Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Количественный рациометрический анализ биосенсоров на основе FRET у Arabidopsis thaliana позволяет проводить измерение аналитов в субклеточных компартментах

365 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70028

⸱

24 февраля 2026 г.

 , 
1Department of Biology, Texas A&M University

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем протокол количественного анализа молекул или ионов в субклеточных компартментах живых клеток с использованием биосенсоров на основе резонансного переноса энергии Фёрстера (FRET). Он включает стандартизированную визуализацию, бинарную обработку масок и рациометрический анализ с линейной регрессией, применяемой к фосфату у Arabidopsis thaliana (A. thaliana), но широко применим к другим биосенсорам и организмам.

Аннотация

Флуоресцентные биосенсоры обеспечивают неинвазивный и универсальный подход для мониторинга динамических изменений концентраций метаболитов или ионов в живых клетках. В частности, биосенсоры на основе FRET позволяют проводить рациометрические измерения, отражающие уровни субклеточного анализа, при этом не учитывая уровень экспрессии биосенсоров. Мы описываем комплексный и стандартизированный протокол количественного рациометрического анализа биосенсоров на основе FRET у растений. Протокол направляет пользователей через подготовку живых образцов, получение конфокальных изображений доноров, FRET и акцепторные каналы, генерацию бинарных масок для субклеточных областей, затем регрессионный анализ рациометрических данных. Основным результатом является регрессионный рациометрический показатель, позволяющий количественно сравнивать генотипы, ткани, стадии развития и условия лечения. Используя биосенсор cpFLIPPi-5.3m для неорганического фосфата в качестве примера, мы демонстрируем измерение уровня неорганических фосфатов в хлоропластной строме A. thaliana. Эта аналитическая основа широко применима к другим биосенсорам и моделям на основе FRET, позволяя точно пространственно-временную количественную оценку метаболитов и ионов in vivo. Эта стратегия даёт измеримые данные о субклеточной динамике метаболитов и ионов, поддерживая сравнения в различных экспериментальных условиях.

Введение

Мониторинг динамики метаболитов и ионов в живых растительных клетках крайне важен для понимания того, как метаболические пути и сигнальные сети координируются в пространстве и времени для поддержки роста иразвития 1,2. Уровень клеточных метаболитов быстро колеблется в ответ на факторы окружающей среды, такие как доступность питательных веществ, интенсивность света истресс 3. Среди них уровень неорганического фосфата (Пи) особенно важен с ключевыми ролями в передаче энергии, передаче сигналов и регуляции метаболизма, однако его субклеточная динамика остаётся сложной дляизмерения 4.

Стандартные колориметрические анализы и ядерный магнитный резонанс фосфора-31 (³¹P)-ЯМР могут оценить полный или компартментальный Pi, но они не имеют одноэлементного разрешения и ограниченную временнуюточность 5,6. Хотя синхротронная рентгеновская спектрометрия и радиотрассерная визуализация предоставляют субклеточную или флюсную информацию, они не могут надёжно отличить Pi от фосфорилированных метаболитов и часто являются инвазивными. Безводные фракционирование и ферментные кинетические анализы дают косвенные оценки стромальной и цитозольной Pi, однако эти методы трудоёмки и подверженызагрязнению 7,8. В совокупности эти ограничения подчёркивают необходимость неразрушительных методов с высоким пространственным и временным разрешением для мониторинга метаболитов, таких как Pi, например, живых изображений биосенсоров на основе FRET.

Генетически закодированные биосенсоры на основе FRET являются мощным инструментом для in vivo анализа внутриклеточных ионов и динамики метаболитов. Ранние исследования показали полезность таких биосенсоров для мониторинга концентраций глюкозы, сахарозы и АТФ вклетках 9,10,11. Более современные достижения расширили этот подход для мониторинга кальция, нитратов, фосфатов, ауксина, абсцизовой кислоты и гиббереллина, предоставляя ценные знания о регуляции питательных веществ игормонов 12,13,14,15,16.

cpFLIPPi-5.3m — это биосенсор Pi на основе FRET, оптимизированный для мониторинга субклеточных уровней Pi в клетках растения17. Этот биосенсор состоит из цианобактериального Pi-связывающего белка, окружённого донором FRET (eCFP, усиленный циановый флуоресцентный белок) и акцептора FRET (cpVenus, модифицированный вариант венериного жёлтого флуоресцентного белка), и при связывании с Pi он претерпевает конформационное изменение. Это изменение изменяет Pi-зависимый флуоресцентный сигнал, полученный из FRET, который фиксируется с помощью конфокальной визуализации, так что повышение концентрации Pi приводит к снижению соотношения FRET/донор. Pi-зависящий рациометрический анализ проводится во время постобработки изображений путём сравнения интенсивностей излучения акцептораи донора 18.

