Методическая статья

Интегрированная стратегия микропластин и HPTLC для определения и профилирования общего содержания фенолов и флавонолов в экстрактах цитрусовой кожуры

DOI:

10.3791/70034

⸱

8 мая 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Laboratorio de Fitoquímica (LAFIT), Escuela de Química, Universidad Nacional (UNA), 2Herbario Juvenal Valerio, Escuela de Ciencias Ambientales, Universidad Nacional (UNA), 3Laboratorio de Productos Naturales y Ensayos Biológicos (LAPRONEB), Escuela de Química, Universidad Nacional (UNA)

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании представлен комбинированный подход AlCl₃/Фолин–Чиокальтеу для профилирования HPTLC и количественной оценки флавонолов/5-гидроксифлавонов и фенольных соединений в цитрусовых кожурах, дополненный микропластинным анализом.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фенольные соединения и флавоноиды значительно способствуют антиоксидантной активности и функциональной ценности цитрусовых побочных продуктов. Однако традиционные колориметрические анализы, хотя и широко используемы, не имеют хроматографического разделения и могут подвергаться воздействию химических интерференций. Этот протокол представляет собой интегрированный аналитический рабочий процесс, сочетающий микропластинчатые спектрофотометрические анализы с высокоэффективной тонкослойной хроматографией (HPTLC) для определения и профилирования общего содержания фенолов (TPC) и общего содержания флавонов плюс содержания 5-гидроксифлавонов (TFHC) в экстрактах цитрусовой кожуры. Этанолёвые экстракты извести (Citrus aurantifolia) и мандарина (Citrus reticulata) были оценены с использованием анализов фолина–Чиокальтеу (FC) и хлорида алюминия (AlCl₃) в формате микропластин с 96 лунами, затем анализ HPTLC с использованием двух последовательных подвижных фаз и двойной постхроматографической дериватизации. Измерения микропластин показали значения TPC 74,2 ммоль/г для извести и 72,8 ммоль/г для мандарина, тогда как значения TFHC составляли соответственно 15,5 ммоль/г и 6,0 ммоль/г. Разделение HPTLC позволило выявить четыре фенольные полосы в извести и шесть в мандарине. После дериватизации AlCl₃ были селективно визуализированы две известковые полосы, что соответствует флавонолам или 5-гидроксифлавонам. Сумма фенольных загрязнений, оценённая HPTLC, составила 22,0 и 20,8 ммоль/г сухого вещества для извести и мандарина соответственно, тогда как TFHC достиг 13,4 ммоль/г в извести и не был обнаружен в мандарине. Эти результаты показывают, что микропластинчатые анализы обеспечивают быструю и чувствительную оценку общего содержания, тогда как HPTLC повышает селективность за счет разделения соединений и дериватизации по функциональной группе. Объединённая стратегия обеспечивает высокопроизводительный скрининг, за которым следует хроматографическое подтверждение, предоставляя практичную и воспроизводимую платформу для фитохимической характеристики сложных матриц растений.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цитрусовые кожуры являются побочным продуктом соковой индустрии и продемонстрировали наличие функциональных соединений, таких какантиоксиданты 1. Их использовали как нейропротекторныепродукты 2, противовоспалительные и противоакненые косметическиесредства 3 и пищевыедобавки 4. Некоторые из этих биологических активностей связаны сфлавоноидами 5 ифенолными соединениями 6. Общие методы оценки общего количества флавоноидов и фенолов были установлены влитературе 7, наиболее распространёнными являются Фолин-Чиокальтеу для общего содержания фенолов (TPC)8 и хлорид алюминия для полного содержания флавоноидных соединений (TFC)9 с помощью спектрофотометрии. Метод Фолина-Чиокальто был впервые опубликован в 1927 году10, основанный на модификации реакцииФолина-Дени 11, обе основаны на редокс-реакции фосфотунгстически-фосфомолибдных соединений. Метод Фолина-Чиокальто измеряет редуктивную способность фенольныхсоединений 12. Тест с хлоридом алюминия и флавоноидами был впервые предложен в 1960 году на основе комплексов между металлом и флавоноиднымилигандами 13.

Оба спектрофотометрических анализа являются полезными инструментами для оценки и сравнения общего содержания фитосоединений, часто встречающихся в растительных материалах. Однако они подвержены различным ограничениям. Например, некоторые ограничения возникают из-за использования внешнихстандартов 14, когда обычно предполагается, что химическая природа стандарта не существенно влияет на отклик сигнала. На практике это предположение трудно проверить, поскольку молярная поглощённость зависит от таких факторов, как сопряжённость и другие структурные особенности, которые сложно стандартизировать в натуральных продуктах. Например, Аппел идр. 15 оценили TPC из одиннадцати видов дубов и разработали так называемый «самостандартный» подход, сообщая о различиях более 50% в наклонах калибровочных кривых. Самостандартное использование — это стратегия, разработанная для представления той же составной смеси соединений, что и в образце, что обеспечивает более точное соответствие с фактическим общим фенолным содержанием (TPC) вобразце 16. Самостандарты также дают информацию о соотношении между реактивными группами и средней молекулярной массой; однако это трудоёмко и сложно стандартизировать.

Общий анализ флавоноидных соединений на основе комплексирования хлорида алюминия был критически оценён в недавнихисследованиях 17,18, которые пришли к выводу, что AlCl₃ образует комплексы с двумя подгруппами флавоноидов: флавонолами и 5-гидроксифлавонами. Обычно флавонолы демонстрируют максимальное поглощение около 440 нм, тогда как 5-гидроксифлавоны поглощают около 415 нм. Кроме того, некоторые флавоноиды могут проявлять внутреннюю абсорбцию в диапазоне 415–440 нм даже при отсутствии дериватизации, а увеличение всасывания при комплексировании варьируется в зависимости от отдельных соединений. Кроме того, оба колориметрических анализа не имеют разделения и, следовательно, не могут различать разные фенольные компоненты; Хотя эта функция может быть выгодна для оценки общего содержания, она приводит к ограниченной конкретике. Эти соображения подчёркивают необходимость аналитической стратегии, которая разрешает отдельные компоненты до колориметрического обнаружения, тем самым отличая истинные реакции анализов от спектральных или химических интерференций.

