипически нормальных эритроцитов и лейкоцитов, проходящих через микрофлюидические поры внутри стекло для захвата микрофлюидных клеток. Поэтому правильная загрузка образцов, правильное грунтование затвора и предотвращение засоров являются критически важными этапами для поддержания эффективности захвата и извлечения образцов.

Для успешного работы ключевым фактором является управление образцами крови; обеспечение использования свежей крови для обработки образцов и поддержание правильных условий транспортировки и хранения для предотвращения гемолиза. Деградация эритроцитов или белых кровяных телцов влияет на качество захвата CTC и чувствительность к обнаружению любых редких геномных вариантов соответственно. Если наблюдается гемолиз, свертываемость или видимое разрушение образца, образец не следует обрабатывать, так как эти условия могут снизить восстановление CTC и чувствительность к обнаружению мутаций.

Поскольку КТК могут находиться при уровнях ниже 1 КТК на 10 миллионов лейкоцитов в цельной крови, крайне важно захватывать максимально допустимый объём для обогащения. Микрофлюидные препараты для захвата клеток могут вмещать 10 мл крови в соответствии со стандартными трубками для захвата крови, такими как Streck и EDTA, которые обычно содержат ~7,5–10 мл крови. Уменьшение объема собранной крови напрямую повлияет на чувствительность к захвату CTC и последующее обнаружение геномных вариантов. Получение объёмов, выходящих за рамки этой рутины, от пациентов, проходящих лечение, может быть сложно как с клинической, так и с этической точки зрения. Помимо увеличения объёма более 10 мл или использования диагностических образцов лейкофереза для увеличения популяций лейкоцитов/^{CTC 12}, увеличение чувствительности при увеличении объёмов в настоящее время выходит за рамки компетенций платформы Genesis.

Протокол проводился в соответствии со стандартным SOP, но с осторожностью для обеспечения свежего сбора крови, комплексного смешивания EDTA с кровью при сборе и аккуратного хранения собранной крови перед использованием, что демонстрирует потенциал применения этого протокола в клинических условиях, где ценятся стандартные процедуры. Однако, поскольку этот протокол был продемонстрирован на искусственных образцах, перед рутинным клиническим применением требуется валидация с образцами клинических пациентов.

Чувствительность к обнаружению мутаций внутри популяции CTC зависит как от наличия CTC в стандартной образце цельной крови, так и от последующего обнаружения соматических мутаций внутри этой популяции, что зависит от частоты мутации в субпопуляции CTC. Эти два смешивающих фактора в конечном итоге ограничивают общую чувствительность к обнаружению мутаций в популяции захваченной КТК; что оказывает большее влияние на ранние образцы по сравнению с образцами на поздних стадиях, у которых, вероятно, более высокий уровень КТК и более высокий уровень КТК с мутациями.

Современные исследования жидкой биопсии на основе крови сильно склонны к тому, что циркулирующая опухолевая ДНК, присутствующая в плазме, является признаком наличия опухоли. Обычно обнаружение ctDNA основано на наличии опухольоспецифических геномных маркеров, таких как SNV, структурные варианты, MSI-H, TMB и CGP. КТК как менее используемый, но при этом не менее эффективный биомаркер в жидкостной биопсии известны тем, что выделяются в кровоток из-за растущих и потенциально метастазирующих^{опухолей 8}. Анализ КТК в первую очередь сосредоточен на маркерах поверхности клеток, используемых для их захвата или для послезахватной валидации с использованием проверенных или специализированных панелей антител, таких как пан-цитокератин, виментин, PD-L1, EpCAM и др. В отличие от этого, молекулярный анализ CTC ограничен в использовании из-за сложностей селективного обогащения и захвата CTC из цельной крови с последующим точным анализом субпопуляции CTC. Текущий метод использует стандартизированный рабочий процесс, включающий устоявшиеся протоколы для захвата CTC, а затем молекулярный анализ с использованием ddPCR с готовыми анализами известных патологически значимых геномных мутаций в искусственных образцах цельной крови. Этот подход важен, поскольку позволяет профилировать мутации непосредственно из обогащённых КТК, дополняя жидкостные биопсии на основе плазмы ctDNA.

Используя современный подход, пойманные редкие КТК можно исследовать как на наличие в цельной крови, так и на наличие патологически значимых геномных маркеров в популяции КТК. Исследования показали ценность оценки как профиля ctДНК пациентов с раком, так и резервуара CTC, циркулирующего параллельно^{ctDNA 13}, при этом оценка обоих источников мутаций расширяет общий молекулярный ландшафт отдельных пациентов. Это имеет потенциал для развития парадигм патологоанатомического тестирования в рамках трансляционных исследований изначально, но в конечном итоге — в клинической среде. Новая парадигма будет включать как присутствие КТК как признак наличия/прогрессирования рака, так и патологические мутации, присутствующие в захваченных клетках СТК, что может указывать на клональное расширение или терапевтическую^{устойчивость 14}. Следствие этого заключается в том, что развитие метастазирования и клонального расширения, а также последующая лекарственная резистентность, можно одновременно контролировать как на уровне ctDNA, так и CTC, что напрямую влияет на выбор терапии на поздних стадиях рака.

Будущие применения могут включать адаптацию этого рабочего процесса к дополнительным мутациям, связанным с раком, и тестирование его эффективности на продольных клинических образцах.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Genesis Cell Isolation System	Bio-Rad Laboratories	12019822	Инструмент (называемый "Полуавтоматическая система изоляции клеток")
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad Laboratories	1864002	Инструмент
QX200 Droplet Reader или QX600 Droplet Reader	Bio-Rad Laboratories	1864003 или 12013328	Инструмент (называемый "Инструмент Droplet Reader")
PX1 PCR Plate Sealer	Bio-Rad Laboratories	1814000	Инструмент
C1000 Touch Thermal Cycler с модулем реакции 96–Deep Well	Bio-Rad Laboratories	1851197	Инструмент
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific Inc.	Q33226	Инструмент
Celselect Slides			Расходный материал (называемый "Микрофлюидные слайды для захвата клеток")
Celselect Slides Enrichment Kit 2.0	Bio-Rad Laboratories	17009455	Расходный материал
DNAzol BD	Molecular Research Center, Inc.	DN129	Реагент
MseI restriction enzyme	New England Biolabs	R0525S	Реагент
ddPCR Mutation Detection Assay: EGFR T790M	Bio-Rad Laboratories	Assay ID dHsaMDV2010019	Анализ
ddPCR Mutation Detection Assay: EGFR L858R	Bio-Rad Laboratories	Assay ID dHsaMDV2010021	Анализ
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity Assay Kit	Invitrogen	Q33230	Комплект аналитических тестов
DG8 Cartridges for QX200 Droplet Generator	Bio-Rad Laboratories	1864008	Расходный материал
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad Laboratories	1863005	Расходный материал
Automated Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad Laboratories	1864110	Расходный материал (по желанию)
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)	Bio-Rad Laboratories	1863023	Реагент
PCR Plate Heat Seal	Bio-Rad Laboratories	1814040	Проколоть фольгу
DNA LoBind Microcentrifuge Tube, 1.5 ml	Eppendorf	022431021	Расходный материал
ddPCR 96-Well Plates	Bio-Rad Laboratories	12001925	Расходный материал