Количественный рациометрический анализ FRET в живых растительных тканях требует коррекции на спектральное просачивание и перекрестное возбуждение донорских (CFP) и акцепторных (cpVenus) флуорофоров соответственно18. Выброс возникает, когда излучение CFP обнаруживается в канале FRET, тогда как перекрёстное возбуждение происходит из-за возбуждения cpVenus во время возбуждения CFP. Эти спектральные артефакты могут варьироваться между клетками и субклетовыми компартментами, особенно в пигментированных растительных тканях, что затрудняет рациометрические измерения. Для получения скорректированного или сенсибилизированного излучения FRET вклад сквозного и перекрестного возбуждения вычитается из исходного сигнала FRET следующим образом:

Сенсибилизованное излучение FRET = Исходное излучение FRET — проток сквозь — перекрёстное возбуждение

Корректирующие коэффициенты для прохождения и перекрёстного возбуждения определяются путём визуализации растений, экспрессирующих CFP или cpVenus отдельно в тех же клеточных и субклеточных участках, что ибиосенсор 18. Сенсибилизированное излучение FRET рассчитывается следующим образом:

Сенсибилизированное излучение FRET = Исходное излучение FRET - (корректирующий коэффициент CFP-излучения × пробив) - (cpVenus излучение × коэффициент коррекции перекрёстного возбуждения)

Отношение чувствительного излучения FRET к донорскому излучению (FRET) отражает относительные изменения концентрации лиганда и не зависит от уровней экспрессиибиосенсора 19.

Биосенсор cpFLIPPi-5.3m успешно был направлен на различные субклеточные компартменты A. thaliana и других видов, что позволяет визуализировать динамику Pi 18,20,21,22. Этот биосенсор выявил гетерогенность распределения и транспорта цитозольного Pi между тканями и связал флуктуации хромопластных стромальных Pi с активностью транспортера и фотосинтетическойэффективностью 20,21. Поскольку биосенсор сообщает об изменениях в определённом динамическом диапазоне, интерпретация требует, чтобы диапазон охватывал уровни in vivo Pi при стабильных условиях визуализации. Неравномерное освещение или очень низкое количество биосенсоров могут влиять на рациометрические измерения, что подчёркивает важность стандартизированных настроек обнаружения и соответствующих отрицательных элементов, таких как датчик управления 20 с нечувствительностью по Pi. Когда вариации коэффициента FRET между интересующими регионами (ROI) минимальны, регрессионный анализ может быть неуместен, и рекомендуется объединить средние показатели ROI.

В этой статье мы представляем подробный протокол количественного рациометрического анализа cpFLIPPi-5.3m у A. thaliana, включая конфокальную визуализацию, сегментацию изображений с использованием бинарных масок и расчёт соотношения FRET для динамического мониторинга Pi в живых клетках. Этот метод обеспечивает воспроизводимый рабочий процесс для анализа сигналов биосенсоров на основе FRET, при этом рациометрические данные анализируются с помощью линейной регрессии и статистических сравнений в экспериментальных условиях. Репрезентативные данные приводятся с использованием накопления хромопласта стромы Pi в pht2; 1 — мутант-транспортер хлоропласта Pi, экспрессирующий сенсор cpFLIPPi-5.3m 21,23. Этот протокол поможет исследователям применять рациометрическую визуализацию на основе FRET к другим экспериментальным системам, подробно описывая спектральные коррекции биосенсоров, настройки визуализации и этапы количественного анализа. Стандартизируя получение изображений и регрессионный анализ в определённых экспериментальных контекстах, рабочий процесс поддерживает последовательное сравнение откликов FRET между образцами, проанализированными в соответствующих условиях. Он подходит тем, кто стремится измерять быстрые и специфичные для компартментов изменения уровня анализируемых веществ в тканях живых растений, включая мутантов или трансгенные линии с изменённым транспортом или метаболизмом метаболитов. Такой стандартизированный подход позволит воспроизводиться количественными исследованиями живых клеток в биологии растений. В дополнение к описанному здесь биосенсорному Pi-локализованному хлоропласту, аналитическая стратегия может быть адаптирована для других биосенсоров на основе FRET и специфических для организма тканей при условии проведения специфических для биосенсора калибровочных и контрольных измерений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Трансгенные линии Arabidopsis с экспрессирующими cpFLIPPi-5.3m и cpFLIPPi-null (цитозольные и пластидно-таргетные варианты), ранеебыли получены 17, 18 и pht2; 1-1 (CS19883) был получен из Биологического ресурсного центра Arabidopsis в среде MS, крышных стекла, перфтордекалин, конфокального микроскопа и объектива с погружением в масло 40x (числовая апертура 1,3), возбуждающих лазеров (CFP/445 нм и cpVenus/515 нм или соответствующих инструменту длин волн излучения), эмиссионных фильтров для CFP, акцептора cpVenus/FRET и cpVenus, камеры или детекторов, рабочей станции анализа изображений, FIJI24 и Excel.