Несмотря на эти ограничения, такие анализы остаются ценными инструментами для общего скрининга биоактивных фенольных соединений в растительных и фруктовыхэкстрактах 19. Для оценки возможных интерференций эффективным подходом является использование высокоэффективного метода тонкослойной хроматографии (HPTLC), выявленного с использованием реагентов Фолин–Чиокальтеу и AlCl₃. Хроматографическое разделение позволяет обнаруживать помехие вещества с уже существующими полосами поглощения до комплексирования, а фотографическая документация позволяет одновременно анализировать несколько максимумов поглощения. Кроме того, анализ HPTLC обладает рядом преимуществ по сравнению с более комплексными хроматографическими методами, такими как HPLC–MS/MS, включая меньшее потребление растворителей, сокращение времени анализа за счёт одновременной обработки нескольких образцов (до 18 на пластину)20 и облегчённую интерпретацию сложных смесей благодаря селективности постхроматографическойдериватизации 21.

В этой работе мы представляем интегрированный протокол для определения специфических соединений, включающих общее количество полифенолов (TPC) и общий уровень флавонов плюс 5-гидроксифлавонов (TFHC) в экстрактах цитрусовой кожуры с использованием высокоэффективного тонкослойного хроматографического разделения (HPTLC), а также общей оценки содержания на основе колориметрического микропластинного анализа. Планарная хроматографическая количественная оценка фенольных соединений проводится с помощью реагента Фолина–Чиокальтеу, тогда как дериватизация хлорида алюминия применяется исключительно для хроматографической идентификации полос, соответствующих флавоналам и 5-гидроксифлавонам. В этом подходе определение TFHC основано на ответе Фолина–Чиокальтеу хроматографически разрешенных и химически идентифицированных соединений, а не на комплексировании хлорида алюминия для количественной оценки. Анализ HPTLC позволяет отделять и визуализировать специфические соединения, что позволяет идентифицировать отдельные фенольные компоненты и выявлять потенциальные спектральные интерференции. Кроме того, представлен спектрофотометрический метод на основе микропластин для быстрой оценки общего количества TPC и TFHC, обеспечивающий дополнительный высокопроизводительный инструмент скрининга сложных матриц растений.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка фруктовых кожур

  1. Удалите примерно 50 г кожуры с каждого фрукта, отделив их от съедобной части. Для наших репрезентативных результатов мандарины были приобретены в местном магазине (импортированы из Чили, сорт изабеллин), а лаймы были собраны с дерева недалеко от Сан-Хосе, Коста-Рика (ваучерный образец JVR-16434).
  2. Поместите кожуру в пластиковый пакет с зип-локом и заморозьте при -20 °C минимум 2 часа.
  3. Перенесите замороженные кожуры в предварительно охлаждённую сублимационную сушилку, держите пакеты открытыми и на ночь пропылесосите (0,1 мбар) до полного высыхания.
  4. Измельчите каждый высушенный материал примерно до 0,1 мм с помощью клиночной мельницы.

2. Извлечение

  1. Взвесьте примерно 100 мг сухой, молотой цитрусовой цедры (известковой или мандаринской) и положите её в стеклянную трубку объёмом 15 мл.
  2. Добавьте 3 мл этанола 60% в пробирку.
  3. Сониковать смесь в ультразвуковой ванне в течение 10 минут при 40 °C, чтобы нарушить работу клеток растений и облегчить выброс фитохимических веществ.
  4. Центрифугуйте образец при 850 × г на 10 минут.
  5. Аккуратно переместите этаноловый супернатант в объёмную колбу объёмом 10 мл с помощью пипетки Пастера, чтобы избежать нарушения осадка.
  6. Добавьте дополнительно 3 мл этанола 60% в пробирку, содержащую влажный твёрдый остаток.
  7. Повторите шаги соникации и центрифугирования, описанные выше в шагах 2.3 и 2.4.
  8. Перенесите супернатант в ту же объёмную колбу и соедините его с предыдущим экстрактом.
  9. Выполните третье извлечение, повторяя предыдущие шаги (2.6–2.8).
  10. Окисить комбинированный экстракт (≈9 мл) двумя каплями 0,1 моль/л HCl (для повышения стабильности антоцианинов и других фенольных соединений) и увеличить объём до 10 мл с помощью метанола.
  11. Выполняйте эту процедуру в тройном экземпляре для каждого образца.

