Методическая статья

Фенотипическое профилирование поведенческих фенотипов, вызванных МПТП, похожих на паркинсонианский синдром, у личинок данио-рерио, на основе поведенческого эксперимента

DOI:

10.3791/70041

⸱

15 мая 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry, State Key Laboratory of Discovery and Utilization of Functional Components in Traditional Chinese Medicine, Key Laboratory of Chemical Biology (Ministry of Education), NMPA Key Laboratory for Technology Research and Evaluation of Drug Products, School of Pharmaceutical Sciences, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 2College of Information Engineering, Ningde Normal University, 3Digital Fujian Research Institute of Big Data for Elderly Rehabilitation and Nursing, 4Department of Neurology, Qilu Hospital Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 5Key Laboratory of Bioactive Materials, Ministry of Education, Nankai University, 6Jinan Microecological Biomedicine Shandong Laboratory

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол устанавливает поведенческую парадигму фенотипирования личинок данио-рерио, леченных MPTP, для оценки моторных и немоторных дефицитов, похожих на болезнь Паркинсона.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье представлен уникальный мультипараметрический протокол поведенческого фенотипирования для болезни Паркинсона, индуцированной МПТФ, у личинок данио-рерио. Химическая индукция патологии, похожей на ПП, у данио-религии обеспечивает высокопроизводительную и генетически управляемую систему, однако большинство исследований ограничиваются базовыми локомоторными анализами или простыми переходами между светом и темнотой. Такие ограниченные подходы не охватывают более широкий спектр дисфункций, связанных с БП, — от брадикинезии и сенсомоторных дефицитов до тревожных поведений и нарушений сна. Для устранения этого пробела в исследовании была разработана интегрированная система из 6 дополнительных тестов: локомоторный тест для оценки общего двигательного и исследовательского движения; оценка тигмотаксиса для выявления поведения, связанных с тревожностью, склонных к предпочтениям по краям; тест на испуг, фиксирующий брадикинезию и снижение моторной реактивности; Тесты на испытаниях светло-тёмных для оценки рискованности и чувствительности к стрессу; парадигмы фотомоторного ответа (включая стимуляцию стробоскопического света) для количественной оценки сенсомоторных и рефлекторных движений; а также мониторинг регуляции сна и бодрствования для измерения поведения во сне и бодрствовании. Личинки данио-рерио подвергаются сублетальному воздействию концентраций MPTP с 1 дня после оплодотворения (dpf) до 5 dpf, при этом оцениваются поведенческие оценки от 4 до 6 dpf. Автоматизированное отслеживание высокого разрешения генерирует несколько поведенческих конечных точек на анализ. Этот подход выявляет ранее не обнаруженные изменения, похожие на ПП, такие как неорганизованная архитектура сна, нарушенное обучение привычке, сенсомоторные и рефлекторные движения, отражающие ранние немоторные симптомы. Объединяя эти анализы, исследователи получают комплексный поведенческий симптом, который более близко отражает сложность человеческой БП. Этот протокол расширяет парадигму изучения патогенеза БП, скрининга кандидатов на терапии и изучения модуляторов окружающей среды. Она воплощает цель коллекции — представлять инновационные модели животных, повышающие трансляционную значимость благодаря надёжной, многогранной фенотипизации.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Болезнь Паркинсона (БП) — второе по распространённости нейродегенеративное заболевание после болезниАльцгеймера 1. Распространённость и число заболевших неуклонно увеличиваются в последние годы, создавая серьёзную проблему для общественного здравоохраненияво всём мире 2. Частота заболеваемости БР заметно увеличивается свозрастом 3,4 года. Клинически БП проявляется как через моторные симптомы — такие как дискинезия, брадикинезия, тремор в состоянии покоя и нестабильность осанки, — так и через различные немоторные симптомы, включая когнитивные нарушения, тревожность и нарушениясна 5. В настоящее время диагноз БП в первую очередь зависит от наличия моторныхсимптомов 6; Однако к моменту проявления этих симптомов более 60% дофаминовых нейронов черной субстанции ужепотеряны 7. Хотя немоторные симптомы часто проявляются раньше, отсутствие конкретных и объективных критериев оценки усложняет раннюю диагностику ивмешательство 8. В настоящее время основным лечением БП является введениелеводопы-9, которая преобразуется в дофамин в мозге, тем самым восполняя уровень дофамина в стриатуме. Хотя это лечение временно облегчает симптомы, оно не останавливает прогрессированиеболезни 10. Следовательно, дальнейшие исследования патогенеза БП и скрининга лекарств крайне важны.