1 . Подготовка образца

  1. Генерация трансгенных линий A. thaliana
    1. Клонировать биосенсор cpFLIPPi-5.3m и Pi-нечувствительный контроль (cpFLIPPi-Null), только донорский (CFP) и акцепторный (cpVenus) в экспрессионные векторырастений 17.
    2. Для стабильной экспрессии трансформируйте растения A. thaliana в мутантном фоне sgs3-13 с помощью цветочного погружения Agrobacterium tumefaciens , собирайте семена T1 и выбирайте трансформанты на агарных пластинах 0,5x Murashige и Skoog (MS), содержащих соответствующий агент отбора, например, фосфинотрицин (10 мкг/мл).
    3. Стерилизуйте семена A. thaliana , экспрессирующие биосенсоры, погрузив их в 70% этанол на 1 минуту, затем перенесите на 50% отбеливателя на 1 минуту, а затем промывайте 6-10 раз стерильной водой.
      ВНИМАНИЕ: Этанол и отбеливатель являются раздражителями, и с ними следует обращаться с соответствующими средствами индивидуальной защиты (СИЗ). Проводите стерилизацию семян в химической вытяжке или хорошо проветриваемом помещении, чтобы избежать вдыхания паров, и никогда не смешивайте отбеливатель с этанолом напрямую. Утилизировать отходные растворы в соответствии с институциональными рекомендациями по химической безопасности.
    4. Стратифицировать семена при температуре 4°C в темноте в течение 2-3 дней для синхронизации прорастания, затем перенесите семена в агар-затвердевший или жидкую среду 0,5x MS, содержащую 0,25% сахарозы и желаемую концентрацию Pi (250 мкм) для экспериментального дизайна. Включите агент выбора при выборе трансформаторов.
    5. Переносите пластины в контролируемую камеру роста, установленную на 21°C, 16 часов света: 8 часов тёмного фотоцикла, интенсивность света 120 мкмоль·м⁻²·с⁻¹ и ~60% относительной влажности. Выращивать рассаду 4-7 дней для имиджирования корней или пересадить их в почву на 21 день для изображения листьев.
    6. При тестировании обработок Pi перемещайте сеянцы в нужные среды Pi (например, 250 мкм Pi для полного Pi; 10 мкм Pi для дефицита Pi) и поддерживайте обработку в течение определённого периода (например, 48 часов при острой депривации Pi).
    7. If possible, screen plants for adequate sensor expression by imaging for donor or acceptor fluorescence (low-intensity excitation) using a fluorescence stereo microscope (7-‬10x magnification).
    8. Оценить линии в том же генетическом фоне, которые экспрессируют cpFLIPPi-null, что и лигандо-нечувствительные контроли.