3. Общее содержание флавонолов и 5-гидроксифлавонов (TFHC) с помощью микропластинчатой спектрофотометрии

  1. Приготовьте раствор кверцетина (100 мкг/мл) или эквивалентный флавоноидный стандарт.
    1. Взвесьте 10 мг кверцетина с помощью весов с точностью 0,1 мг.
    2. Растворите кверцетин примерно в 5 мл этанола 95% и переведите раствор в объёмную колбу объёмом 10 мл, обозначенную как стандартный раствор.
    3. Прополосните стакан дважды 2 мл 95% этанола и добавьте промывки в колбу.
    4. Увеличите объём до цели с помощью 60% этанола.
    5. Подготовьте стандартные растворы (10–100 мкг/мл) и заготовку в микроцентрифугных пробирках объёмом 1,5 мл согласно таблице 1.
    6. Убедитесь, что все образцы и стандарты находятся в диапазоне поглощения 0,2–0,8, при необходимости корректируя концентрации.
    7. Подготовьте компоновку микропластины, вливая 60 мкл заготовки, образца или стандарта в каждую яму, согласно рисунку 1. Выполните три повторения на каждый образец или стандарт.
    8. Раздайте водные растворы 2% хлорида алюминия, 5% ацетата натрия и 80% метанола в отдельные реагентные резервуары.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обращайтесь с хлоридом алюминия и метаноловыми растворами с осторожностью. Растворы хлорида алюминия раздражают, а метанол токсичен при проглатывании, вдыхании и всасывании кожи. Избегайте контакта кожи и глаз, а также носите соответствующие средства индивидуальной защиты
    9. Используя 8-канальную многоканальную пипетку, в каждую скважину добавьте 10 мкл раствора AlCl₃, 10 мкл раствора ацетата натрия и 200 мкл 80% метанола.
    10. Встряхните пластину на средней интенсивности в течение 10 секунд и инкубуйте в темноте 30 минут.
    11. Измерьте поглощение на 415 нм. Если встряхивание невозможно, перед инкубацией смешайте вручную с микропипеткой (рисунок 2).
    12. Интерполируете значения поглощения образца из калибровочной кривой и применяйте коэффициенты разбавления, объема и коррекции массы по мере необходимости.

Таблица 1: Стандарты количества кверцетина для кривой калибровки общего содержания флавонолов и 5-гидроксифлавонов (TFHC). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Схема микропластин для анализа общего количества флавонолов и 5-гидроксифлавонов (TFHC ). (A) Схема микропластин. (B) Программа для верстки программ пятого поколения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-protocol-2
Рисунок 2: Программное обеспечение микропластин для анализа содержания полных флавонов и 5-гидроксифлавонов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

4. Общее количество полифенолов (TPC) с помощью микропластинной спектрофотометрии

  1. Подготовьте стандартную кривую галлевой кислоты (0,000–0,120 мг/мл).
    1. Весите примерно 0,0123 г галловой кислоты (98% чистоты) с помощью аналитических весов и растворите её в дистиллированной воде.
    2. Переливайте раствор в колбу объемом 10 мл, промывайте дважды и наполните до метки дистиллированной водой, чтобы получить стандартный раствор.
    3. Приготовьте рабочий раствор, разбавляя 1 мл стандартного раствора до 10 мл дистиллированной водой.
    4. Подготовьте калибровочные стандарты, дополнительно разбавляя рабочий раствор согласно таблице 2.
    5. Корректируйте концентрацию, если значения поглощения выходят за пределы 0,2–0,8.
    6. Подготовьте рабочий реагент Фолин–Чиокальтеу, разбавляя коммерческий реагент в соотношении 1:14 дистиллированной водой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Реагент фолина–Чиокальтеу и растворы соляной кислоты являются коррозийными. Избегайте брызг и прямого контакта. Выполняйте обработку реагентов в вытяжной камере.
    7. Пипетка 30 мкл каждого образца, стандартного или заготовочного, в 96-ядровую микропластину, следующую схеме на рисунке 3A, используя три реплики на образец.
    8. Добавьте в каждую скважину 215 мкл рабочего реагента Фолина–Чиокальтеу с помощью многоканальной пипетки.
    9. Добавьте в каждую скважину 50 мкл раствора карбоната натрия 20% и тщательно перемешайте с помощью микропипетки.
    10. Инкубировать пластину в течение 20 минут при 40 °C с перемешиванием (рисунок 3B).
    11. Измерьте поглощение при 755 нм.

Таблица 2: Количество стандартов галловой кислоты для кривой калибровки общего фенольного содержания (TPC). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

figure-protocol-3
Рисунок 3: Компоновка микропластин и программное обеспечение для анализа микропластин с полным содержанием фенолов (TPC). (A) Планировка. (B) Программное обеспечение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

5. Общие условия, используемые для высокоэффективного анализа тонкослойной хроматографии

  1. Стандартные кривые
    1. Приготовьте стандартные растворы кверцетина и галловой кислоты (по 100 мкг/мл каждый), как описано выше в разделах 3 и 4.
    2. Нанесите галловую кислоту на шесть путей при объёмах 2, 4, 6, 8, 10 и 12 мкл.
    3. Наносите 5 мкл галловой кислоты и кверцетина отдельно на отдельные дорожки для идентификации.
  2. Раскладка номерных знаков:
    1. Используйте 10 × 20 см силикагель с алюминиевой подкладкой 60 F₂₅₄ TLC в качестве стационарной фазы.
    2. Настройте параметры применения следующим образом: позиция Y 7,0 мм, длина полосы 6,0 мм, первая позиция X 14,0 мм, расстояние между путями 9,4 мм.
    3. Наносите по 10 мкл каждого экстракта на полосу, используя азот в качестве распылительного газа.
    4. Установите расстояние перед растворителем на 70 мм.
  3. Разработка пластин:
    1. Проявить пластины в ручной камере с 40 мл подвижной фазы и дать 10 минут на насыщение камеры с использованием фильтрующей бумаги, контактирующей с подвижной фазой и стенкой камеры, чтобы пары подвижной фазы насыщали атмосферу камеры.
    2. Проявлять пластины с использованием MP1 или MP2, выполняя двойную проявку при необходимости. Мобильная фаза 1 (MP1), состоящая из этилацетата:муравьиной кислоты:уксусной кислоты:вода (100:11:11:26); и MP2 из толуола:этилацетата: муравьиной кислоты (5:4:1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разработайте HPTLC-пластины в вытяжной вытяжке. Компоненты подвижной фазы (этилацетат, толуол, муравиная кислота и уксусная кислота) являются летучими, а толуол и этилацетат — высоковоспламеняющимися. Избегайте вдыхания пара и устраняйте источники возгорания.
    3. Дайте тарелкам высохнуть при комнатной температуре.
  4. Дериватизация
    1. Распыляйте пластины реагентом Фолин–Чиокальтеу (300 мкл реагента + 600 мкл 50% этанола), кратковременно высушите с помощью теплового пистолета и распылите 1 мл 10% карбоната натрия в 50% этаноле.
    2. Отдельно распыляйте другие пластины 1% хлоридом алюминия с 50% этанолом.
  5. Нагревайте пластины равномерно с помощью теплового пистолета, пока цвет не стабилизируется и пластины полностью не высохнут.