Создание подходящих животных моделей крайне важно для исследований патогенеза БП и скрининга на лекарства на РПП. Сейчас существует три основные модели для исследований ПД: модель химической индукции11, модель редактированиягенов 12 и модель ксенотрансплантации человека13. К наиболее часто используемым моделям относятся грызуны, такие какмыши 14, и нечеловеческие приматы, напримеробезьяны 15. В последнее время данио-рерио (Danio rerio) привлекает всё больше внимания в исследованиях ПД благодаря своим преимуществам, таким как малый размер, быстрый рост, высокая генетическая гомология с человеком и прозрачныеэмбрионы 16. Использование нейротоксина MPTP (1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин) для индуцирования повреждения дофаминовыхнейронов 17,18 является классическим методом построения модели ХП. Данио-рерио, подвергшиеся сублетальной концентрации MPTP, проявляют различные поведенческие фенотипы, похожие наPD. 19.

Однако большинство исследований БП у данио-рерио-рерио-рериота в основном сосредоточены на базовых локомоторных поведениях или простых переходах между светло-тёмными16,20, и одномерные поведенческие анализы сложно полностью отразить сложные поведенческие характеристики БП, особенно поведенческие изменения в немоторных функциях. Учитывая, что ПП — это заболевание, затрагивающее несколько нейроповеденческих систем, выходящих за рамки моторногоконтроля 21,22,23, срочно необходим мультипараметрический метод оценки поведенческого фенотипа для выявления его многосистемных фенотипов 24.

Соответственно, это исследование разрабатывает многофункциональный и быстрый протокол поведенческого фенотипирования для более полного описания поведенческих фенотипов у личинок данио-рерио, обработанного с помощью MPTP. Сублетальная доза MPTP (50 мкм)25 была введена личинкам с 1 до 5 дней после оплодотворения (dpf)16,20,26. С 4 по 6 dpf 16,20,24 мы провели 6 поведенческих тестов: мониторинг регуляции сна и бодрствования, парадигмы фотомоторного ответа, оценка тигмотаксиса, локомоторная оценка, тест на испуг, а также тесты на светло-тёмные испытания. Эти поведенческие оценки охватывают как моторные, так и немоторные аспекты, такие как нарушения движений, сенсомоторные нарушения, обучение по привычке, риск, чувствительность к стрессу и ритм сна-бодрствования.

Используя высокопроизводительную систему видеоотслеживания Zebrabox и метод количественного анализа, мы извлекли и количественно оценили различные поведенческие параметры и сравнили поведенческие различия между группой, обработанной MPTP, и группой дикого типа (WT) по статистике. По сравнению с существующими тестами PD данио-рерио, эта мультипараметрическая поведенческая батарея фиксирует моторные и немоторные фенотипы в рамках стандартизированной системы. Автоматизированная система отслеживания обеспечивает объективный сбор поведенческих данных и высокую воспроизводимость. Кроме того, небольшой размер тела личинок позволяет помещать отдельных животных в многоколодные пластины, что обеспечивает высокопроизводительную оценку. Вышеуказанные преимущества полезны для глубокого анализа патологического механизма БП, скрининга кандидатов на препараты или соединения, а также изучения влияния факторов окружающей среды на возникновение или развитие БП.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование с участием данио-рериота было проведено в соответствии с институциональными рекомендациями по уходу и использованию животных и было одобрено Этическим комитетом Школы фармацевтических наук Шаньдунского университета (No YXDW2025-0056). Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка к MPTP

  1. Приготовьте 1× среду E3, разбавляя 100× E3 стандартный раствор 1:100 сверхчистой водой (например, смешайте 5 мл 100× E3 с 495 мл сверхчистой воды, чтобы получить 500 мл среды 1× E3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте E3 medium свежим в день использования.
  2. Приготовьте раствор MPTP объемом 1 мм, добавив 5,0 мг порошка MPTP в трубку центрифугы на 50 мл и добавив среду E3 к конечному объёму 25 мл (используйте трубку для смешивания, но центрифугирование не требуется). Маркируйте раствор как 1 мМ MPTP-раствор. Храните бульонный раствор в темноте.
  3. Подготовка раствора MPTP объемом 50 мкм: переливать 2,5 мл раствора MPTP объемом 1 мм в чистый контейнер и разбавлять 47,5 мл среды E3 для получения конечного объёма 50 мл при конечной концентрации 50 мкм MPTP. Оставшаяся часть раствора продолжала храниться в темноте.
    ВНИМАНИЕ: MPTP — мощный нейротоксин, и с ним следует обращаться с крайней осторожностью. Всегда носите соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), включая перчатки, лабораторный халат и защитные очки. Утилизация отходов MPTP в соответствии с институциональными рекомендациями по биобезопасности.

2. Подготовка и группировка эмбрионов данио-рерио.