2 . Конфокальная визуализация

  1. Для корней посадите саженцы в их среду для роста/стерильной воде на стеклянную горку. Аккуратно накройте небольшой нанос, чтобы выровнять корни без сжатия. Изображение немедленно.
  2. Для листьев уберите целевой лист (например, 3-й или 4-й лист у 21-дневных растений), положите адаксиальную поверхность в горку.
  3. При необходимости инфильтруйте 10-15 мкл перфтордекалин, чтобы очистить воздух, и аккуратно наложите небольшой стеклянный груз, чтобы расплющить образец. Изображение немедленно.
  4. Используйте объектив с высоким уровнем NA, подходящий для живых клеток (например, 40× / 1,2-1,3 NA). Используйте одну и ту же цель для всех образцов, чтобы сохранить сравнимость.
  5. Используя программное обеспечение Metamorph, установите каналы возбуждения и излучения и захватите изображения (рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для захвата донорного (CFP) излучения могут использоваться возбуждение на ~445 нм (или инструментально-подходящая линия CFP) и сбор донорного излучения (например, полосный пропуск 470-500 нм). Например, возбуждение лазера 445 нм на 70% (рисунок 1A) с временем экспозиции 1000 мс (рисунок 1B) использовалось для захвата излучения CFP. Для захвата FRET (сенсибилизированное излучение акцептора): возбуждение на длине волны донора (445 нм) и сбор зоны излучения акцептора (например, 530-560 нм). Для захвата прямого акцепторного канала: возбуждение при возбуждении акцептора (например, 500-515 нм) и сбор той же зоны излучения акцептора, что и для FRET.
  6. Получайте изображения последовательно: фиксируйте возбуждение/донорское излучение, донорское возбуждение/излучение FRET, затем восбуждение акцептора/излучение акцептора. Держите время съёмки на поле коротким, чтобы ограничить фотоотбеливание (500-1000 мс).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого местоположения клетки (корневый цитозоль, цитозоль мезофилла листьев, хромопласт строма) определите оптимальную мощность лазера, усиление детектора и время экспозиции (рисунок 1), чтобы средняя интенсивность пикселей была выше локального фона, но ниже насыщения детектора. Поддерживайте одинаковые настройки захвата для каналов, получаемых от донорской возбуждения (донор и FRET) для данного места. Параметры визуализации зависят от образца, микроскопа, источника света и системы обнаружения, поэтому должны определяться эмпирически, при этом допустимые диапазоны оцениваются и документируются с помощью регрессионного анализа, как описано в данном протоколе. Используемое здесь программное обеспечение для захвата изображений — Metamorph версии 7.
  7. Используйте одинаковую чувствительность детектора (например, здесь использовалось усиление 2,4x и нулевое смещение) для всех изображений для целевого положения. Если используете несколько детекторов, охарактеризуйте спектральные отклики для каждого детектора и задокументируйте их.
  8. Получите контрольные изображения для каждой ткани или генотипа, который интересуете.
    1. Сфотографируйте нетрансформированную ткань дикого типа, чтобы определить фоновую автофлуоресценцию для каждого канала.
    2. Изображение установок, экспрессирующих только донор (CFP) и только акцептор (cpVenus) в одинактивных настройках захвата для каждого места, чтобы получить коэффициенты спектральной коррекции (проточение и перекрёстное возбуждение). Захватывайте изображения нескольких человек (≥6-8) с разной интенсивностью излучения.