6. Разработка анализа общего содержания флавонолов и 5-гидроксифлавонов (TFHC) и общего содержания фенолов (TPC) с помощью высокоэффективной тонкослойной хроматографии

  1. Наносить образцы в трёхкратные полосы, а также референсные полосы галловой кислоты и кверцетина (для идентификации, как описано в шаге 5.1.4).
  2. Проявите пластину с помощью MP1.
  3. Проявляйте пластину заново с помощью MP2.
  4. Дериватизация пластины с помощью FC-реагента, как было описано ранее.
  5. Фотодокументируйте пластину с помощью белого освещения, а также освещения 254 нм и 366 нм ультрафиолетового света.
  6. Повторите процедуру, заменяя последний этап дериватизации AlCl3 , как показано на рисунке 4.

figure-protocol-4
Рисунок 4: Шаги VisionCats для анализа TPC и TFHC с помощью HPTLC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой рисунка.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Условия извлечения
Общий протокол экстракции, описанный здесь, использует 60% этанола, как ранеесообщалось 22. При экстраполировании на другие растительные источники условия экстракции можно оптимизировать с точки зрения полярности растворителя и количества циклов. Подробное обоснование выбора как растворителя, так и количества циклов было подробно описано вдругом месте 16. Выбор растворителя может основываться на предыдущей литературе и индексах полярности; В целом рекомендуются гидроалкогольные смеси этанола или метанола, а также ацетона. Оптимальное количество циклов экстракции (n) можно оценить, деля фиксированный общий объём 10 мл на 1–5 циклов по 10/n мл, после чего жидкие экстракты проводятся в пул. Эффективность различных номеров циклов экстракции затем статистически сравнивается для определения условий, дающего максимальное поглощение в анализе TPC.

Квантификация микропластин и HPTLC
Стандартные калибровочные кривые для микропластинного анализа и HPTLC представлены на рисунке 5. Для определения общего содержания фенолов (TPC) методом микропластин Фолина–Чиокальтеу и для пластин HPTLC, дериватизированных тем же реагентом, были установлены калибровочные кривые с использованием галловой кислоты в качестве эталонного соединения. Галловая кислота была выбрана не только потому, что является одним из самых часто используемых стандартов для количественной оценки TPC, но и потому, что её можно элюировать при тех же подвижных фазовых условиях, что и образцы извести и мандарина. Кверцетин также оценивался как потенциальный стандарт для HPTLC-анализа; однако она оказалась неподходящей для этой хроматографической системы, так как сочеталась с фронтом растворителя и не могла быть достоверно измерена. Тем не менее, TFHC был определен с использованием кверцетина в качестве эталонного стандарта, поскольку галловая кислота не образует цветной комплекс с хлоридом алюминия, поскольку она не является ни флавонолом, ни 5-гидроксифлавоном.

figure-results-1
Рисунок 5: Пластина HPTLC из извести, мандарина, галловой кислоты и кверцетина развивалась последовательно с MP1, затем MP2, и отдельно дериватизирована хлоридом алюминия (AlCl₃) и реагентами фолина–чиокальтеу (FC). Показан хроматографический профиль после дериватизации AlCl₃. Сокращения: FC, дериватизация Фолина–Чокальтеу; AlCl₃, дериватизация хлорида алюминия; W — освещение белого света; 366, ультрафиолетовое освещение на расстоянии 366 морских миль. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Результаты по общему содержанию фенолов (TPC) и общему содержанию флавоноидов и гидроксициннамовой кислот (TFHC) представлены в таблице 3. Как и ожидалось, показатели TFHC были значительно ниже TPC, примерно в пять раз ниже в образцах извести и в двенадцатикратно ниже в образцах мандарина.

Таблица 3: Результаты по общему содержанию фенолов мандарина и извести методом микропластин .Сокращения: Abs: поглощение, CV: коэффициент вариации, DF: фактор разбавления, GAE: эквиваленты галловой кислоты, IR: независимая реплика, QE: эквиваленты кверцетина, Rep: повторение, SD: стандартное отклонение, TFHC: общее количество флавонолов и 5-гидроксифлавонных соединений, TPC: общее содержание фенолов и figure-results-2 среднее значение. *Рассчитано на основе сухого вещества. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Аналогично, полученные результаты анализа HPTLC суммированы в Таблице 4. Хроматографическое разделение позволяет визуализировать отдельные полосы, соответствующие разным соединениям. В образцах извести были обнаружены четыре фенольных компонента, а в образцах мандарина — шесть компонентов. Ни одна из этих полос не соответствовала коэффициентам удержания эталонных стандартов (галловая кислота и кверцетин), что соответствует ожиданиям.