  1. Отбирайте взрослых самцов и самок данио-рерио, проводите контролируемое размножение с использованием резервуаров с съёмными разделителями. В 20:00 поместите самца и самку данио-рерио-рыб отдельно в размножающиеся аквариумы в соотношении 2:3 и разделите их разделителями.
  2. На следующий день уберите перегородки в 8:00 утра, чтобы начать спаривание, тем самым инициируя нерест. Собрать эмбрионы через 1 час и трижды промой их чистой системной водой.
  3. Помещают эмбрионы в чашки Петри диаметром 100 мм с свежим средом E3 и инкубируют их при 28 °C в цикле света 14 часов / 10 часов тёмной температуры (свет включён с 08:00 до 22:00).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте 50 эмбрионов на блюдо с объёмом 20 мл для нормального развития.
  4. При 1 dpf аккуратно удалять неоплодотворённые, деформированные и аномальные эмбрионы с помощью пипетты Пастера и заменять раствор с эмбрионами данио-рерио. Для группы WT замените существующую среду на свежую эмбриональную среду E3. Для группы, обработанной MPTP, замените среду раствором 50 мкм MPTP (рисунок 1A), затем вернуте обе группы в инкубатор.
  5. Для обеих групп заменяйте раствор и удаляйте мёртвые или нездоровые эмбрионы каждые 24 часа. Для группы, обработанной MPTP, заменять раствор MPTP ежедневно с утра 1 dpf до утра 4 dpf (рисунок 1A). Затем с утра 5 dpf до конца эксперимента переведите группу, обработанную MPTP, на среду E3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: аккуратно замените раствор пипеттой Pasteur. Медленно аспирируйте среду от края чашки Петри и добавляйте свежий раствор вдоль стенки чашки Петри, чтобы минимизировать беспокойство эмбрионов.

3. Сон — мониторинг регуляции бодрствования

  1. При 4 dpf выберите личинки данио-рерио-рыб из каждой группы в 18:00 и переместите их на пластину на 96 лунок с использованием модифицированного 3-мл Pasteur Pipette с отрезанным кончиком — по одной личинке на колодец (рисунок 1B). Первые четыре строки представляют группы WT, а последние четыре — MPTP-группы (в каждой группе 48 данио-рерио).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать стимуляции или повреждения данио-рерио, модифицируйте пипетки Пастера, обрезав кончик (10 мм) так, чтобы получить широкий отверстие, превышающий размер 4 dpf личинок данио-рерио (длина тела превышает3,7 мм 27,28).
  2. Осмотрите каждую колодцу под стереомикроскопом, чтобы убедиться, что внешний вид каждого личинки данио-рерио-рыбки здоров, плавники раскрыты и равномерно раскачиваются, тело стоит вертикально, а плавательный пузырь надутна 29. Убедившись, что данио в каждом колодце в состоянии здоровья, наполните каждую колодцу средним содержанием E3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Заполните каждую скважину средним или почти выпуклым уровнем E3, чтобы сохранить поверхностное натяжение. Аккуратно добавляйте жидкость, чтобы предотвратить пузырьки и переполнение скважины.
  3. После перемещения рыбы и жидкости в пластину с 96 лунками поместите её в камеру Zebrabox для акклиматизации на 30 минут до теста на поведение во сне и бодрствовании.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед установкой пластины на 96 лунок в камеру Zebrabox аккуратно очистите дно пластины, чтобы грязь не повлияла на результаты видеозаписи.
  4. Откройте программное обеспечение для видеоотслеживания Zebralab, выберите режим квантования и убедитесь, что пластина с 96 лунками расположена по центру внизу камеры Zebrabox.
  5. Настройте регулировку света так, чтобы выключать свет в 22:00 и включать свет в 8:00 утра, что соответствует условиям освещения при выращивании данио-рерио. Днём уровень белого света обычно составляет около 1000 люкс. Установите параметры программного обеспечения следующимобразом: 29: порог обнаружения — 40; вспышка — 25 (порог при движении); заморозка (порог при движении), 4; размер контейнера — 60 с; общее время мониторинга — 52 часа (с 20:00 в первый день до 00:00 вечера на третий день). Начните процедуру сна и пробуждения в 20:00.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После начала процедуры запретите любые звуки и вибрации снаружи на протяжении всего эксперимента, чтобы не нарушать нормальный ритм сна и бодрствования данио-рерио. Чтобы предотвратить испарение воды во время длительного мониторинга, накройте пластину с 96 скважинами прозрачной пластиковой пленкой.
  6. Через 52 часа остановить эксперимент со сном и бодрствованием и сохранить файл данных. Снимите пластину на 96 лунок из ZebraBox.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью MATLAB и Excel установлены необходимые параметры, такие как количество периодов сна (период сна определяется как периоды бездействия не менее 1 минуты), средняя продолжительность сна (средняя продолжительность периодов сна), общая продолжительность сна (все периоды сна за период мониторинга), латентность сна (время от лёгкого перехода до начала первого периода) Средняя активность (определяемая как двигательная активность в течение всего периода мониторинга) и активность бодрствования (определяемая только в период бодрствования, исключая периоды сна) были извлечены и проанализированы из файла данных.
    1. Используйте t-тест студента, чтобы сравнить различия между группой WT и группой, обработанной MPTP. Кроме того, с помощью программного обеспечения MATLAB нанесите графики кривой сна, активности в бодрствовании и средней активности данио-рерио.