3 . Обработка изображений

  1. Откройте исходные изображения донора (CC — донорское возбуждение/эмиссия), FRET (CY — донорское возбуждение/акцепторное излучение) и акцепторные (YY — акцепторное возбуждение/излучение) в аналитических программах, таких как FIJI или ImageJ. (Рисунок 2).
  2. Определите среднюю фоновую интенсивность на канал, отбирая несколько (5-10) ROI в эквивалентных местах с нетрансформированных растений, сфотографированных с теми же настройками. Вычтите среднее значение фона из каждого соответствующего изображения канала.
  3. Шаги, которые следует следовать в ФИДЖИ
    1. Нажмите на вкладку Анализ> Задайте измерения > выберите среднее значение серого. Измерьте интенсивность фона, выбрав конкретный ROI или среднее значение всего изображения.
    2. Нажмите на вкладку Анализ> Измерить. Сохраняйте значения в таблице Excel и рассчитывайте средние значения фона для каждого канала. Определите порог изображения донора (CFP) для определения пространственной границы биосенсора (обычно у донора самый низкий сигнал). Преобразите пороговое изображение донора в двоичную маску (рисунок 3 A).
    3. Нажмите на изображение вкладки> Настройте> Порог.
    4. Откроется окно для установки порогов. Выберите метод максимальной энтропии для порогов. Установите пространственную границу, в данном случае хромопластную строму, и примените порог. Это создаёт черно-белое двоичное изображение (рисунок 3 B).
    5. Нажмите на вкладку Математика> Делите> Введите значение 255. Изображение станет полностью белым. Сохраните этот бинарный образ маски в виде .tiff файла.
    6. Умножьте бинарную маску на все три изображения, выченные с фона, чтобы создать маскированные изображения для анализа (рисунок 3C).
    7. Откройте файл бинарной маски в FIJI.
    8. Нажмите на вкладку Процесс> Математика>Умножение.
    9. Выберите двоичную маску в качестве одного из изображений, а изображение CC, вычитанное с фона, как другое.
    10. Повторяйте шаги для CY и YY.
    11. Рисуйте ROI на маскированных изображениях, соответствующих исследуемой структуре (целая клетка, цитозоль, хромопластная строма). Для каждого ROI извлекайте средние интенсивности пикселей для донорных, FRET и прямых акцепторных каналов. Сохраняйте метаданные ROI (название изображения, координаты, состояние эксперимента, идентификатор реплицирования) для дальнейшего статистического анализа.
    12. Откройте изображения CC, CY и YY.
    13. Нажмите на вкладку «Математика> Вычитайте> Введите среднее значение фона. В качестве альтернативы это можно сделать непосредственно перед вычислением чувствительного FRET в Excel.
    14. Откройте маскированный файл CC.
    15. Нажмите на Tab Process > Image Calculator. Умножьте CC на маскированный файл изображения CC. Это откроет новый 32-битный файл изображения.
    16. Рисуйте ROI с помощью соответствующих инструментов FIJI на главной панели задач. Например, здесь хромопластная строма выбирается с помощью инструмента «Oval» ROI. Добавьте ROI в менеджер ROI (ctrl+T). Выбирайте 5-10 ROI на изображение. Проверьте «Показать всё». Эти доходы могут храниться в отдельном метафайле (рисунок 3D). Не закрывайте менеджер по возврату инвестиций.
    17. Нажмите на вкладку Анализ> Задайте измерения> Выберите среднее значение серого.
    18. Нажмите на «Измерить» в менеджере ROI.
    19. Средние значения пикселей выбранных ROI отображаются в виде списка в отдельном окне.
    20. Скопируйте эти данные в Excel. Не закрывайте менеджер по возврату инвестиций.
    21. Повторите умножение замаскированного CC-файла с изображениями CY и YY, чтобы получить измерения одинаковых ROI с помощью менеджера ROI в каждом отдельном канале. Храните значения в Excel.

4. Рациометрический анализ

  1. Откройте Microsoft Excel для выполнения следующих операций (рисунок 4).
  2. Расчёт коэффициентов коррекции.
    1. Для каждой клеточной точки нанимите интенсивность FRET-канала (ось Y) от донорских растений по интенсивности донора (ось X). Подогнать линейную регрессию. Наклон — это коэффициент протока донора (обозначается как a).
    2. Повторите, отображая интенсивности FRET-канала с установок только с акцепторами (ось Y) по прямой интенсивности акцептора (ось X). Наклон — это коэффициент перекрестного возбуждения акцептора (обозначается как b).
    3. Используйте ROI ≥15-20 от нескольких заводов для получения устойчивых коэффициентов. Для хлоропластной стромы выбирается 50–60 хлоропластов.
  3. Вычислите сенсибилизированный FRET для каждого ROI как
    Сенсибилизированный FRET = Raw FRET — (донор ×) — (b × акцептор)
    где a и b — коэффициенты, специфичные для расположения, полученные выше (рисунок 4).
  4. Постройте сенсибилизацию FRET (оси Y) и интенсивности донорного канала (ось X) для объединённых ROI. Если подгонить линейную регрессию — Excel предоставит подгонку в формате y = mx + c, где y соответствует чувствительной интенсивности FRET, x — интенсивности донора, c — пересечению y, а m — наклону регрессии. Обратите внимание на R² для адаптированных регрессий. Обычно R² варьируется от 0,8 до 1, что соответствует хорошей посадке (рисунок 4).
  5. Для цитозольных и стромальных измерений вычислите и используйте наклон FRET/донор (сенсибилизованный FRET ÷ донора) как рациометрический показатель, также называемый коэффициентом FRET.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ошибка подгонки для регрессии представляет собой стандартную ошибку наклона (используйте функцию LINEST в Excel). Используйте локально специфический выбор по образцам и генотипам по интересуемым образцам. Линейная регрессия, применённая к данным с нескольких ROI и независимых установок, подтверждает, что отношение FRET не зависит от количества датчиков.
  6. Калибровка, управление и различение неспецифических эффектов.
    1. Используйте cpFLIPPi-null (вариант, нечувствительный к лигандам), выраженный параллельно и обработанный идентично, чтобы отличить потенциальные неспецифические изменения в соотношении FRET (pH, ионная сила, фотофизика) от Pi-специфичных изменений.
    2. Агрегированные данные уровня ROI с полями: генотип, компартмент, идентификация реплицированного растения, ID ROI, донор, акцептор, сырой FRET, сенсибилизированный FRET, соотношение фит (по мере применимости). Сохраняйте сырую интенсивность.
    3. Для сравнений популяций используйте наклоны, полученные на основе регрессии, в качестве первичной статистики; Сообщайте о наклонах ± SE и % относительной ошибке.
    4. Применять соответствующую инференциальную статистику (например, t-тест Студента или ANOVA) к параметрам, полученным на основе регрессии. Используйте непараметрические тесты, если распределения нарушают нормальность. Исправляйте многократные сравнения, когда это возможно.
  7. Контрольный список контроля качества (перед принятием данных)
    1. Убедитесь, что все три канала для каждого изображения находятся ниже насыщенности детектора и имеют достаточное отношение сигнал/шум (>2-10x фон).
    2. Подтвердить, что донорские и акцепторные одиночные флуорофорные контроли были снимены при одинаковых условиях и дали линейные зависимости для получения корректировочных коэффициентов a и b.
    3. Убедитесь, что регистрация изображений точна и что маски правильно определяют области, содержащие биосенсоры.
    4. Подтверждение, что контроль cpFLIPPi-null показывает ожидаемое отсутствие чувствительности к Pi.
  8. Репрезентативные метрики контроля качества, помогающие исключать изображения
    1. Скорость насыщения: менее 1-2% пикселей достигают максимальной интенсивности (65 535) для 16-битных изображений.
    2. Фоновый уровень: средняя интенсивность в областях без клеток варьируется от ~50 до 200 единиц.
    3. Диапазон интенсивности пикселей: средняя интенсивность значительно выше фона, но остаётся ниже насыщенности (~2 000–20 000 единиц).
    4. Отношение сигнал/шум (SNR): значения должны превышать 2-10.

5. Статистический тест разности между двумя регрессионными наклонами

  1. Определите, существенно ли различаются два наклона (регрессионные наклоны с коэффициентом FRET от двух генотипов или методов лечения) 25.
  2. Вычислите статистику теста и степени свободы следующим образом
    figure-protocol-1
    с степенями свободы df = n1 + n2 - 4. m1 и m2 соответствуют наклонам линейной регрессии, sb1 и s b2 относятся к стандартной ошибке каждого наклона (полученной из LINEST или регрессионного выхода), а n1 и n 2 — размеры выборки (количество ROI, используемых для каждой регрессии).
  3. Получите двухстороннее p-значение для t с df (например, используйте таблицу t-распределения или онлайн-калькулятор26). При использовании онлайн-калькулятора (рисунок 5C) введите s, b1, s b2, n1 и n2, полученные на предыдущем этапе, чтобы вычислить p-значение и проверить статистику.
  4. Интерпретация будет заключаться в отвержении нулевой гипотезы (наклоны не существенно различаются), если p < α (например, α = 0,05). Отчёт о b1, b2, sb1, sb2, t, df и p.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Конфокальная визуализация

С помощью конфокальной микроскопии и программного обеспечения Metamorph были получены отдельные каналы для визуализации донорских и акцепторных сигналов FRET в тканях листьев A.thaliana дикого типа (WT) и pht2; 1 мутант-транспортёр хлоропласта Pi (рисунок 2). Репрезентативные изображения иллюстрируют чёткую субклеточную локализацию биосенсора Pi, при этом хлоропласты лег...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол предоставляет стандартизированный подход к количественному определению метаболитов или ионов живыми клетками с использованием биосенсоров на основе FRET. Ключевые преимущества включают неинвазивное ратионометрическое измерение и применимость к нескольким субклетовымкомпартментам 17, 20, 21, 22. Использование бинарных масок и линейной регрессии пов...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что нет конфликтов интересов, связанных с этой работой.

Благодарности

Мы признаём вклад бывших членов лаборатории W.K.V., чьи усилия поддерживали разработку этого протокола. Финансовую поддержку предоставляли Министерство энергетики США, Управление науки, Программа биовизуализации технологий (DE-SC0014037) и Базовые энергетические науки (DE-FG02-04ER15559). A.S.R. частично поддерживался средствами Института перспективных исследований Хаглера при Техасском университете A&M.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
40X масляное погружение в объектив и bbsp;Олимпhttps://www.edmundoptics.in/p/olympus-uplxapo-40x-oil-immersion-objective/55558/?srsltid=AfmBOoo0cqmgz7SoQ3ZCUvlJn_LeA37O42aX5BbFqF76k40CwQLNVn4PОбъективная линза для изображения и bbsp;
Очки для обложки / Cover slipsVWR48393-081Обложка для размещения образца
ФИДЖИ (ImageJ)Открытый исходный код2.9.0Программное обеспечение для анализа изображений
Инвертированный микроскоп Olympus IX81Олимпhttp://www.olympusconfocal.com/brochures/pdfs/ix81.pdfКонфокальная система визуализации
Камера iXon3 897 EMCCD Технология Andorhttps://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-camera-series/ixon-life-897Часть системы конфокальной визуализации
Программное обеспечение MetaMorph V7Молекулярные устройства. ОООВерсия 7Рабочая станция анализа изображений
Microsoft Excel Microsoft Suitev16.68Программное обеспечение для анализа данных
Мурашигэ и Skoog (MS) medium КессонMSP11-10LTСреда роста растений
Перфтордекалин (Acros Organic)Acros OrganicsP9900-25GСреда визуализации
ФосфинотрицинSigma77182-82-2Антибиотик
Камера роста растенийКонвиронОбычайКамера роста
Вращающийся дисковый конфокальный блок Yokogawa CSU-X1Ёкогаваhttps://www.yokogawa.com/solutions/products-and-services/life-science/spinning-disk-confocal/csu-x1-confocal-scanner-unit/Часть системы конфокальной визуализации

Ссылки

  1. Frommer, W. B., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Genetically encoded biosensors based on engineered fluorescent proteins. Chem Soc Rev. 38 (10), 2833-2841 (2009).
  2. Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative imaging with fluorescent biosensors. Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).
  3. Sweetlove, L. J., Fernie, A. R. The role of dynamic enzyme assemblies and substrate channelling in metabolic regulation. Nat Communications. 9 (1), 2136(2018).
  4. Plaxton, W. C., Tran, H. T. Metabolic adaptations of phosphate-starved plants. Plant Physiol. 156 (3), 1006-1015 (2011).
  5. Mimura, T. Regulation of phosphate transport and homeostasis in plant cells. Int. Rev. Cytol. 191, 149-200 (1999).
  6. Roberts, J. K., Wemmer, D., Ray, P. M., Jardetzky, O. Regulation of cytoplasmic and vacuolar pH in maize root tips under different experimental conditions. Plant Physiol. 69 (6), 1344-1347 (1982).
  7. Gerhardt, R., Heldt, H. W. Measurement of subcellular metabolite levels in leaves by fractionation of freeze-stopped material in nonaqueous media. Plant Physiol. 75, 542-547 (1984).
  8. Farquhar, G. D., Caemmerer, S. V., Berry, J. A. A biochemical model of photosynthetic CO2 assimilation in leaves of C3 species. Planta. 149 (1), 78-90 (1980).
  9. Deuschle, K., Chaudhuri, B., Okumoto, S., Lager, I., Lalonde, S., Frommer, W. B. Rapid metabolism of glucose detected with FRET glucose nanosensors in epidermal cells and intact roots of Arabidopsis RNA-silencing mutants. Plant Cell. 18 (9), 2314-2325 (2006).
  10. Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. Evidence for high-capacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors. Mol Cell Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).
  11. Imamura, H., Nhat, K. P. H., Togowa, H., Noji, H. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (37), 15651-15656 (2009).
  12. Lanquar, V., Grossman, G., Vinkenborg, J. L., Merkx, M., Thomine, S., Frommer, W. B. Dynamic imaging of cytosolic zinc in Arabidopsis roots combining FRET sensors and RootChip technology. New Phytol. 202 (1), 198-208 (2014).
  13. Sadoine, M., De Michele, R., Župunski, M., Grossmann, G., Castro-Rodríguez, V. Monitoring nutrients in plants with genetically encoded sensors: achievements and perspectives. Plant Physiol. (1), 195-216 (2023).
  14. Tagliani, A. AuxSens, a FRET-based auxin biosensor. Mol Plant. 14 (7), 1051-1052 (2021).
  15. Rowe, J., Grangé-Guermente, M., Exposito-Rodriguez, M. Next-generation ABACUS biosensors reveal cellular ABA dynamics driving root growth at low aerial humidity. Nat Plants. 9 (7), 1103-1115 (2023).
  16. Rowe, J. H., Rizza, A., Jones, A. M. Quantifying Phytohormones in vivo with FRET Biosensors and the FRETENATOR Analysis Toolset. Meth Mol Biol. 2494, 239-253 (2022).
  17. Mukherjee, P., Banerjee, S., Wheeler, A., Ratliff, L. A., Irigoyen, S., Garcia, L. R., Lockless, S. W., Versaw, W. K. Live imaging of inorganic phosphate in plants with cellular and subcellular resolution. Plant Physiol. 167 (3), 628-638 (2015).
  18. Banerjee, S., Garcia, L. R., Versaw, W. K. Quantitative imaging of FRET-based sensors for cell and organelle-specifc analyses in plants. Microsc Microanal. 22, 300-310 (2016).
  19. Xia, Z., Liu, Y. Reliable and global measurement of fluorescence resonance energy transfer using fluorescence microscopes. Biophys J. 81 (4), 2395-2402 (2001).
  20. Sahu, A., Banerjee, S., Raju, A. S., Chiou, T., Garcia, L. R., Versaw, W. K. Spatial profiles of phosphate in roots indicate developmental control of uptake, recycling, and sequestration. Plant Physiol. 184 (4), 2064-2077 (2020).
  21. Raju, A. S., Kramer, D. M., Versaw, W. K. Genetically manipulated chloroplast stromal phosphate levels alter photosynthetic efficiency. Plant Physiol. 196 (1), 385-396 (2024).
  22. Zhang, S., Daniels, D. A., Ivanov, S., Jurgensen, L., Müller, L. M., Versaw, W. K., Harrison, M. J. A genetically encoded biosensor reveals spatiotemporal variation in cellular phosphate content in Brachypodium distachyon mycorrhizal roots. New Phytol. 234 (5), 1817-1831 (2022).
  23. Versaw, W. K., Harrison, M. J. A chloroplast phosphate transporter, PHT2;1, influences allocation of phosphate within the plant and phosphate-starvation responses. Plant Cell. 14 (8), 1751-1766 (2002).
  24. Schindelin, J., Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J., White, D. J., Hartenstein, V., Eliceiri, K., Tomancak, P. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Cohen, J. Applied multiple regression/correlation analysis for the behavioral sciences. , https://psycnet.apa.org/record/2002-18109-000 (2003).
  26. Soper, D. S. Significance of the difference between two slopes calculator. , https://www.danielsoper.com/statcalc (2025).
  27. Castellani, C. M., Torres-Ocampo, A. P., Breffke, J., White, A. B., Chambers, J. J., Stratton, M. M., Maresca, T. J. Live-cell FLIM-FRET using a commercially available system. Meth Cell Biol. 158, 63-89 (2020).
  28. Kanno, S., Cuyas, L., Javot, H., Bligny, R., Gout, E., Dartevelle, T., Hanchi, M., Nakanishi, T. M., Thibaud, M. C., Nussaume, L. Performance and limitations of phosphate quantification: guidelines for plant biologists. Plant and Cell Physiol. 57 (4), 690-706 (2016).
  29. Verma, A. K., Noumani, A., Yadav, A. K., Solanki, P. R. FRET based biosensor: principle applications recent advances and challenges. Diagnostics. 13 (8), 1375(2023).
  30. Banerjee, S., Versaw, W. K., Garcia, L. R. Imaging cellular inorganic phosphate in Caenorhabditis elegans using a genetically encoded FRET-based biosensor. PLoS One. 10 (10), e0141128(2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

FRET
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.