Таблица 4: Результаты по общему фенолному содержанию и полосам, соответствующимAlCl 3 , выявили соединения с помощью HPTLC, дериватизированные с помощьюAlCl3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

В таблице 4 также представлено общее содержание фенолов, оценённое по анализу HPTLC, рассчитанное как сумма отдельных соединений, обнаруженных хроматографически (аналогично TPC). Кроме того, в таблице приведено совокупное содержание полос, приписываемых флавонолам или 5-гидроксифлаванам (Rf = 0,46 и 0,62 в извести; у мандарин не обнаружено). Эти полосы после дериватизации AlCl₃ стали жёлтыми и проявляли желтоватое флуоресцентное сияние при 366 нм ультрафиолетовом освещении. Однако до дериватизации видимой окраски не наблюдалось, как показано на рисунке 5.

Для анализа HPTLC дериватизация Фолина-Чиокальтеу (FC) обеспечивает комплексное обнаружение фенольных соединений, хотя могут возникать незначительные интерференции. Кроме того, дериватизация хлорида алюминия (AlCl₃) избирательно окрашивает подмножество флавоноидов. Совместное применение обоих реагентов улучшает стандартизацию методов и смягчает некоторые присущие им ограничения. Примечательно, что маловероятно, чтобы нефлавоноидное соединение проявило как характерную синюю окраску при FC, так и жёлто-красное поглощение при AlCl₃. Кроме того, ранее существующие хромофоры могут быть исключены как интерференции, если они были видимы с той же интенсивностью до дериватизации.

Как показано на рисунке 5, экстракт извести имел две полосы с Rf 0,62 и 0,46, которые не были обнаружены на неразвитой пластине, но стали чётко видимы после дериватизации Фолина–Чиокальтеу (FC) и AlCl₃. Это поведение подтверждает их флавоноидную природу, возможно, соответствующую неоэриоцитрину игесперидину 23. Дополнительные фенольные компоненты наблюдались на уровне Rf 0,21 и 0,37 в извести, а также Rf 0,36, 0,39, 0,42, 0,46, 0,54 и 0,89 в мандарине. Эти полосы были обнаружены после дериватизации FC, но не после обработки AlCl₃, что указывает на их возможное соответствование нефлавоноидным фенолным соединениям. Согласно литературе, основные нефлавоноидные фенолики, сообщаемые в мандарине, включают хлорогеновую и трансферуловуюкислоты 24,25. В извести ранее описанные другие соединения включают кумариновую кислоту и дигидроксиферуловуюкислоту 23. Тем не менее, подтверждение этих заданий требует анализа с использованием дополнительных стандартов справки.

Сравнение мобильных фаз HPTLC
Обе мобильные фазы были разработаны как модификация ранее сообщаемых систем26, 27, 28. Более полярная подвижная фаза (MP1, рисунок 6A) обеспечивала лучшее разделение фенольных компонентов по сравнению с MP2. В отличие от этого, менее полярная подвижная фаза (MP2) (рисунок 6B) позволяла одновременно удерживать как компоненты образца, так и эталонные стандарты в одном хроматографическом пробеге. Однако при условиях MP2 значения Rf в выборке были относительно низкими, при этом некоторые соединения оставались близко к истоку, как показано на рисунке 6. Для решения этого ограничения была реализована двойная процедура проявки с использованием MP1, а затем MP2. Эта стратегия обеспечивала улучшенную миграцию и разрешение компонентов образца, позволяя количественно оценивать по стандартам галловой кислоты на той же пластине при идентичных хроматографических условиях. Кверцетин имел слабую жёлтую окраску до обработки AlCl₃, которая усилилась после дериватизации. Для известковых и мандариновых экстрактов были обнаружены две отдельные полосы, а также оставшаяся полоса в начале источника. Кроме того, после дериватизации AlCl₃ стала чётко видна жёлтая полоса с Rf 0,14.

figure-results-3
Рисунок 6: Пластины HPTLC из извести, мандарина, галловой кислоты и кверцетина, разработанные с подвижной фазой 1 (A) и подвижной фазой 2 (B ). Для каждой пластины дорожки слева направо соответствуют: развитым (недериватизированным), дериватизированным по Фолин–Чиокальтеу и дериватизированным образцам AlCl₃. Визуализация проводилась при белом свете. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сбор и хранение образцов являются критически важными этапами для обеспечения целостности фитохимических анализов. После сбора образцы следует транспортировать в холодильнике и как можно скорее сублимировать, чтобы минимизировать разрушение. Хотя высушенные биологические материалы обычно стабильны, экстракты в растворе значительно более лабильны, даже если хранятся в холодильнике. Поэтому аналитические определения предпочтительно проводятся на свежеприготовленных экстрактах. Длительное хранение, даже несколько дней в холодных и защищённых светом условиях или несколько часов при комнатной температуре, может привести к заметным изменениям хроматографических профилей, включая изменения интенсивности полос и образование осадков. Эти изменения обычно связаны с химическими превращениями, такими как окисление, гидролиз или реакции комплексирования. Поэтому все реагенты и экстракты должны храниться и обращаться в холодных и тёмных условиях для сохранения их химической стабильности.

При сравнении обеих техник (Таблица 3 и Таблица 4) очевидны систематические количественные различия. Как в извести, так и в мандарине показатели TPC, полученные с помощью микропластинчатого анализа, были примерно в три раза выше, чем оценённые HPTLC. В извести TPC составлял 74,2 ммоль/г по микропластинам против 22,0 ммоль/г DM у HPTLC, тогда как значения TFHC составляли соответственно 15,5 ммоль/г и 13,4 ммоль/г. На мандаринском TPC достигал 72,8 ммоль/г по микропластинам по сравнению с 20,8 ммоль/г у HPTLC. Для TFHC метод микропластин дал 6,0 ммоль/г, тогда как соответствующие диапазоны HPTLC не обнаружили.