4. Парадигмы фотомоторного отклика

ПРИМЕЧАНИЕ: Парадигмы фотомоторной реакции (включая стробоскоп) — это тестовые поведенческие тесты с высокой пропускной способностью у личинок 5 dpf, направленные на количественную оценку сенсомоторных и рефлекторных локомоторных изменений в ответ на внезапный переход света. Этот тест проводился с использованием пластины с 96 лунками, включающей 2 парадигмы: (1) световой переход от 1 минуты темноты к 1 минуте постоянного освещения (1000 lx), и (2) стробоскопический отклик, включающий переход от 1 минуты темноты к 1 минуте мерцающего света при 10 Гц.

  1. Поместите личинки с 5 dpf в пластину на 96 лунок (по 1 личинке на колодцу) (рисунок 1B) и заполните каждую колодцу средой E3. В среднем разделите в общей сложности 96 личинок на группу WT и MPTP.
  2. Парадигма тёмно-постоянного света:
    1. Поместите пластину на 96 лунок с личинками 5 dpf в Zebrabox и дайте личинкам акклиматизироваться 5 минут в темноте перед анализом.
    2. Откройте режим анализа Tracking-online.
    3. Настройте программу перехода света следующим образом: 0-60 с: Темно, 60-120 с: Постоянный свет (1000 лх).
    4. Запустите протокол, собирайте соответствующие параметры движения каждые 6 секунд на протяжении 120-секундного анализа.
    5. Остановите протокол на120-й секунде, экспортируйте файл данных. Поместите личинок в полную темноту на 5 минут, чтобы привыкнуть к окружающей среде, подготовив их к следующему анализу тёмно-стробоскопического света.
  3. Парадигма тёмного стробоскопического света:
    1. Настройте программу перехода на свет следующим образом: 0-60 с: темнота, 60-120 с: стробоскоп (1000 лх) при 10 Гц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: стробоскоп с частотой 10 Гц соответствует 10 световым импульсам в секунду. В ZebraLab реализуйте это, чередуя интенсивность света от 0 до 1000 lx каждые 100 мс.
    2. После завершения 5-минутной тёмной адаптации начинайте анализ от темноты к стробоскопическому свету. Собирайте параметры движения каждые 6 секунд на протяжении 120-секундного анализа.
  4. Анализ данных: после завершения анализа экспортируйте файл данных. Используйте программное обеспечение MATLAB, чтобы вычислять дистанцию плавания каждые 6 секунд. Постройте график общего расстояния (среднего значения за 6 секунд), проплывшей за 2-минутный период для обоих анализов. Вычислите индекс замерзания, вычитая общее расстояние, пройденное за 1 минуту в темноте, от общего расстояния, пройденного присветлом 30.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Индекс заморозки < 0 указывает на поведение заморозки; Индекс заморозки > 0 указывает на выход; Индекс замерзания = 0 означает отсутствие реакции. Используйте t-тест студента и двусторонний ANOVA для сравнения различий между группой WT и группой, обработанной MPTP. Всего для каждой группы использовалось 48 личинок данио-рерио (n = 48).

5. Оценка тигмотаксиса

  1. Выберите две пластины по 6 колодц, заполните каждую скважину средним слоем E3 по 4 мл.
  2. При 5 dpf были собраны личинки данио-рерио-рерио, из группы WT и группы, обработанной MPTP, и помещены в две пластины по 6 лунок (одна — группа WT, другая — группа, обработанная MPTP, по 1 личинке на скважину) (рисунок 1C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что исходное положение личинок находится в центре колодцев.
  3. Перед оценкой тигмотаксиса пластины скважины должны быть размещены в правильном положении Zebrabox за 15 минут до установки.
  4. Сбор и анализ данных: Используя функцию площади прорисовки , нарисуйте два концентрических круга в зоне наблюдения каждой скважины (радиус центральной окружности составляет 1/2 радиуса скважины) (рисунок 1C), а оставшиеся параметры будут совпадать с оценкой локомотивов. Запустите протокол оценки тигмотаксиса продолжительностью 5 минут и проведите параллельный эксперимент.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения программы программное обеспечение Zebralab будет генерировать траекторию личинок данио-рерио-рыбы в течение 5 минут и различные связанные параметры движения. В файле данных an1 представляет всю площадь каждой скважины, а an2 — внутреннюю зону каждой скважины. Таким образом, total dis(an1) и total dur(an1) обозначают общее расстояние плавания и время, проведённое во всей скважине, а total dis(an2) и total dur(an2) — расстояние и время, проведённое во внутренней зоне, соответственно.
    1. Вычислим тигмотаксис по следующим формулам:
      Вычислите процент проплывшей дистанции во внешней зоне:
      figure-protocol-1
      Вычислите процент времени, проведённого во внешней зоне:
      figure-protocol-2
    2. Используйте t-тест студента для сравнения различий в тигмотаксисе между группой WT и группой, обработанной MPTP. Всего для каждой группы использовалось 24 личинки данио-рерио (n = 24).

6. Оценка двигателей

  1. При 5 dpf выбранные личинки данио-рерио-рероа из группы WT и группы, обработанной MPTP, соответственно перенесены в две пластины с 12 лунками (одна — группа WT, другая — группа, обработанная MPTP, 1 личинка на скважину, с 2 мл среды E3) (рисунок 1D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что размеры личинок данио-рероа схожи, а отобранные личинки должны иметь открытые плавники, вертикальную осанку, хорошее расширение плавательного пузыря и регулярные движения.
  2. Перед осмотром локомотива поставьте пластину скважины в тестовое положение Zebrabox за 15 минут до адаптации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что условия освещения во время адаптации соответствуют условиям освещения во время теста.
  3. После 15-минутного периода акклиматизации выберите режим отслеживания — онлайн-анализ, записывайте двигательную активность каждой личинки в течение 5 минут с помощью автоматизированной системы видеоотслеживания. Использование программного обеспечения Zebralab собирает треки движения и различные связанные параметры локомотивов каждые 60 секунд, экспорт полного файла данных и анализ общего расстояния и средней скорости каждой личинки за 5 минут с помощью MATLAB.
    1. Используйте t-тест студента и двусторонний ANOVA для сравнения различий между группой WT и группой, обработанной MPTP. Всего для каждой группы использовалось 24 личинки данио-рерио (n = 24).

7. Тест на испугающую реакцию

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот тест измеряет зрительную реакцию на испугание (VSR), также известную как испуга, вызванная темной вспышкой, вызванная внезапными переходами в темноту. Этот тест на испуг оценивает визуальный испуг, вызванный внезапными тёмными вспышками в миллисекундном масштабе. В отличие от парадигмы тёмного стробоскопического света, которая включает повторяющиеся световые импульсы для оценки устойчивых поведенческих реакций, этот анализ сосредоточен на быстрых рефлекторных моторных реакциях на острый визуальный стимул.

  1. Приготовления: при 5 dpf выбрать личинок данио-рерио-рерио-рероа из группы WT и группы, обработанной MPTP, и перенести их соответственно на две пластины с 12 лунками (одна — группа WT, другая — группа, обработанная MPTP, по 1 личинке на яму, с 2 мл среды E3) (рисунок 1D).
  2. Перед тестом на реакцию на старт поставьте пластину скверна в тестовое положение Zebrabox за 5 минут до адаптации.
  3. Задайте параметры стимуляции: откройте программное обеспечение Zebralab , запустите режим анализа Tracking-online , откройте интерфейс Light-triggering , выберите Используйте один из трёх триггерных методов ниже, включите Enhanced Stimuli, установите на Когда сессия запущена; В расписании переходов ритм тёмной вспышки определяется следующим образом (программа начинает срабатывать через 21 с): Переход 1: 5 мс, 100% интенсивность света; переход 2: 2890 мс, 100% интенсивность света; переход 3: 5 мс, 0% интенсивности света; переход 4: 100 мс, 0% интенсивности света; галочка Повторить список переходов для обеспечения периодического мигания.
  4. Запуск протокола: убедитесь, что функция видеозаписи Numeriscope включена, высокопроизводительное автоматическое отслеживание сгенерирует многомерный набор данных, включающий 30 поведенческих конечных точек в этом тесте 90-х годов.
  5. Анализ данных: После завершения теста на отклик на испугающий экспорт необработанных файлов и импорт их в программное обеспечение MATLAB для анализа. Рассчитайте расстояние плавания каждой личинки с интервалом в 3 с вместе со средней скоростью плавания.
    1. Определите пиковое расстояние движения, пиковую скорость или задержку реакции после вспышки для каждой группы. Используйте t-тест студента и двусторонний ANOVA для сравнения различий между группой WT и группой, обработанной MPTP. Всего для каждой группы использовалось 24 личинки данио-рерио (n = 24).

8. Тест на выбросы светло-тёмных

  1. При 5 dpf переместите личинки данио-рерио-рыбы по отдельности в две пластины по 24 лунки (рисунок 1E), при этом по одной личинке на колодец и 1 мл среды E3 на колодец. Каждая пластина содержала 24 личинки, и две пластины с 24 лунками были равномерно разделены на группу WT и группу, обработанную MPTP (n = 24 на группу).
  2. Перед тестированием поместите 24-колодную пластину в специально отведённую зону внутри Zebrabox для 5-минутного периода лёгкой акклиматизации, чтобы адаптировать условия тестирования. Активируйте режим онлайн-анализа отслеживания. Настройте программу освещения следующим образом: 6 минут постоянного освещения, затем 4 минуты полной темноты (рисунок 1E). Общее время тестирования составляет 10 минут, а интервал сбора данных — 60 секунд.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Глобальные 6 минут света предназначены для акклиматизации и привыкания, обеспечивая стабильную исходную локомоторную и специальные светло-тёмныереакции 31,32.
  3. На10-й минуте прекратите запись поведения и сохраните данные. Аккуратно снимите пластину из Zebrabox.
  4. Для каждой личинки извлекайте дистанцию плавания с интервалом в 60 секунд. Рассчитайте расстояние, пройденное за светлую фазу (0–6 минут), тёмную фазу (7–10минут) и общий период в 10 минут. Количественно оцените поведение тигмотаксиса и способность к обучению по привычке в тёмной фазе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Привыкающее обучение определяется как уменьшение поведенческой реакции при воздействии постоянного стимула или окружающей среды33,34, и оценивалось статистически сравнением среднего общего расстояния (мм) за 1 минуту и 4 минуты после перехода от света к темноте. Используйте t-тест студента и двусторонний ANOVA для сравнения различий между группой WT и группой, обработанной MPTP. Всего для каждой группы использовалось 24 личинки данио-рерио (n = 24).

9. Утилизация отходов MPTP

ПРИМЕЧАНИЕ: После каждого поведенческого эксперимента распыляйте и протирайте поверхности, контактирующие с MPTP (например, лабораторные столы и ZebraBox) свежеприготовленным гипохлоритом натрия (отбеливатель; ≥10% v/v).

  1. Собирайте жидкие отходы (включая оставшиеся растворы для экспозиции и промывающие материалы) и твердые отходы (например, пипетки Пастера, перчатки, чашки Петри и многоколодцевые пластины) MPTP. Чётко обозначает их как опасные нейротоксичные отходы.
  2. Обрабатывайте загрязнённые жидкие отходы и твёрдые материалы свежеприготовленным гипохлоритом натрия (отбеливателем; ≥10% В/В) не менее 24 часов для обеспечения дезактивации, а затем утилизацию в соответствии с институциональными нормативами.
  3. Усыпить личинок данио, обработанных MPTP, погружая их в разбавленный раствор гипохлорита натрия (например, в соотношении 1:5 6% отбеливателя: воды) в течение 5минут 35 минут. Смерть подтверждена из-за отсутствия движения и сердцебиения. Рассматривать деконтаминированные личинки и среду как опасные биологические отходы для институциональной утилизации (согласно утверждённым институциональными протоколами).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мониторинг регуляции сна и бодрствования
Мониторинг регуляции сна и бодрствования продолжительностью 52 часа начался при 4 dpf и проводился с использованием пластины с 96 лунками. Данио-рерио, проходившие с MPTP, демонстрировали значительные нарушения структуры сна по сравнению с группой WT. На рисунке 2 показаны репрезентативные кривые сна, графики активности бодрствования и усреднённые следы активности. Параметры анализа регуляции сна и...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании был разработан и подтвержден комплексный протокол оценки и анализа поведенческого фенотипа, вызванного МПТП, подобного ППП. Этот протокол включал 6 различных тестов: локомоторную оценку, тест на тигмотаксис, тест на испуг, парадигмы фотомоторного ответа (включая стимуляцию стробоскопического света), тест на светло-тёмные испытания и мониторинг регуляции сна и бодрствования, чтобы оценить и показать моторные и немоторные дефекты БП. Результаты показали, что по сравнени...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о конфликтах интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (No 21906095), спонсорством программы будущего молодых учёных Шаньдунского университета, Фондом естественных наук Шаньдуна (No ZR2019BB018), Фундаментальные исследовательские фонды Шаньдунского университета (No 2017GN0030), Китайский фонд постдокторских наук (No 2018M640640). Фонд также поддерживается Фондом открытых исследований 2025 года от Института больших данных Цифрового Фуцзянь для реабилитации и сестринского дела пожилых людей (Грант No BDRI202502) и Открытый исследовательский фонд 2025 года от Ключевой лаборатории биоактивных материалов Министерства образования Университета Нанькай (Грант No SWHX-202503). Исследовательский проект Лаборатории микроэкологической биомедицины Цзинань в Шаньдуне (грант No JNL-2023002KF). Авторы выражают благодарность Центру лабораторных животных, больницы Цилу Шаньдунского университета и доктора Сунь Чэнси из кафедры клинической лаборатории больницы Цилу Шаньдунского университета за помощь в проведении эксперимента.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
100 и больше раз; Стандартное решение E3Shanghai Feixi BiotechnologyН/Дсодержит 34,8 г NaCl, 1,6 г KCl, 5,8 г CaCl2 и middot; 2H2O и 9,78 г MgCl2· 6H2O на литр
12-колодная клеточная культивная пластинаNEST Биотехнология712011Необработанные, непирогенные, стерильные, полистиролные. Применяются для поведенческих анализов личинок данио-рерио.
24-колодцавая клеточная культивационная пластинаNEST Биотехнология702011Необработанные, непирогенные, стерильные, полистиролные. Применяются для поведенческих анализов личинок данио-рерио.
3 мл Пастер ПипеттBiologix30-0238A1
6-ячественная клеточная культивная пластинаNEST Биотехнология703011Необработанные, непирогенные, стерильные, полистиролные. Применяются для поведенческих анализов личинок данио-рерио.
96-колодцовая клеточная культурная пластинаNEST Биотехнология701011Необработанные, непирогенные, стерильные, полистиролные. Применяются для поведенческих анализов личинок данио-рерио.
MATLAB R2020aMathWorks, США Н/ДMATLAB R2020a, общекампусная лицензия, полученная на программном портале Шаньдунского университета (softms.sdu.edu.cn). Используется для статистического анализа поведенческих данных личинок данио.
Microsoft ExcelMicrosoftН/ДMicrosoft Excel (часть Microsoft Office), версия установлена через лицензированный программный портал Шаньдунского университета (softms.sdu.edu.cn).
MPTP(1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин) Beyotime411252815 мг
Чашка ПетриNEST Биотехнология704202100 мм, стерильная, с лёгкой рукояткой, TC-обработанная
Раствор гипохлорита натрияМаклинS817439Стандартный раствор бытового отбеливателя (6-14% активного хлора), разбавленный до ≥ 10% V/V для дезактивации поверхностей и отходов; Также разбавлены в масштабе 1:5 (6% отбеливателя: вода) для эвтаназии личинок данио-рерио, обработанных MPTP.
СтереомикроскопОлимпСерия SZX2
Zebrabox — система видеоотслеживания высокого разрешения, nbsp;Viewpoint, Франция  Н/Д
Zebralab Software Viewpoint, Франция  Н/ДВерсия (3,52,3,87)

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Elbaz, A., Carcaillon, L., Kab, S., Moisan, F. Epidemiology of Parkinson's disease. Rev. Neurol. (Paris). 172 (1), 14-26 (2016).
  2. Elgueta, D., et al. Analyzing the Parkinson's disease mouse model induced by adeno-associated viral vectors encoding human alpha-synuclein. J Vis Exp. (185), e63313(2022).
  3. Peng, S. Y., Liu, P., Wang, X. W., Li, K. Y. Global, regional and national burden of Parkinson's disease in people over 55 years of age: a systematic analysis of the global burden of disease study, 1991-2021. BMC Neurol. 25, 178(2025).
  4. Zhu, J. Q., et al. Temporal trends in the prevalence of Parkinson's disease from 1980 to 2023: a systematic review and meta-analysis. Lancet Healthy Longev. 5 (7), 464-479 (2024).
  5. Goldman, J. G. Non-motor symptoms and treatments in Parkinson's disease. Neurol Clin. 43 (2), 291-317 (2025).
  6. Kobylecki, C. Update on the diagnosis and management of Parkinson's disease. Clin Med. (Lond). 20 (4), 393-398 (2020).
  7. Zhou, J., Li, J., Papaneri, A. B., Kobzar, N. P., Cui, G. Dopamine neuron challenge test for early detection of Parkinson's disease. NPJ Parkinsons Dis. 7, 116(2021).
  8. Tolosa, E., Garrido, A., Scholz, S. W., Poewe, W. Challenges in the diagnosis of Parkinson's disease. Lancet Neurol. 20 (5), 385-397 (2021).
  9. Salat, D., Tolosa, E. Levodopa in the treatment of Parkinson's disease: Current status and new developments. J. Parkinsons Dis. 3 (3), 255-269 (2013).
  10. Kalia, L. V., et al. Disease-modifying therapies for Parkinson's disease: Lessons from multiple sclerosis. Nat Rev Neurol. 20 (12), 724-737 (2024).
  11. Thirugnanam, T., Santhakumar, K. Chemically induced models of Parkinson's disease. Comp. Biochem. Physiol C Toxicol Pharmacol. 252, 109213(2022).
  12. Crabtree, D. M., Zhang, J. H. Genetically engineered mouse models of Parkinson's disease. Brain Res. Bull. 88 (1), 13-32 (2012).
  13. Hallett, P. J., et al. Successful function of autologous iPSC-derived dopamine neurons following transplantation in a non-human primate model of Parkinson's disease. Cell Stem Cell. 16 (3), 269-274 (2015).
  14. Dovonou, A., et al. Animal models of Parkinson's disease: bridging the gap between disease hallmarks and research questions. Transl. Neurodegener. 12, 36(2023).
  15. Potts, L. F., et al. Modeling Parkinson's disease in monkeys for translational studies: A critical analysis. Exp. Neurol. 256, 133-143 (2014).
  16. Doyle, J. M., Croll, R. P. A critical review of zebrafish models of Parkinson's disease. Front. Pharmacol. 13, 835827(2022).
  17. Bagwell, E., Larsen, J. A. A review of MPTP-induced Parkinsonism in adult zebrafish to explore pharmacological interventions for human Parkinson's disease. Front. Neurosci. 18, 1451845(2024).
  18. Feng, X. -Z., et al. Behavioral assessments of spontaneous locomotion in a murine MPTP-induced Parkinson's disease model. J Vis Exp. 143, e58653(2019).
  19. Razali, K., Kumar, J., Mohamed, W. M. Y. Characterizing the adult zebrafish model of Parkinson's disease: a systematic review of dynamic changes in behavior and physiology post-MPTP administration. Front. Neurosci. 18, 1432102(2024).
  20. Brinez-Gallego, P., et al. Experimental models of chemically induced Parkinson's disease in zebrafish at the embryonic larval stage: A systematic review. J Toxicol Environ Health B Crit Rev. 26 (4), 201-237 (2023).
  21. Xu, Z. H., et al. Deep clinical phenotyping of Parkinson's disease: Towards a new era of research and clinical care. Phenomics. 2 (5), 349-361 (2022).
  22. Tinaz, S. Functional connectome in Parkinson's disease and Parkinsonism. Curr Neurol Neurosci Rep. 21, 24(2021).
  23. Costa, H. N., et al. Parkinson's disease: A multisystem disorder. Neurosci Bull. 39 (1), 113-124 (2023).
  24. Christensen, C., Thorsteinsson, H., Maier, V. H., Karlsson, K. Æ Multi-parameter behavioral phenotyping of the MPP⁺ model of Parkinson's disease in zebrafish. Front Behav Neurosci. 14, 623924(2020).
  25. Zhang, S., et al. Anti-Parkinson's disease activity of phenolic acids from Eucommia ulmoides Oliver leaf extracts and their autophagy activation mechanism. Food Funct. 11 (2), 1425-1440 (2020).
  26. Maleski, A. L. A., et al. Integrated behavioral and proteomic characterization of MPP⁺-induced early neurodegeneration and Parkinsonism in zebrafish larvae. Int J Mol Sci. 26 (14), 6762(2025).
  27. Vauti, F., et al. All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish. PLoS One. 15 (8), e0237167(2020).
  28. Parichy, D. M., et al. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  29. Lee, D. A., Oikonomou, G., Prober, D. A. Large-scale analysis of sleep in zebrafish. Bio Protoc. 12 (3), e4313(2022).
  30. Shen, Q., et al. Rapid well-plate assays for motor and social behaviors in larval zebrafish. Behav Brain Res. 391, 112625(2020).
  31. Rock, S., et al. Detailed analysis of zebrafish larval behaviour in the light-dark challenge assay shows that diel hatching time determines individual variation. Front Physiol. 13, 827282(2022).
  32. Hillman, C., Kearn, J., Parker, M. O. A unified approach to investigating 4 dpf zebrafish larval behaviour through a standardised light/dark assay. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 134, 111084(2024).
  33. Best, J. D., et al. Non-associative learning in larval zebrafish. Neuropsychopharmacol. 33 (5), 1206-1215 (2008).
  34. Gomez-Laplaza, L. M., Gerlai, R. Latent learning in zebrafish (Danio rerio). Behav Brain Res. 208 (2), 509-515 (2010).
  35. Winn, A. A., Prestia, K. A., Peneyra, S. M. Testing alternative surface disinfection agents for zebrafish (Danio rerio) embryos. J Am Assoc Lab Anim Sci. 60 (5), 510-518 (2021).
  36. Wagle, M., Nguyen, J., Lee, S., Zaitlen, N., Guo, S. Heritable natural variation of an anxiety-like behavior in larval zebrafish. J Neurogenet. 31 (3), 138-148 (2017).
  37. Maximino, C., et al. Measuring anxiety in zebrafish: a critical review. Behav Brain Res. 214 (2), 157-171 (2010).
  38. Schnorr, S. J., Steenbergen, P. J., Richardson, M. K., Champagne, D. L. Measuring thigmotaxis in larval zebrafish. Behav Brain Res. 228 (2), 367-374 (2012).
  39. Dekens, M. P. S., Fontinha, B. M., Gallach, M., Pflugler, S., Tessmar-Raible, K. Melanopsin elevates locomotor activity during the wake state of the diurnal zebrafish. EMBO Rep. 23 (5), e51528(2022).
  40. Lee, H. B., et al. Key HPI axis receptors facilitate light adaptive behavior in larval zebrafish. Sci Rep. 14 (1), 7759(2024).
  41. Cavanagh, J. F., Kumar, P., Mueller, A. A., Richardson, S. P., Mueen, A. Diminished EEG habituation to novel events effectively classifies Parkinson's patients. Clin Neurophysiol. 129 (2), 409-418 (2018).
  42. Bedrossiantz, J., Prats, E., Raldua, D. Neurotoxicity assessment in adult Danio rerio using a battery of behavioral tests in a single tank. J Vis Exp. 201, e65869(2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

MPTP

Похожие статьи