Method Article

Трёхмерный метод совместной культуры для изучения косвенных взаимодействий между разными типами клеток на восстановленной базальной мембране

DOI:

10.3791/70027

⸱

April 17th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Memorial University of Newfoundland, 2Beatrice Hunter Cancer Research Institute, 3Grupo Multidisciplinar de Oncología Traslacional & University Research Institute for Health Sciences (IUNICS), Health Research Institute of the Balearic Islands (IdISBa) & University of the Balearic Islands, 4Ciber Fisiopatología Obesidad y Nutrición (CB06/03), Instituto Salud Carlos III, 5Department of Biomedical Sciences, Ontario Veterinary College, University of Guelph

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье рассматривается простой метод трёхмерной кокультуры двух типов клеток, разделённых восстановленной базальной мембраной, которая требует мало специализированного оборудования и может быть легко проанализирована различными экспериментальными методами.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Трёхмерная (3D) кокультура — это быстро развивающаяся техника для исследователей, стремящихся точно изучать взаимодействия между клетками с помощью экспериментов in vitro . Ограничения культуры монослойных клеток, включая ограниченные взаимодействия между клеточной и внеклеточной средой, а также нарушенную морфологию клеток, решаются путём моделирования клетки in vivo . Используя каркас для структурной поддержки и включая биологически активные компоненты внеклеточного матрикса, 3D-культуры демонстрируют поведение и морфологию, более соответствующие ткани. Включение нескольких типов клеток в такую 3D-среду позволяет изучать взаимодействия между клетками внутри биомиметической модельной системы. Появился широкий спектр технологий 3D-совместной культуры, каждая из которых имеет свои преимущества и вызовы. Часто эти технологии требуют специализированного оборудования, сложной установки или специфических технических знаний. Также существует несколько стандартизированных методов изучения косвенных взаимодействий между двумя типами клеток, разделёнными восстановленной базальной мембраной. Здесь мы описываем метод 3D-кокультуры, требующий лишь фундаментальных технических навыков и использующий более широко применимые материалы для успешного воспроизведения косвенных взаимодействий между клетками через базальную мембрану. Монослой клеток покрыт слоем внеклеточного матрикса в форме матригеля, а сверху посеяется второй тип клеток. Полученная совместная культура поддерживается в течение пяти дней, после чего клетки анализируются на морфологические изменения с помощью иммунофлуоресценции или извлекаются из совместной культуры для более детального геномного, транскриптомного или протеомного анализа. Этот протокол идеально подходит для изучения влияния коммуникации между клетками на поведение клетки, когда физический контакт запрещён базальной мембраной. По мере того как исследователи продолжают выбирать более релевантные методы культуры клеток in vivo , необходим упрощённый подход, чтобы избежать высоких барьеров для входа.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Культура клеток in vitro — это надёжная, быстрая и широко используемая исследовательская методика. Хотя традиционные методы культивирования клеток мощны, они сильно отличаются от среды in vivo. Пространственно ограниченная природа культуры монослойных клеток приводит к изменениям в экспрессии генов, морфологии ибиохимии 1,2,3. Трёхмерные (3D) методы культурирования устраняют это неравенство, поскольку клетки выращиваются в каркасах, имитирующих внеклеточный матрикс (ECM), присутствующий в органах и тканях. В трёхмерной культуре клетки проявляют морфологию и поведение, более похожие на те, что наблюдаются in vivo 4,5. Однако сама 3D-культура не полностью воспроизводит многочисленные компоненты микросреды in vivo, поскольку в ней отсутствует вклад других типовклеток 6.

Прямое (контакт между клетками) и косвенное взаимодействие между клетками играют важную роль в поведении клеток invivo 7,8. Для повторения этих взаимодействий необходимы 3D-модели совместной культуры, где несколько типов клеток культивируются вместе в 3D-среде. С помощью этих методов можно создать in vivo-подобную среду роста, что повышает биологическую значимость результатов 9,10. Однако чем более специфична среда, необходимая для конкретного эксперимента, тем сложнее становится методология. Отсутствует стандартизированная модельная система, которая могла бы использоваться для изучения взаимодействия между клетками, разделёнными матрицей базальной мембраны. Таким образом, этот протокол был разработан для моделирования взаимодействий между клетками и клетками, происходящих в матриксе базальной мембраны, в надёжной и воспроизводимой форме. Адаптированная из ранее установленной 3D-моделикультуры 11, эта техника использует слой Matrigel, далее называемый гелем ECM, для физического разделения двух разных типов клеток в культуре, позволяя секретируемым факторам проходить. Изначально он был разработан для изучения косвенного влияния адипоцитов на мезенхимальные клетки рака молочной железы, но его легко модифицировать для различных типов клеток. Следует тщательно рассмотреть, подходит ли этот метод для конкретного экспериментального дизайна. Этот метод не допускает прямого взаимодействия между клетками и поэтому должен быть ограничен моделированием in vivo сценариев, включающих косвенную коммуникацию между клетками через матрицу базальной мембраны. Например, эта система не идеально подходит для моделирования взаимодействий между цитотоксичными Т-клетками и опухолями, поскольку они обычно взаимодействуют напрямую. Вместо этого рассмотрим биологические сценарии, когда базальная мембрана естественным образом разделяет два интересующих типа клеток. Например, этот метод можно применить к изучению взаимодействий между опухолевыми клетками и сосудистыми эндотелиальными клетками до интравазации.

Распространённым альтернативным методом 3D-кокультивирования является использование специализированных микрофлюидиков, или «орган-на-чипе (OoC)». Системы OoC мощны и могут быть адаптированы под индивидуальные эксперименты, но требуют значительных затрат времени и ресурсов на проектирование микросхем, выбор материалов, периферийное оборудование, оптимизацию и сбор данных12,13. Кроме того, в настоящее время не существует стандартного материала или метода, который мог бы передавать биологические и физические сигналы матрицы базальной мембраны, не мешая микрофлюидномупотоку 14. Таким образом, применение технологии OoC для изучения взаимодействий между клетками через базальную мембрану создаёт дополнительные сложности. Метод, изложенный в этом протоколе, стремится предложить стандартизированную альтернативу, сохраняющую биологическую значимость и доступность.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол (рисунок 1A) описывает 3D-кокультурную систему, предназначенную для повторения взаимодействий между клетками и клетками в матриксе базальной мембраны. Дальнейший анализ возможен с помощью конфокальной микроскопии (рисунок 1B) или путем извлечения клеток из кокультуры (рисунок 1C). Используя конструкцию типа «сэндвич», при которой слой геля ЭКМ находится между двумя популяциями клеток, протокол не требует специализированного оборудования и может выполняться с базовыми знаниями современных методов культивирования клеток.

1. 3D Подготовка к совместной культуре

ПРИМЕЧАНИЕ: Описанный протокол предназначен как репрезентативное применение метода 3D-кокультуры с использованием адипоцитов 3T3-L1 и клеток рака молочной железы MDA-MB-231. Использование различных типов ячеек потребует оптимизации плотности посева клеток и предварительного тестирования гелевых партий ECM для обеспечения эффективности. Этот протокол предусматривает использование контроля без адипоцитов и кондиционированного контроля среды. В зависимости от цели эксперимента могут потребоваться дополнительные контроли.

  1. Культивирование клеток и подготовка раствора
    1. Получить и установить культуры пре-адипоцитных и MDA-MB-231 клеточных линий рака молочной железы. Выращивать и самостоятельно поддерживать все клетки с помощью асептической техники в биологической безопасности класса II и стандартных методов клеточнойкультуры 15. Поддерживать клетки 3T3-L1 в Modified Eagle Medium (DMEM) от Dulbecco, дополненную 10% (v/v) сывороткой новорождённого телята (NBCS) и 1% пенициллин-стрептомицином (10 000 U/mL). Поддерживать клетки MDA-MB-231 в RPMI 1640 с добавлением 10% плодовой бычий сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицина (10 000 U/mL).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не позволяйте клеткам 3T3-L1 превышать 80% слияния во время обслуживания и не используйте культуры после20-го номера прохода.
    2. Получите или приготовьте запасной раствор из 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) с 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO 4, 1,8 мМ KH2PO 4, pH7,4.
    3. Приготовьте 50 мл раствора для промывки PBS-глицина, добавив 0,375 г глицина к 50 мл PBS для конечной концентрации глицина 100 мм. Храните раствор при 4 °C до 12 месяцев.
    4. Подготовьте 10 мл буфера проницаемости, добавив 50 мл Triton X-100 до 9,5 мл PBS. Заполните до 10 мл для конечной концентрации 0,5% (v/v) Triton X-100. Храните при 4 °C и используйте в течение месяца.
    5. Подготовьте 50 мл буфера иммунофлуоресценции (IF), добавив 50 мкг бычьей сыворотки альбумина (BSA), 100 мкл Triton X-100 и 25 мкл Твин-20–45 мл PBS. Заполните до 50 мл для окончательной концентрации 0,1% (с в/в) BSA, 0,2% (v/v) Triton X-100 и 0,05% (v/v) Tween-20. Храните при 4 °C и используйте в течение месяца.
    6. Подготовьте 10 мл блокирующего буфера, добавив 1 мл животной сыворотки к 9 мл буфера IF для конечной концентрации 10% сыворотки. Храните при 4 °C и используйте в течение месяца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Видовая идентичность сыворотки зависит от вида хозяина используемых вторичных флуоресцентных антител (см. 2.2.4).
    7. Разморозить гель ECM (общая концентрация белка ~9-9,5 мг/мл) при 4 °C за ночь. Подготовьте 500 мкл аликвотов в микроцентрифугах объёмом 1,5 мл и храните при -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гель ECM очень вариативен и должен быть проверен для индуцирования ожидаемого поведения в каждом типе клетки. Разные типы клеток могут требовать разной концентрации белков или жёсткости матрицы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте заранее охлаждённые наконечники пипеток и контейнеры при работе с гелем ECM, чтобы избежать полимеризации при комнатной температуре. Всегда держите гель ECM на льду во время обращения.
  2. Дифференциация адипоцитов
    1. Посеять от 50 000 до 80 000 пре-адипоцитов 3T3-L1 в 0,5 мл стандартной растущей среды в 2 колодца в 4-колодцевой камере затвора. Пустые скважины будут использоваться для контроля без адипоцитов и кондиционированных сред.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные культуры из камеры склонны к механическим нарушениям. Избегайте вакуумного аспирирования среды и используйте мягкую технику пипетирования с ручными пипетторами.
    2. Сеять от 50 000 до 80 000 пред-адипоцитов 3T3-L1 в 0,5 мл стандартной среды роста в одну яме 24-колодцевой тканевой культивной пластины. Он будет использоваться для сбора кондиционированных сред для контроля кондиционируемых сред.
    3. Дайте обеим культурам достичь 100% слияния в течение 24 часов.
    4. Инициировать адипогенез путем замены среды роста на среду инициации адипогенеза, состоящую из DMEM с добавлением 10% FBS, 0,5 мМ 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX) и 1 мкм дексаметазона. Инкубировать клетки 48 часов при 37 °C в инкубаторе с 5%CO2 .
    5. Через 48 часов заменить отработанную среду на свежую среду прогрессирования адипогенеза, состоящую из DMEM с 10% FBS и 10 мкг/мл инсулина. Инкубировать клетки ещё 48 часов при 37 °C в инкубаторе с 5%CO2 .
    6. Перед продолжением 3D-кокультуры визуально подтвердите наличие липидных капель в >60% клеток. Если накопление липидных капель медленное, замените медиа для прогрессирования на DMEM с добавлением 10% FBS и контролируйте содержание липидов каждые 24 часа.
  3. Наложение и поддержание 3D-кокультуры
    1. Разморозьте гель ECM при 4 °C на ночь, прежде чем продолжить накладку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать эффектов вариативности от партии к партии, рекомендуется использовать одну и ту же партию геля ECM для всех экспериментов в рамках одного исследования.
    2. После успешной дифференцировки 3T3-L1 удаляйте отработанные культурные среды, оставляя небольшой буфер в размере ~50 мкл среды.
    3. Аккуратно добавьте 110 мкл геля ЭКМ в каждую яму, содержащую адипоциты, в камере затвора, стараясь не нарушить монослой адипоцита.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гель ECM быстро затвердевает при комнатной температуре. Чтобы избежать преждевременной полимеризации матрицы, всегда держите гель ECM на льду и используйте наконечники, предварительно охлаждённые при -20°C.
    4. Добавьте 110 мкл геля ЭКМ в пустую контрольную яму без адипоцитов. Чтобы обеспечить равномерное распределение Matrigel, добавляйте каплю по углам колодца и середину колодца. Используйте кончик пипетки, чтобы аккуратно распределить матригель по поверхности культуры, не соскребя.
    5. Инкубировать затвор в течение 1 часа при 37 °C, чтобы гель ECM полимеризировался.
    6. Во время этого этапа инкубации соберите и подсчитывайте клетки MDA-MB-231
      НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: см. шаг 1.4 для подробностей о флуоресцентной маркировке этих ячеек.
    7. Приготовьте разбавленный суспензированный раствор клеток MDA-MB-231 в концентрации 30 000 клеток/мл в молочной среде, содержащую 2% ECM геля (v/v).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная плотность посева клеток варьируется в зависимости от типа клеток и должна быть оптимизирована перед экспериментами. ПРИМЕЧАНИЕ: Среда для роста молочной железы — это коммерчески доступная среда для клеточной культуры, оптимизированная для эпителиальных клеток молочной железы. Он содержит 0,4 % экстракта бычьего гипофиза, 10 нг/мл эпидермального фактора роста (рекомбинантного человека), 5 мкг/мл инсулина (рекомбинантного человека) и 0,5 мкг/мл гидрокортизона. Среда для совместной культуры должна быть тщательно выбрана с учётом потребностей обоих типов клеток.
    8. После полимеризации геля ECM аккуратно добавьте в каждую скважину 450 мкл суспензии MDA-MB-231. В результате общее количество клеток на скважину составляет 13 500 клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе возможен неравномерный наложение клеточной суспензии на гель. Визуально оцените боковые части камеры и мягко постукайте по всем сторонам, чтобы равномерно распределить.
    9. К культуре адипоцитов на 24-луночной пластине добавьте 450 мкл молочной среды для роста, содержащего 2% геля ECM (v/v). Собирайте и меняйте среду каждые 48 часов.
    10. Поддерживайте совместную культуру максимум 5 дней, с заменой медиа каждые 48 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Воздержитесь от вакуумной аспирации и используйте мягкую пипетку. Отслоение геля ЭКМ — возможная проблема, которая может возникнуть во время поддержания совместной культуры.
    11. Только для контроля кондиционированной среды разбавленные адипоциты (начиная с шага 1.3.9), кондиционируемые среды 1:1 свежими материалами, а затем заменят использованные кокультурные носители на 2 и 4 дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе период совместной культуры заканчивается и должен анализироваться либо путём фиксации и окрашивания культур для определения морфологии и экспрессии маркеров ( см. раздел 2), либо путем извлечения клеток из среды совместной культуры и подготовки клеток к дальнейшему анализу (см . раздел 3).
  4. Маркировка флуоресцентных клеток (необязательно)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Маркировка наложенных клеток может быть проведена до шага 1.3.7, чтобы помочь идентифицировать наложенные клетки во время иммунофлуоресцентного захвата изображений.
    1. Приготовьте 5 мл раствора карбоксифлуоресцеина диацетата сукцинимидил эфира (CFSE), растворив 10 мг CFSE в 4,22 мл DMSO. Храните в аликвотах объёмом 500 мкл при -20 °C, защищенных от света.
    2. После подсчёта клеток из шага 1.3.6 промывайте клетки один раз 5 мл PBS. Суспензировать полученную гранулу в 1x PBS до конечной концентрации 1 000 000 клеток/мл.
    3. Добавьте 1 мкл 5 мМ CFSE на мл суспензии ячейки для достижения конечной рабочей концентрации 5 мкм. Инкубировать суспензию клетки в течение 20 минут при комнатной температуре, защищённую от света.
    4. Закалите окрашивание CFSE, добавив 5 томов культурной среды. Инкубировать ещё 5 минут при комнатной температуре.
    5. Пеллетные клетки и дважды промывайте с помощью PBS, чтобы удалить остаточный CFSE. Суспензировать клетки в предварительно нагретой среде роста молочной железы. Инкубировать ещё 10 минут при комнатной температуре, чтобы краситель не осталось.
    6. Клеты с флуоресцентной маркировкой семян, как описано в шаге 1.3.7. Остальная часть протокола может быть выполнена как описано.

2. Иммунофлуоресценция

  1. Фиксация
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать деполимеризации геля ECM и потери образцов во время промывки, позволите всем реагентам уравновеситься до комнатной температуры в течение ~30 минут перед использованием.
    1. После 5 дней совместного выращивания замените медиа на 500 мкл PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 2.1.2–2.3.7 могут выполняться в нестерильных условиях.
    2. Удалите PBS и замените на 2% параформальдегид (PFA) в PBS (свежий приготовленный) при комнатной температуре на 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гель ECM чувствителен к PFA и может привести к отслоению слоя геля.
      ВНИМАНИЕ: PFA со временем разлагается в формальдегид. Избегайте вдыхания паров, обеспечивайте достаточную вентиляцию и всегда носите соответствующие средства индивидуальной защиты (например, перчатки, лабораторный халат, защиту глаз) при работе с PFA.
    3. Удалите PFA и промыйте скважины 500 мкл раствора PBS-Glycine в течение 15 минут при комнатной температуре с мягким перемешиванием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование промывки PBS-Glycine крайне важно для предотвращения образования фоновой флуоресценции свободными альдегидами. Не мойте в PBS без глицина.
    4. Повторите шаг 2.1.3 дважды — всего три промывания. См. 2.1.5 для условий хранения, если не нужно, перейдите к шагу 2.2.2.
    5. На этом этапе протокол можно приостановить на срок до 1 недели, а затвор хранить при 4 °C. Для хранения затвора заполните все колодцы 1 мл PBS и запечатайте крышку затвора тонкой лентой парапленки. Положите слайд ровно в светостойкий контейнер поверх смачченной хрупкой ткани, чтобы культуры не высохли.
  2. Окрашивание антител
    1. Доведите ранее хранившиеся стекли до комнатной температуры, удалите PBS и промыйте колодцы 500 мкл свежего PBS на 15 минут с аккуратным перемешиванием. Пропустите этот шаг, если продолжаете сразу с шага 2.1.4.
    2. Пермеабилизуйте клетки с 500 мкл проницаемого буфера в течение 15 минут при комнатной температуре без перемешивания.
    3. Промывайте скважины 500 мкл PBS, с 15 минут мягкого перемешивания. Повторяйте дважды, всего три стирки.
    4. Добавьте 500 мкл блокирующего буфера в каждую скважину и инкубируемые 1 час при комнатной температуре с мягким перемешиванием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что исходный вид сыворотки в блокирующем буфере совпадает с видом хозяина вторичного антитела. В этом протоколе мы используем ослиные сыворотки и вторичные антитела к ослинам.
    5. Разбавьте первичные антитела, представляющие интерес в буфере IF, согласно рекомендациям производителя. Удалите блокирующий буфер и добавьте 300 мкл раствора антител в каждую яму.
    6. Запечатайте крышку затвора камеры парапленкой и поместите затвор в светостойкий контейнер. Инкубировать на ночь при 4 °C с лёгким перемешиванием.
    7. Промывайте скважины с 500 мкл буфера IF, с 15 минут аккуратного перемешивания. Повторяйте дважды, всего три стирки.
    8. Разбавьте соответствующие флуоресцентно маркированные вторичные антитела в буфере IF, согласно рекомендациям производителя. Добавьте 300 мкл вторичного разбавления антител в каждую яме и инкубируемые в течение 1 часа при комнатной температуре с мягким перемешиванием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После этого этапа избегайте длительного воздействия света, чтобы ограничить фотоотбеливание.
    9. Повторите шаг 2.2.7.
    10. Разведите 300 мкм стандартный раствор 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) 1:800 в PBS. Добавьте 300 мкл в каждую колодцу и инкубуйте 20 минут при комнатной температуре с мягким перемешиванием.
    11. Промывайте клетки 500 мкл PBS в течение 5 минут с мягким перемешиванием. Повторите один раз.
  3. Крепление затвора
    1. Удалите как можно больше остаточных PBS, не нарушая культуры. Замените крышку и отделите камеру от стеклянного затвора с помощью инструмента, предоставленного производителем затвора камеры.
    2. С помощью деликатной рабочей салфетки протрите края затвора, чтобы удалить остатки PBS, не нарушая гель ECM.
    3. Медленно наносите силиконовый герметик по краям затвора с помощью шприца и иголки 18G. Дайте силикону застыть 3 минуты.
    4. Во время затвердевания силикона добавьте 1-2 капли антифейдного монтажного материала в каждую яму. Избегайте пузырей. Если образуются пузырьки, используйте пипетку, чтобы аккуратно их удалить, не повредив культуру.
    5. После того как силикон затвердеет, аккуратно опустите стеклянную накладку под небольшим углом. Используйте щипцы или наконечник пипетки, чтобы вывести пузырьки воздуха при опускании накладки. Используйте мягкое давление, чтобы не разбить скольжение покрытия.
    6. Поставьте слайд в светостойкий контейнер при комнатной температуре и дайте ему застыть на ночь. Затем слайд можно хранить при 4 °C, а протокол приостанавливается на срок до 1 недели.
      ПРИМЕЧАНИЕ (опционально): Чтобы лучше герметизировать слайды, наносите прозрачный лак на края покрытия через 1 час после скольжения.
    7. Слайды изображения используются с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа при увеличении 10–20 раз. Захватите пять случайных полей обзора для минимизации смещения операторов.

3. Сбор кокультур для дальнейшего анализа

ПРИМЕЧАНИЕ: Сбор клеток или биомолекул несовместим с иммунофлуоресценцией. Рекомендуется выращивать ко-культуры, предназначенные для других анализов по следующим этапам, в стандартных 24-колодцевых сосисках с использованием тех же концентраций и объёмов клеток, как описано в разделах 1 и 2.

  1. Экстракция ячеек
    1. Удалите отработанное средство и аккуратно промыйте колодцы ледяным PBS. Повторите один раз — всего два раза.
    2. Используя широкоствольный наконечник пипетки, добавьте 1 мл раствора для восстановления ледяных клеток, далее называемого раствором для восстановления. Аккуратно пипетируйте вверх и вниз, чтобы разрушить слой геля ECM. Переведите жидкость в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Решение для восстановления клеток — это коммерчески доступное неферментное решение, предназначенное для мягкого освобождения клеток, встроенных в гель ECM. Это собственная композиция, которая может быть несовместима с определёнными типами ячеек. В качестве альтернативы можно рассмотреть ферментативную деполимеризацию геля ECM с помощью мягких протеиназ, таких как Dispase или Accutase. Для этого потребуется инкубация при температуре 37 °C и оптимизация времени инкубации.
    3. Добавьте в каждую скважину 250 мкл ледяного раствора для сбора оставшихся ячеек. Перенесите в соответствующую микроцентрифуговую трубку.
    4. Переверните трубки 4-5 раз для смешивания.
    5. Перенесите трубки на лёд и инкубуйте 60 минут с мягким перемешиванием. Каждые 10 минут инвертируйте трубки 2-3 раза, чтобы предотвратить оседание содержимого трубки.
    6. Центрифугные трубки при 300 x g в течение 5 минут при 4 °C
    7. Проверьте наличие видимой клеточной гранулы. Аккуратно удалите супернатант и добавьте 1 мл ледяного 1x PBS. Центрифуга при 300 x g в течение 5 минут при 4 °C. Повторите один раз — всего два раза. Ожидайте, что в грануле будет содержаться 80-90% изначально засеянных клеток, при этом пропорции каждого типа ячеек останутся постоянными.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе клеточную гранулу можно лизировать для сбора белков или нуклеиновых кислот. Лизированные гранулы можно хранить при -80 °C, а протокол можно приостановить на 3 месяца. Лизис несовместим с версией 3.2.
  2. Подготовка суспензии с одной ячейкой
    1. Ресуспензировать гранулы в 200 мкл 0,25% трипсина-ЭДТА. Затем инкубировать при 37 °C в течение 3-4 минут.
    2. Добавьте 600 мкл полной формы для роста для закаления пищеварения трипсина.
    3. Центрифугу при 300 г в течение 5 минут при комнатной температуре. Удалите супернатант и добавьте 500 мкл PBS комнатной температуры.
    4. Центрифугу при 300 г в течение 5 минут при комнатной температуре. Повторите один раз — всего два раза.
    5. Ресуспензия пеллеты в 80 мкл PBS с 0,04% BSA, фильтрующая суспензия с помощью сита 40 мкм.
    6. Разбавьте 5 мкл суспензии в 5 мкл трипан-синего. Посчитайте клетки и оцените жизнеспособность на гемаситометре. Клетки теперь готовы к дальнейшему анализу.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для демонстрации эффективности этого протокола при изучении эффектов взаимодействия между клетками через базальную мембрану рисунки 2 и 3 были перепрофилированы из предыдущей публикации (Pallegar и др.16) в качестве репрезентативных результатов. Рисунок 4 и Рисунок 5 — это новые данные, которые были созданы для демонстрации адаптации этого проток...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Отсутствие сложных взаимодействий между клетками и клетками в традиционной культуре подчёркивает необходимость совершенствования моделей органов и тканей для более точного изучения реакций лекарств и прогрессирования заболевания in vivo. Разработка 3D-систем ко-культуры способствовала заполнению этого пробела, позволяя изучать последствия взаимодействия между клетками и клетками без необходимости исследований in vivo ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Разработка метода частично финансировалась Обществом исследований рака. GRK получила поддержку при поддержке аспирантуры Канадского онкологического общества имени Кэрол Энн Коул в рамках программы обучения по исследованию рака Института исследований рака имени Беатрис Хантер. PMMB была поддержана грантом программы MOBILITAS (2024) от Института исследований здравоохранения Балеарских островов (IdISBa). Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
24 Пластина для культуры тканей скважиныКорнинг3524
Стекло крышки размером 24 x 60 ммUltident Scientific170-C2460
4% параформальдегид в PBSИнвитрогенJ61899. АКРазбавляется до 2% в 1x PBS
Слайды культуры с четырьмя камерамиFalcon354114
Alexa Fluor 647 AffiniPure Fab Fragment Anti-Goat IgG (H+L)Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.705-607-003
Яркий гемацитометрHausser Scientific3120
Набор для пролиферации CFSE CellTraceИнвитрогенC34570
Решение для восстановления клетокКорнинг354253
DAPISigma-Aldrich Canada Co.D9542
Вторичное антитело против мышей IgG (H+L) с перекрёстно адсорбированным антителом, DyLight 594ИнвитрогенSA5-10168
Высокоадсорбируемое вторичное антитело против кроликов IgG (H+L), Alexa Fluor 647ИнвитрогенA31573
DMEM/F-12, без фенол-красногоGibco21041025
Модифицированные орлиные среды Дульбекко, высокий уровень глюкозы, пируватGibco11995-065
Сыворотка плода быка, канадского происхожденияGibco12483-020
Flowmi Cell Strainers, 40 & micro; MBel-Art136800040
Окно и дверь GE Advanced Advanced Silicon — прозрачныеHenkel International2811093
Козий поликлональный анти-ZO-1SantaCruz BiotechnologySC8146Первичное антитело, снято с производства
Крысиный моноклональный анти-ZO-1SantaCruz BiotechnologySC33725Альтернативные первичные антитела для замены прекращенного производства SC8416 против ZO-1
Базальная среда эпителиальной клетки молочной железыPromocellC-21210
Matrigel, фенол без красного цвета, сниженный коэффициент роста, без LDEVКорнинг356231Концентрация белка: 9-9,6 мг/мл
Мышиный моноклональный антивиментинSigma-Aldrich Canada Co.V2258Первичное антитело
Сыворотка для новорождённых телят, новозеландского происхожденияGibco16010159
Пенициллин-стрептомицинGibco15140-122
Фосфатно-буферный физиологический раствор, pH 7,4Gibco10010023
ProLong Gold Антифейд МонтантИнвитрогенP36934
Очищенная мышица Анти-Е-КадхеринBD Biosciences610181Первичное антитело
Rabbit Polyclonal Anti-Claudin 7 AbcamAB27487Первичное антитело
RPMI 1640, глутаминGibco11875-093
SupplementMixPromocellC-39115
Пятно Trypan Blue (0,4%)Gibco15250-061
Трипсин 0,25%-ЭДТАGibco25200056

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of medical science: AMS. 14 (4), 910-919 (2018).
  2. Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene expression perturbation in vitro--a growing case for three-dimensional (3D) culture systems. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).
  3. Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  4. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  5. Lagies, S., et al. Cells grown in three-dimensional spheroids mirror in vivo metabolic response of epithelial cells. Communications Biology. 3 (1), 246(2020).
  6. Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism. Developmental Cell. 18 (6), 884-901 (2010).
  7. Su, J., et al. Cell-cell communication: new insights and clinical implications. Signal Transduction and Targeted Therapy. 9 (1), 196(2024).
  8. Anderson, N. M., Simon, M. C. The tumor microenvironment. Current biology: CB. 30 (16), R921-R925 (2020).
  9. Abuwatfa, W. H., Pitt, W. G., Husseini, G. A. Scaffold-based 3D cell culture models in cancer research. Journal of Biomedical Science. 31 (1), 7(2024).
  10. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7 (1), 45270(2017).
  11. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  12. Leung, C. M., et al. A guide to the organ-on-a-chip. Nature Reviews Methods Primers. 2 (1), 33(2022).
  13. Srivastava, S. K., Foo, G. W., Aggarwal, N., Chang, M. W. Organ-on-chip technology: Opportunities and challenges. Biotechnology Notes. 5, 8-12 (2024).
  14. Gu, P., Xu, A. Interplay between adipose tissue and blood vessels in obesity and vascular dysfunction. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders. 14 (1), 49-58 (2013).
  15. Noel, V., Berry, M. D. Culture of Adherent Cancer Cell Lines. Cancer Cell Biology: Methods and Protocols. , 19-29 (2022).
  16. Pallegar, N. K., Garland, C. J., Mahendralingam, M., Viloria-Petit, A. M., Christian, S. L. A Novel 3-Dimensional Co-culture Method Reveals a Partial Mesenchymal to Epithelial Transition in Breast Cancer Cells Induced by Adipocytes. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 24 (1), 85-97 (2019).
  17. Martin, T. A., Ye, L., Sanders, A. J., Lane, J., Jiang, W. G. Cancer Invasion and Metastasis: Molecular and Cellular Perspective. Madame Curie Bioscience Database [Internet]. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK164700/ (2013).
  18. Ma, W., Tavakoli, T., Derby, E., Serebryakova, Y., Rao, M. S., Mattson, M. P. Cell-extracellular matrix interactions regulate neural differentiation of human embryonic stem cells. BMC developmental biology. 8, 90(2008).
  19. Kim, Y. J., Lee, H. S., Kim, D., Byun, H. K., Koom, W. S., Koh, W. Bilayer 3D co-culture platform inducing the differentiation of normal fibroblasts into cancer-associated fibroblast like cells: New in vitro source to obtain cancer-associated fibroblasts. Bioengineering & Translational Medicine. 10 (1), e10708(2024).
  20. Sourouni, M., et al. Establishment of a 3D co-culture model to investigate the role of primary fibroblasts in ductal carcinoma in situ of the breast. Cancer Reports. 6 (4), e1771(2023).
  21. Salimbeigi, G., Vrana, N. E., Ghaemmaghami, A. M., Huri, P. Y., McGuinness, G. B. Basement membrane properties and their recapitulation in organ-on-chip applications. Materials Today Bio. 15, 100301(2022).
  22. Xu, K., Buchsbaum, R. J. Isolation of mammary epithelial cells from three-dimensional mixed-cell spheroid co-culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3760(2012).
  23. Ooi, J. Y. Y., Tsang, Y. S., McMahon, L. P., Wong, L. Protocol for in vitro immunofluorescence staining in a Transwell co-culture system. STAR protocols. 6 (4), 104162(2025).
  24. Wallisch, S., et al. Protocol for establishing a coculture with fibroblasts and colorectal cancer organoids. STAR Protocols. 4 (3), 102481(2023).
  25. Ildiz, E. S., Gvozdenovic, A., Kovacs, W. J., Aceto, N. Travelling under pressure - hypoxia and shear stress in the metastatic journey. Clinical & Experimental Metastasis. 40 (5), 375-394 (2023).
  26. Vukicevic, S., Kleinman, H. K., Luyten, F. P., Roberts, A. B., Roche, N. S., Reddi, A. H. Identification of multiple active growth factors in basement membrane Matrigel suggests caution in interpretation of cellular activity related to extracellular matrix components. Experimental Cell Research. 202 (1), 1-8 (1992).
  27. Kozlowski, M. T., Crook, C. J., Ku, H. T. Towards organoid culture without Matrigel. Communications Biology. 4 (1), 1387(2021).
  28. Ahmad, Z., et al. Versatility of Hydrogels: From Synthetic Strategies, Classification, and Properties to Biomedical Applications. Gels. 8 (3), 167(2022).
  29. Jinka, R., Kapoor, R., Sistla, P. G., Raj, T. A., Pande, G. Alterations in Cell-Extracellular Matrix Interactions during Progression of Cancers. International Journal of Cell Biology. 2012, 219196(2012).
  30. Short, A. R., Czeisler, C., Stocker, B., Cole, S., Otero, J. J., Winter, J. O. Imaging Cell-Matrix Interactions in 3D Collagen Hydrogel Culture Systems. Macromolecular Bioscience. 17 (6), (2017).
  31. Zeng, F., Yang, W., Huang, J., Chen, Y., Chen, Y. Determination of the lowest concentrations of aldehyde fixatives for completely fixing various cellular structures by real-time imaging and quantification. Histochemistry and Cell Biology. 139 (5), 735-749 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Three Dimensional Co CultureBasement MembraneIndirect Cell InteractionsCell Cell CommunicationExtracellular MatrixBiomimetic ModelImmunofluorescence AnalysisMorphological ChangesIn Vitro Cell CultureMatrigel Scaffold
Video Coming Soon

Related Articles