Эти различия можно объяснить внутренними ограничениями и механизмами реакции каждого метода. Анализ Фолина–Циокальтеу (FC) известен реакцией не только с фенолными соединениями, но и с различными нефенольными редуцирующими веществами, включая аскорбиновую кислоту, тирозин, муравьиную кислоту иуксусную кислоту-29, а также с другими низкомолекулярными редуктивами. Такие соединения вносят вклад в общий спектрофотометрический сигнал, что может привести к переоценке TPC. Кроме того, мелкие фенольные компоненты могут совместно увеличивать полную абсорбцию в микропластинном анализе, даже если их отдельные концентрации слишком низки для образования чётких, количественно измеримых полос в HPTLC. Некоторые небольшие или сильно полярные метаболиты также могут не удерживаться, не разрешаться или визуализироваться в используемых хроматографических условиях.

figure-discussion-1
Рисунок 7: Схематическое представление комплексов AlCl₃, образованных флавонолами и 5-гидроксифлавонами. (A) Флавонолы и (B) 5-гидроксифлавоны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Методологические различия в химии обнаружения дополнительно способствуют наблюдаемым вариациям. Реакция FC приводит к значительному увеличению поглощения за счёт уменьшения реагента, что приводит к высокой аналитической чувствительности. В отличие от этого, метод AlCl₃ относительно неспецифичен и основан на сложном образовании с определёнными флавоноидами. Флавонолы обычно демонстрируют максимальное поглощение около 410 нм, тогда как 5-гидроксифлавоны поглощают около 440нм 18, а их комплексы сAl 3⁺ показаны на рисунке 7. Однако увеличение поглощения после комплексирования сравнительно незначительно, что делает анализ AlCl₃ более восприимчивым к интерференциям от компонентов цветной матрицы, включая сами флавоноиды.

Несмотря на эти ограничения, совместное использование дериватизации FC и AlCl₃ в HPTLC представляет собой мощную дополняющую стратегию для фенольного анализа. Этот подход сочетает высокую чувствительность реакции FC с структурной дискриминацией, обеспечиваемой комплексированием AlCl₃ и хроматографическим разделением. Кроме того, известно, что несколько флавонолов проявляют характерные желтоватые полосы при ультрафиолетовомосвещении 30, что дополнительно подтверждает классификацию и подтверждение соединений.

Методы микропластин особенно полезны для высокопроизводительного скрининга. Они требуют минимальной подготовки образцов, низкого потребления реагентов и позволяют одновременно анализировать десятки образцов. В типичных лабораторных условиях полный микропластиночный анализ можно провести примерно за 4 часа с использованием широко доступных приборов. Эти характеристики делают микропластиночные анализы очень подходящими для быстрых сравнительных исследований, рутинного контроля качества и предварительной оценки больших наборов выборок. В отличие от этого, HPTLC требует больше времени и труда, с полным аналитическим рабочим процессом, обычно занимающим 7–8 часов. Она также использует специализированные приборы, которые могут быть не во всех лабораториях, а использование специализированных пластин и реагентов для дериватизации увеличивает стоимость анализа. Ещё одним ограничением является то, что метаболиты, присутствующие в очень низких концентрациях, могут оставаться необнаруживаемыми при стандартных условиях визуализации. Однако эти практические и чувствительные ограничения компенсируются ключевым преимуществом хроматографическогоразделения 30,31. HPTLC позволяет определять отдельные компоненты в сложных растительных матрицах, подтверждать подлинные реакции анализов и выявлять потенциально мешающие соединения. Кроме того, селективная постхроматографическая дериватизация позволяет легко классифицировать соединения по функциональным группам (например, флавонолы и 5-гидроксифлавоны), улучшая химическую интерпретацию за пределами оценки общего содержания.

Соответственно, в крупномасштабных исследованиях аналитический процесс может начинаться с микропластиночных тестов для быстрого выявления образцов с повышенным уровнем целевых соединений. Выбранные образцы затем подвергаются анализу HPTLC для визуализации отдельных компонентов, оценки селективности и оценки возможных интерференций с помощью двойной дериватизации. Эта интегрированная стратегия (показана на рисунке 8) сочетает скорость и пропускную способность с химической спецификой и структурным пониманием.

figure-discussion-2
Рисунок 8: Предлагаемый рабочий процесс для отбора и анализа образцов. (A) Высококачественное микропластинное скринингование большой партии образцов. (B) HPTLC-анализ выбранных образцов для количественной оценки методом Фолина–Чиокальтеу и для идентификации флавонов и 5-гидроксифлавонов с помощью дериватизации AlCl₃. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

По сравнению с HPTLC, HPLC в сочетании с высокоразрешающей масс-спектрометрией (HPLC–HRMS) — самой распространённой альтернативой, описанной в литературе — обеспечивает непревзойдённую чувствительность и однозначную структурную идентификацию отдельныхсоединений 32. Тем не менее, анализы HPLC–HRMS по своей природе медленнее, поскольку каждый хроматографический запуск должен выполняться последовательно, и они связаны с значительно более высокими затратами, связанными с инструментами, требованиями к чистоте растворителя и потреблением растворителей. Кроме того, скрининг функционального класса часто требует сложной обработки данных и интерпретации специфичных соединений, тогда как HPTLC позволяет напрямую визуально группировать соединения после дериватизации. Таким образом, HPTLC представляет собой эффективную промежуточную платформу между быстрым скринингом микропластин и комплексным анализом HPLC–MS, балансируя между пропускной способностью, стоимостью и химической селективностью.

Анализ флавоноидов и фенолов имеет широкое применение в пищевой науке, нутрицевтике, фармацевтике, сельском хозяйстве и исследованиях материалов. В пищевой науке он используется для оценки антиоксидантной способности, аутентичности, срока хранения и контроля качества таких продуктов, как соки, вина и чаи, а также для поддержки агрономических исследований, включая определение оптимального времени сбора урожая на основе зрелостифенолов 33. В нутрицевтическом секторе фенольное профилирование крайне важно для стандартизации и обеспечения качества ботанических экстрактов и коммерческих продуктов, таких как капсулы экстракта зелёного чая, добавки с экстрактом виноградных семян, таблетки кверцетина и цитрусовые биофлавоноидные формулы. В фармацевтических и биомедицинских исследованиях эти анализы поддерживают скрининг биоактивных соединений с антиоксидантным, противовоспалительным и антимикробнымпотенциалом 6. В сельском хозяйстве и физиологии растений фенольное определение помогает оценить реакции на стресс растений и определять стратегии улучшения культур. Кроме того, в материаловедении — особенно в исследованиях ингибиторов коррозиирастений 34,35 — характеристика фенолов помогает корреляции химического состава с адсорбционным поведением и защитной эффективностью.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не раскрывают конфликтов интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим вице-ректората по расширению за любезную поддержку в видеозаписи, особенно вице-ректору Иоланде Перес-Каррильо и видеографу Наталии Силва-Маффио. Мы с благодарностью отмечаем «Фонд для поддержки распространения знаний, полученных в UNA» от вице-президента по исследованиям за поддержку расходов на публикацию.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Трубки Эппендорфа объёмом 1,5 млЭппендорф
Колбы объемом 10 млEisco LabsCH0451B10/19 Полипропиленовый пробка, боросиликатное стекло, янтарь — белая отметка, допуск и дополнение; 0,025 ml 
100 & micro; L и 1000 и микро; Кончики L-микропиппеттыродовые
100– 1000 и микро; L микропипеткаЭппендорфResearch Plus
10– 100 & micro; L микропипеткаЭппендорфResearch Plus
Стеклянные трубки с крышкой объемом 15 млродовые
Стаканы объёмом 50 млродовые
8-канальная многоканальная микропиппеттаThermoSciecntific
96-колодцевальные микропластиныГрейнер655891Полициклоолефин, стеклянное дно, чёрный
Аналитический баланс  ± 0,0001 г
Автоматический TLC-сэмплерCAMAGATS4
ЦентрифугаThermoSciecntificSorvall ST8R≥ 850 и раз; g
Фильтрующая бумага УотманДля насыщения камеры
Сублимационная сушилкаLABCONCOМодель 10
Пластиковые реагентные резервуарыЭппендорф
Лопатка с плоским и ложным концомMerck ChemicalsHS15906
Synergy HT Multi-Detection Microplate ReaderBioTek InstrumentsSynergy HT
TLC силикагель 60 пластин F254 с алюминиевой подложкой (10 и более раз; 20 см)Merck
Опрыскиватель TLCСигма-Олдрич20 мл
TLC VisualizerCAMAG2
Ультразвуковая ванна/очистительТворкиZX-040с температурным контролем на 40 и градусах; C
UV LambUPVUVGL-58
Программное обеспечение VisionCATSCAMAG
Пакеты с зип-локомДженерик1/4 четверти галлона

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kang, H. J., Chawla, S. P., Jo, C., Kwon, J. H., Byun, M. W. Studies on the development of functional powder from citrus peel. Bioresour Technol. 97 (4), 614-620 (2006).
  2. Furukawa, Y., et al. Isolation and characterization of neuroprotective components from citrus peel and their application as functional food. Chem Pharm Bull. 69 (1), 2-10 (2021).
  3. Kim, S. S., Lee, J. A., Kim, J. Y., Lee, N. H., Hyun, C. G. Citrus peel wastes as functional materials for cosmeceuticals. J Appl Biol Chem. 51 (1), 7-12 (2008).
  4. Shyu, Y. S., Lu, T. C., Lin, C. C. Functional analysis of unfermented and fermented citrus peels and physical properties of citrus peel-added doughs for bread making. J Food Sci Technol. 51 (12), 3803-3811 (2014).
  5. Hasnat, H., et al. Flavonoids: A treasure house of prospective pharmacological potentials. Heliyon. 10 (6), e27533(2024).
  6. Albuquerque, B. R., Heleno, S. A., Oliveira, M. B. P. P., Barros, L., Ferreira, I. C. F. R. Phenolic compounds: Current industrial applications, limitations and future challenges. Food Funct. 12 (1), 14-29 (2021).
  7. Khoddami, A., Wilkes, M., Roberts, T. Techniques for analysis of plant phenolic compounds. Molecules. 18 (2), 2328-2375 (2013).
  8. Kupina, S., Fields, C., Roman, M. C., Brunelle, S. L. Determination of total phenolic content using the Folin-C assay: Single-laboratory validation, first action 2017.13. J AOAC Int. 102 (1), 320-321 (2019).
  9. Matić, P., Sabljić, M., Jakobek, L. Validation of spectrophotometric methods for the determination of total polyphenol and total flavonoid content. J AOAC Int. 100 (6), 1795-1803 (2017).
  10. Folin, O., Ciocalteu, V. On tyrosine and tryptophane determinations in proteins. J Biol Chem. 73 (2), 627-650 (1927).
  11. Folin, O., Denis, W. On phosphotungstic-phosphomolybdic compounds as color reagents. J Biol Chem. 12 (2), 239-243 (1912).
  12. Lamuela-Raventós, R. M. Folin-Ciocalteu Method for the Measurement of Total Phenolic Content and Antioxidant Capacity. Measurement of Antioxidant Activity & Capacity. , John Wiley & Sons. (2017).
  13. Christ, B., Müller, K. H. Zur serienmäßigen bestimmung des gehaltes an flavonol-derivaten in drogen. Arch Pharm. 293 (12), 1033-1042 (1960).
  14. Carter, J. A., Barros, A. I., Nóbrega, J. A., Donati, G. L. Traditional calibration methods in atomic spectrometry and new calibration strategies for inductively coupled plasma mass spectrometry. Front Chem. 6, 504(2018).
  15. Appel, H. M., Govenor, H. L., D’Ascenzo, M., Siska, E., Schultz, J. C. Limitations of Folin assays of foliar phenolics in ecological studies. J Chem Ecol. 27 (4), 761-778 (2001).
  16. Cubero-Román, E., Carvajal-Miranda, Y., Rodríguez, G., Álvarez-Valverde, V., Jiménez-Bonilla, P. Antioxidant and antimicrobial activity of two Costa Rican cultivars of ber (Ziziphus mauritiana): An underexploited crop in the American tropic. Food Sci Nutr. 11 (6), 3320-3328 (2023).
  17. Shraim, A. M., Ahmed, T. A., Rahman, M. M., Hijji, Y. M. Determination of total flavonoid content by aluminum chloride assay: A critical evaluation. LWT. 150, 111932(2021).
  18. Mammen, D., Daniel, M. A critical evaluation on the reliability of two aluminum chloride chelation methods for quantification of flavonoids. Food Chem. 135 (3), 1365-1368 (2012).
  19. Salih, A. M., et al. Optimization method for phenolic compounds extraction from medicinal plant (Juniperus procera) and phytochemicals screening. Molecules. 26 (24), 7454(2021).
  20. Loescher, C. M., Morton, D. W., Razic, S., Agatonovic-Kustrin, S. High performance thin layer chromatography (HPTLC) and high performance liquid chromatography (HPLC) for the qualitative and quantitative analysis of Calendula officinalis–Advantages and limitations. J Pharm Biomed Anal. 98, 52-59 (2014).
  21. Attimarad, M., Mueen Ahmed, K. K., Aldhubaib, B. E., Harsha, S. High-performance thin layer chromatography: A powerful analytical technique in pharmaceutical drug discovery. Pharm Methods. 2 (2), 71-75 (2011).
  22. Dellapina, G., et al. Flavonoid-rich extracts from lemon and orange by-products: Microencapsulation and application in functional cookies. Foods. 14 (19), 3346(2025).
  23. Sanches, V. L., et al. Comprehensive analysis of phenolics compounds in citrus fruits peels by UPLC-PDA and UPLC-Q/TOF MS using a fused-core column. Food Chem X. 14, 100262(2022).
  24. Kaur, S., Singh, V., Chopra, H. K., Panesar, P. S. Extraction and characterization of phenolic compounds from mandarin peels using conventional and green techniques: A comparative study. Discover Food. 4 (1), 60(2024).
  25. Quispe-Fuentes, I., Uribe, E., López, J., Contreras, D., Poblete, J. A study of dried mandarin (Clementina orogrande) peel applying supercritical carbon dioxide using co-solvent: Influence on oil extraction, phenolic compounds, and antioxidant activity. J Food Process Preserv. 46 (1), e16116(2022).
  26. Tatkare, P. C., Jadhav, A. P. Development and validation of a novel high-performance thin-layer chromatography method for the quantitative estimation of neohesperidin from Citrus aurantium peel extract. JPC J Planar Chromatogr Mod TLC. 35 (6), 579-584 (2022).
  27. Wagner, H., Bladt, S. Plant Drug Analysis. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin. (1996).
  28. Apraj, V., et al. Pharmacognostic and phytochemical evaluation of Citrus aurantifolia (Christm) Swingle peel. Pharmacogn J. 3 (26), 70-76 (2011).
  29. Bastola, K. P., Guragain, Y. N., Bhadriraju, V., Vadlani, P. V. Evaluation of standards and interfering compounds in the determination of phenolics by Folin-Ciocalteu assay method for effective bioprocessing of biomass. Am J Anal Chem. 8 (6), 416-431 (2017).
  30. Sultana, S., et al. Investigating flavonoids by HPTLC analysis using aluminium chloride as derivatization reagent. Molecules. 29 (21), 5161(2024).
  31. Pawar, K. N., Kadam, S. P., Redasani, V. K. A systematic review on high performance thin layer chromatography (HPTLC). Int J Pharm Res Appl. 10 (3), 402-416 (2025).
  32. Saftić Martinović, L., Barbarić, L., Gobin, I. Qualitative and quantitative mass spectrometry approaches for the analysis of phenolic compounds in complex natural matrices. Appl Sci. 15 (23), 12529(2025).
  33. de Araújo, F. F., de Paulo Farias, D., Neri-Numa, I. A., Pastore, G. M. Polyphenols and their applications: An approach in food chemistry and innovation potential. Food Chem. 338, 127535(2021).
  34. Castro-Castro, V., Jiménez-Bonilla, P., Álvarez-Valverde, V., Rodríguez-Yáñez, J. Pichichio extracts (Solanum mammosum) as a corrosion inhibitor of low carbon steel in an acidic environment. Pure Appl Chem. 98 (2), 283-300 (2026).
  35. Evaluation of natural products as corrosion inhibitors: Pinus caribaea and Pachira quinata bark extracts on steel. Villalobos-Ugalde, A., Piedra-Marín, G., Rodríguez-Yañez, J., Álvarez-Valverde, V., Jiménez-Bonilla, P., Soto-Fallas, R. M. 6th IEEE International Conference on BioInspired Processing (BIP 2024), , (1109).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Total Phenolic ContentTotal FlavonolsMicroplate AssaysHPTLC AnalysisPhenolic ProfilingFlavonoid DeterminationFolin Ciocalteu AssayAluminum Chloride AssayPhytochemical Characterization
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи