Двухцветные мультиволоконные фотометрические записи сети социального поведения у мышей

Eartha Mae Guthman; Jorge M. Iravedra-García; Polina Cherepanova; Sae Yokoyama; Sophie E. Lockwood; Stefan N. Oline; Annegret L. Falkner

doi:10.3791/70049

Методическая статья

Двухцветные мультиволоконные фотометрические записи сети социального поведения у мышей

DOI:

10.3791/70049

⸱

17 марта 2026 г.

Eartha Mae Guthman^*¹ , Jorge M. Iravedra-García^*¹ , Polina Cherepanova¹ , Sae Yokoyama¹ , Sophie E. Lockwood¹ , Stefan N. Oline¹ , Annegret L. Falkner¹

¹Princeton Neuroscience Institute, Princeton University

^* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетчаточная фотометрия — один из самых распространённых методов для фиксации активности кальция в глубокомозговых нейронных популяциях. Здесь мы описываем протокол для настраиваемой, многоточной двухцветной визуализации активности кальция и других динамических флуоресцентных сигналов из нейронных популяций глубокого мозга у мышей.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Волоконная фотометрия, это объёмная запись сигналов через оптический кабель, — полезный метод для фиксации активности кальция из групп нейронов свободно движущегося грызуна. В частности, этот метод делает целенаправленное нацеление на небольшие популяции генетически определённых нейронов в более вентральных и менее доступных областях мозга решаемой задачей, поскольку запись с клеточным разрешением остаётся сложной. Эту технику можно масштабировать для записи с нескольких участков одновременно с помощью многоволокнистого подхода и нацеливаться на несколько типов клеток с помощью генетических стратегий на каждом зарегистрированном участке. Здесь мы предлагаем протокол для создания и вставки индивидуальных мультиволоконных массив для таргетирования сети социального поведения мыши (до 12 сайтов). Этот протокол подробно описывает хирургические процедуры, необходимые для успешного таргетирования нескольких участков с использованием наших индивидуальных мультифибровых массив и вирусного подхода для передачи зелёных и красных флуоресцентных индикаторов кальциевой активности для одновременной визуализации двух генетически идентифицированных нейронных популяций на каждом участке. Мы демонстрируем, как записывать из этих областей с помощью коммерчески доступной системы комплементарных металлооксидных полупроводниковых камер (CMOS) во время социального поведения. Кроме того, этот протокол демонстрирует методы контроля качества и детализирует конвейер предварительной обработки для коррекции шума и стандартизации. Наконец, мы обсуждаем некоторые возможные применения инструмента для выявления новых открытий о крупномасштабных мозговых сетях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Волоконная фотометрия, объёмная запись флуоресцентных сигналов через волоконно-оптические кабели, стала мощным методом измерения активности нейронных популяций в глубинных областях мозга. Часто эти области труднодоступны с помощью микроэндоскопии или традиционных электрофизиологических^{подходов} ^1,2,3. Одной из главных целей современной системной нейронауки является выявление и разборка вычислений, используемых крупномасштабными клеточно-специфическими мозговыми сетями, участвующими в формировании поведения. Нейропиксельные зонды и коммерчески доступные многоволоконные феррулы отлично справляются с записью линейно выровненных нейронных^{популяций} 4,5,6,7, тогда как широкопольная коркальная визуализация обеспечивает отличное покрытие поверхностной корковой ^{динамики} ^8,9. Однако одновременное проведение записи из пространственно рассеянных, но функционально связанных субкорковых нейронных популяций остаётся технически^{сложным} 5,10,11,12. Кроме того, хотя возможно нацеливаться на несколько глубоких структур мозга с помощью нескольких феррул с одним волокном для фотометрии, этот подход ограничен нейронными популяциями, достаточно удаленными друг от друга для имплантации нескольких^{феррул.} Индивидуальные мультиволоконные фотометрические массивы устраняют этот пробел, позволяя одновременно записывать множество подкорковых областей у свободно ведущих себя животных с минимальными ограничениями, предоставляя уникальное окно в координацию на уровне сети во время сложных поведенческих процессов.

Социально-поведенческая сеть (SBN) представляет собой идеальную систему для исследования динамики крупномасштабных мозговых сетей. SBN — это плотно взаимосвязанный и эволюционно консервативный набор подкорковых структур, участвующих в формировании социального поведения, выявленный у всех классов^{позвоночных} 13,14,15. Эти структуры традиционно включают, но не ограничиваются, латеральной перегородкой, преоптической областью, ложным ядром строи терминалис, передними и вентромедиальными ядрами гипоталамуса, медиальной миндалиной, ядром accumbens и периакведуктольным^серым 13,14,15. Внутри SBN специфические нейронные популяции, определяемые молекулярными маркерами, играют ключевую роль в регуляции социального поведения. Нейроны SBN Σ-аминомасляной кислоты-эргические (ГАМКергические) (отмеченные экспрессией везикулярного ГАМК-транспортера или VGAT) и глутаматергические нейроны (отмеченные экспрессией везикулярного глутаматного транспортера или VGlut) представляют собой основные возбуждающие и ингибиторные типы клеток в сети и, вероятно, играют диссоциационную роль в модуляции социального^{действия} 16,17,18,19 . Помимо этих классических нейротрансмиттерных систем, сигнализация половых гормонов играет критическую роль в работе сети. Например, многие мужские и женские социальные поведения требуют экспрессии альфа-эстрогенового рецептора, и активность нейронов SBN, экспрессирующих эти рецепторы, причинно определяет эти поведения 16,20,21,22,23,24,25,26. Кроме того, нейронные популяции SBN обогащаются лигандами и рецепторами многих нейромодуляторных систем, включая дофамин, аргинин-вазопрессин, окситоцин, опиоиды, тахикинином, нейропептидом Y, пролактином, орексином, пептидом, связанным с агути, меланокортином, кисспептином и гонадотропин-рилизинг-гормоном^{17,18,19,27,28,29,30}^,³¹, и недавние достижения в генетически закодированных сенсорах теперь позволяют отслеживать многие из этих разнообразных сигнальных^{молекул 32}^, ³³^, ³⁴^, ³⁵^, ³⁶^, ³⁷^, ³⁸. Поскольку нейронные популяции SBN пространственно распределены по субкортикальной структуре, традиционные экспериментальные препараты (например, внеклеточная электрофизиология, визуализация поверхности коры и более ранние подходы к мультифибровой фотометрии) не могут зафиксировать динамику активности в данном масштабе мозговой сети. Тем не менее, отслеживая динамику кальция в генетически определённых нейронных популяциях вместе с паттернами высвобождения нейромодуляторов, специализированные мультисайтовые фотометрические платформы могут выявить, какие конкретные типы клеток и сигнальные молекулы кодируют определённые особенности социального поведения, предоставляя новые механистические инсайты.

Здесь мы разработали настраиваемую платформу для многопрофильной, двухцветной фотометрии волокон, которая позволяет одновременно записывать до 12 областей мозга у свободно ведущих себя мышей. Используя этот подход, мы провели двухцветные фотометрические записи активности кальция из 22 идентифицированных нейронных популяций, распределённых по 11 областям мозга SBN, а также измерения флуктуаций дофамина в ядре accumbens с помощью датчика DA, основанного на активации GPCR (GRAB-DA1m)³³ (Таблица 1). Этот протокол (рисунок 1) подробно описывает создание индивидуальных мультифиберных массивов, хирургические процедуры для воздействия нескольких глубоких участков мозга, стратегии доставки вирусов для экспрессии двойных индикаторов кальция (GCaMP³⁹ и RCaMP⁴⁰), сбор данных с помощью коммерчески доступной системы фотометрии на базе CMOS-камер, методы контроля качества и конвейер предварительной обработки для коррекции шума и стандартизации сигналов. Ключевым является то, что наш конвейер предварительной обработки включает записи изосбестических управляющих длин волны, что позволяет нам корректировать артефакты движения. Мы применяем регрессионный подход⁴¹ для коррекции артефактов движения, обеспечивая точность сигналов во время активных социальных действий, таких как посадка или борьба. Поскольку наш индивидуальный метод мультиволоконной фотометрии может одновременно отслеживать активность, распределённую как по проксимальной, так и по дистальной глубинной структуре мозга, сохраняя при этом специфичность записей к типу клеток с помощью генетического^{таргетинга} ^42,43, он даёт значительные преимущества по сравнению с альтернативными методами записи динамики нейронной активности в крупномасштабных сетях глубокого мозга.

Этот протокол оптимально подходит для экспериментов, требующих одновременной записи пространственно рассеянных подкорковых областей мозга (≥4 сайта) у свободно ведущих себя животных, особенно при исследовании сетевой динамики между генетически определёнными типами клеток или отслеживании высвобождения нейромодуляторов вместе с нейронной активностью. Этот подход особенно ценен для изучения натуралистического поведения, связанного с энергичными движениями (например, социальными взаимодействиями), где наш конвейер коррекции артефактов движения обеспечивает точность сигнала. Однако исследователи, стремящиеся к разрешению отдельных клеток, различию между соматическими и аксональными сигналами или записям из поверхностных корковых областей, могут найти альтернативные методы (например, миниатюрная микроскопия, нейропиксели или широкопольная визуализация) более подходящими. Ключевые практические аспекты включают хирургическую сложность, необходимость изготовления индивидуальных многоволоконных массивов и создание инфраструктуры необходимых материалов (возможности 3D-печати, оптоволоконные инструменты).

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был протестирован и валидирован на взрослых мышах в возрасте от 8 до 25 недель. Мышей содержали при 21–26 °C и влажности 30%–70% в 12-часовом цикле с обратным темно-светом (ВЫКЛЮЧЕНО: 10:00 утра; ON: 22:00). Эксперименты проводились исключительно в субъективно-активной (тёмной) фазе. Еда и вода предоставлялись импровизированно. Все процедуры с животными были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Принстонского университета и соответствовали стандартам Национальных институтов здравоохранения.

1. Производство многоволоконных массивов и патчкордов (рисунок 1A)

Изготовить патчкорд (Рисунок 2A).
1. Получите патчкорд с 12 волоконными ветвлениями и распечатайте предоставленный разъём для патчкорда и стереотактические сверловые аксессуары (Дополнительный файл 1, Дополнительный файл 2, Дополнительный файл 3) с использованием смолы (прочность на растяжение: 8,7 килофунт/квадратный дюйм [ksi], электронный модуль: 377 кси, отклонение тепла: 138 °F, удлинение: 8%).
2. Сделайте предоставленную полировочную шайбу (Дополнительный файл 4) из стержня из нержавеющей стали диаметром 2 дюйма и добавьте вырез размера мультифибрового массива в центре шайбы.
3. Вручную очистите избыточную смолу из отверстий штифта в мультиволоконной массиве с помощью сверла размером 1,22 мм x 11 мм. Даже при точной 3D-печати отверстия для штифтов немного малы для штыря.
4. Сквозные сквозные сквозь ск
  1. Вставьте штифты из легированной стали (1,19 мм x 12,7 мм) во все 4 отверстия стереотаксического сверления и вставьте разъём патчкорда снизу вверх в стереотактический сверлительный аксессуар, при этом штифты проходят через сквозные отверстия многоволоконного массива.
  2. Затяните винтовы размера M4 в резьбовых отверстиях для закрепления разъёма патчкорда и закрепите стереотактический сверлящий аксессуар в стереотактической рамке.
  3. Вставьте сверло размером 0,25 мм x 5,5 мм в стереотактическое сверло и закрепите его на стереотактической рамке. Используя это сверлоло, выровняйте рыскание, тангаж и крен многоволоконной массивы с максимальной допуском отклонения ±0,03 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выровняйте рыскание и тангаж в самых передних и задних точках 3D-печати, рулон уровня на четырёх углах многоволоконного массива.
  4. Сверлите центр над одним из 3D-печатных отверстий волокна и установите координаты стереотактической рамки X/Y на координаты ML (X) и AP (Y) соответствующей области мозга (Таблица 1). Переместите сверло на новые координаты (0, 0) на стереотаксической раме, чтобы центрировать сверло над сквозным отверстием переднего штифта.
  5. Используйте сверло размером 0,25 мм x 5,5 мм, чтобы просверлить каждое сквозное отверстие до глубины 5,5 мм по стереотаксически определённым координатам (Таблица 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте длинный кусок избыточного волокна, чтобы убедиться, что все отверстия полностью очищены, прежде чем снимать многоволоконный массив из стереотактической рамки. Это ограничит количество раз, когда многоволоконный массив нужно выравнивать и просверливать для очистки сквозных отверстий.
5. Соединяйте разъём патчкорда и ветвящийся патчкорд
  1. Обнажите >10 см волокон патчкорда. Обрезайте волокна с помощью волокнистого рабочего устройства, чтобы убедиться, что они одинаковой длины. Затем разместите по одному кусочку термоусадочных трубок диаметром 3/16" и 5/16" вокруг 12 волокон на патчкорде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трубка защитит любые открытые волокна после их приклеивания в разъём.
  2. Вставьте каждое волокно в одно из сквозных отверстий в разъёме патчкорда так, чтобы примерно 0,3 мм волокна было открыто на нижней поверхности. После вставки всех волокон используйте иголочный наконечник 21–27 G, чтобы нанести суперклей на верхнюю поверхность разъёма патчкорда и закрепить волокна на месте.
  3. Нанесите эпоксидку на верхнюю поверхность разъёма патчкорда в форме пирамиды высотой 0,5–1 см. Убедитесь, что эпоксидка не покрывает ни одну область, кроме верхней поверхности, куда были вставлены волокна. Дайте эпоксидке высохнуть при комнатной температуре на ночь.
  4. Используйте тепловой пистолет на минимальной температуре, чтобы уменьшить термоусадочную трубку поверх эпоксидки и открытого волокна над ней (<3–5 см).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При этом избегайте прикасаться к термоусадочной трубке, чтобы избежать ожогов.
  5. Вырежьте кусок мягкой пластиковой трубки внутреннего диаметра 3 мм по длине оставшихся обнажённых волокон, вырежьте разрез вдоль края трубки и оберните оставшееся обнажённое волокно в трубку.
  6. Покрасьте прозрачную трубку непрозрачным чёрным маркером, чтобы волокна больше не были видимы, минимизируя освещение от открытого волокна во время экспериментов с визуализацией.
6. Отполировать патчкорд.
  1. Закрепите нижнюю поверхность разъёма патчкорда в кастомном полировочном шаре. Полировать разъём патчкорда на полировочных листах с зернистостью 6 мкм, 3 мкм, 1 мкм и затем 0,01 мкм с помощью 10–20 движений в форме символа бесконечности/листа. Для листов зернистости 1 мкм и 0,01 мкм налейте 5 капель дистиллированной воды перед полировкой.
  2. Протрите поверхность разъёма, чтобы убрать лишки дистиллированной воды. Проверьте на наличие дефектов или трещин на полированной поверхности разъёма с помощью микроскопа с ярким полем и, если они есть, повторите полировку.
7. Проверьте выход patchcord.
  1. Подключите конец разъёма субминиатюрной версии A (SMA) к системе фотометрии на базе CMOS-камеры. Используя программное обеспечение для визуального кодирования, следуйте инструкции фотометрии и сфокусируйте CMOS-камеру на стороне SMA в патчкорде.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Руководство регулярно обновляется в соответствии с обновлениями программного обеспечения. Поскольку визуальный код фотометрической системы часто меняется с новыми релизами программного обеспечения, это руководство содержит самую актуальную информацию о текущих версиях программного обеспечения.
  2. Измерьте выход патчкорда 470 нм при 20% мощности с помощью оптического измерителя мощности. Повторите шаг 1.1.7, если выход патчкорда < 2.5 мВт.
Создайте мультиволоконный массив (Fabric Multifiber Array).
1. Печатайте предоставленный мультиволоконный массив (Дополнительный файл 5, Дополнительный файл 6) с использованием смолы с техническими характеристиками, описанными в шаге 1.1.1.
2. Подготовьте многоволоконный массив (multifiber).
  1. Вставьте латунные шестигранные гайки M0.6 в каждый из четырёх слотов в боковых углах мультифибрового массива и выровняйте отверстие шестигранной гайки в центре отверстия.
  2. Нанесите по одной капле суперклея сбоку каждого прореза шестигранной гайки с наконечником иглы 21–27 G, при необходимости добавляя дополнительные капли для усиления. Дайте клею высохнуть при комнатной температуре 5 минут, прежде чем перейти к следующему этапу.
  3. Сбрийте клей с боков мультифибрового массива лезвием, чтобы он хорошо подходил к полировочной шайбе.
  4. Если избыток суперклея высох на поверхности массива мультифибра, полируйте поверхность массива с помощью индивидуальной полировочной шайбы и 30 мкм полировочных листов, пока клей не будет снят и поверхность массива не станет ровной.
  5. Вручную очистите избыточную смолу из отверстий штифта в мультиволоконной массиве с помощью сверла диаметром 1,22 мм.
3. Просверлите сквозные волоконные отверстия (рисунок 2B-C).
  1. Вставьте штифты из легированной стали (1,19 мм x 12,7 мм) во все 4 отверстия стереотаксического сверления и поместите многоволоконный массивный штифт с поверхностной стороны (плоской стороной) вверх в стереотактический сверлильный аксессуар, при этом штифты проходят через отверстия штифта мультиволокна.
  2. Повторите шаг 1.4.2 – шаг 1.4.5.
4. Подготовьте волокна для мультиволоконного массива.
  1. Снимите пластиковый корпус с сечения 200 мкм оптического волокна 0,39 NA с помощью волоконного стриптера. Очистите волокно этанолом.
  2. Разрежьте волокна на секции длиной ~3–5 см с помощью волокнистого тесака. Далее разрежьте эти участки пополам с помощью волокнистого бреца. Используйте микроскоп с ярким полем, чтобы убедиться, что хотя бы один конец разрезанных секций не имеет сколов и дефектов. Используйте только волокна с хотя бы одним безупречным концом.
  3. Заклейте точную линейку длиной не менее 15 мм под микроскопом brightfield. Разместите безупречную сторону волокна в положении 0 мм на линейке (рисунок 2D). Разрезать волокна до нужной длины для каждой целевой области (Таблица 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Длина волокна рассчитывается путём добавления 6 мм к стереотактической D/V координате для самого глубокого волокна, а затем корректировки этого значения для всех волокон с целью соответствия разницы между их D/V координатами и D/V координатами самого глубокого волокна.
5. Вставьте волокна в мультиволоконный массив.
  1. Поместите мультиволоконный массив в держатель для изготовления поверхностью вниз. Выровняйте и закрепите деталь с помощью штифтовых штифтов.
  2. Сопоставьте длину волокна с точкой (Таблица 1) и вставьте рассеченные волокна в соответствующие сквозные отверстия в мультиволоконном массиве так, чтобы безупречная сторона была обращена вверх. Убедитесь, что все волокна полностью втянуты перед следующим этапом.
  3. Нанесите суперклей с наконечником иглы весом 21–27 G, чтобы склеить все волокна на место. Дайте клею накатиться минимум 30 минут при комнатной температуре, прежде чем продолжить.
6. Полировать мультиволоконный массив повторением шага 1.1.6 с мультиволоконным массив поверхностью вниз (рисунок 2E).
7. Проверьте эффективность мультиволоконного массива.
  1. Очистите отполированную поверхность массива мультифибра этанолом, а затем нанесите на неё гель с индексным соответствием. Вставьте 4 штифтовых штифта в разъём патчкорда и закрепите многоволоконный массив с помощью винтов G5 и соответствующей отвёртки (рисунок 2F).
  2. Используйте измеритель мощности для измерения излучения светодиодов 470 нм и 560 нм от мультиоптоволоконного массива. Вычислите эффективность с помощью следующих значений:
  3. Если эффективность <75%, повторяйте шаги 1.2.7.1–1.2.7.2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если повторная полировка не повышает эффективность и на волокнах нет дефектов, возможно, что волокна на мультифибровой массиве не совпадают с разъёмом патчкорда.
8. Подготовьте многоволоконный массив к использованию (рисунок 2G).
  1. Вставьте 4 штифтовых штифта в сквозные отверстия мультиволоконного массива. Убедитесь, что штифты не выступают более чем на 1 мм от мозговой стороны мультиволоконного массива.
  2. Положите суперклей на сторону мозга на штифты. Дайте клею высохнуть минимум 10 минут при комнатной температуре перед использованием мультифибрового массива.

2. Хирургия (рисунок 1B)

Подготовьте операционное пространство и инструменты.
1. Очистите стереотаксическую раму для обеспечения асептической рабочей зоны.
2. Получите стерильный впитываемый шов.
3. Автоклав — пару тонких щипцев, тонкие ножницы и два зажима в форме бульдога.
4. Убедитесь, что вапорайзер наполнен изофлураном. Убедитесь, что трубки для изофлюрансных, вакуумных и кислородных линий надёжно соединены с испарителем, индукционной камерой и носовым конусом стереотаксической рамы.
Получите вирусы, ассоциированные с аденокислотой jRCaMP1b, GCaMP6f и GRAB-DA1m.
ВНИМАНИЕ: Всегда носите средства индивидуальной защиты при работе с вирусами.
1. Разбавьте вирусы до рабочей концентрации от^1x10 до 4x10,¹³ частей на миллилитр, если необходимо.
2. Приготовьте смесь вирусов jRCaMP1b и GCaMP6f, ассоциированных с аденокислотой, соотношение 1:1.
3. Поместите аликвот вирусной смеси 1:1 jRCaMP1b:GcaMP6f и аликвот вируса GRAB-DA1m на лёд, чтобы поддерживать температуру на уровне 4 °C.
Индуцировать анестезию.
1. Поместите мышь в камеру введения и закройте дверцу камеры. Запустить поток кислорода в вапорайзер со скоростью 1 л/мин.
2. Направить поток газа в камеру впуска и включить вакуумную трубу для удаления излишков газа из камеры. Установите в вапорайзере концентрацию изофлурана от 3% до 5%.
Перенесите мышь в стереотактический кадр.
1. Когда дыхание мыши замедлилось до 1 вдоха в секунду, переместите мышь на стереотаксический кадр. Зацепите передние резцы мыши в прорезь в мундштуке носового конуса и затяните носовой конус на носу мыши.
2. Переключите поток газа на стереотаксическую систему с концентрацией изофлурана на уровне 1%–2% для поддержания анестезии. Переключите вакуумную линию, чтобы удалить газ из носового конуса.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за дыханием мыши во время операции и регулируйте концентрацию изофлурана по мере необходимости, чтобы поддерживать глубокий наркоз со скоростью дыхания 1 вдох/с. Глубокая анестезия должна подтверждаться периодически во время операции, следя за тем, чтобы мышь не реагировала на защемление пальца.
3. Настройте систему отопления на поддержание температуры тела 35 °C и нанесите оптическую мазь на глаза мыши, чтобы предотвратить их пересыхание.
4. Вставьте стереотаксические ушные планки так, чтобы они надавливались по обе стороны черепа, слегка сверху и впереди от слуховых проходов. Затяните ушные планки и убедитесь, что череп мыши закреплён на месте, мягко надавливая на макушку.
Подготовьте кожу головы к разрезу.
1. Подстригите или побрийте волосы на макушке мыши, пока они не станут короткими. Нанесите гель для удаления волос на макушку головы мыши и оставьте постоять примерно на минуту. Удалите оставшийся гель чистой ватной палочкой.
2. Повторяйте 2.5.1 по мере необходимости, пока не уберут все волосы на макушке.
3. Дезинфицируйте кожу на макушке с помощью ватных палочок для нанесения бетадина (10% раствора повидона-йода), затем 70% раствора этанола.
Обнажите череп.
1. Сделайте разрез вдоль средней линии черепа, простирающийся от немного сзади лямбды до немного передней ростральной вены.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Ростральная ринальная вена — это кровеносный сосуд, расположенный на дорсальной поверхности мозга между обонятельной луковицей и префронтальной корой.
2. Разрежьте и удалите выбритую кожу по бокам этого разреза, чтобы получить разрез в форме слёзы, который обнажает теменные кости, передний кончик внутритеменной кости и часть носовых костей перед ростральной веной (рисунок 2H).
3. Аккуратно очистите поверхность черепа солевым раствором 0,9% и чистой ватной палочкой.
Сравняй череп.
1. Определите место соединения ростральной вены с сагиттальным швом. Отметьте эту точку стерильным лезвием скальпеля.
2. Вставьте сверло карбида #92 в стереотактическое сверло и установите его на стереотактическую раму. Используйте стереотактический манипулятор, чтобы разместить кончик дрели на поверхности черепа в отмеченной точке и обнулить координаты X, Y и Z.
3. Выровнять шаг черепа путём измерения глубины Z в отмеченной точке и -8,25 мм позади неё. Выровняйте рыскание черепа, измеряя боковое расстояние между отмеченной точкой и положением -8,25 позади. Выравнивание крена измеряется глубиной Z в позициях ±2,0–2,5 мм от средней линии в позициях -2,0, -4,5 и -7,0 мм относительно отмеченной точки.
Выполняйте краниотомии и дуратомии.
1. Замените сверло на сверло #76 или #78 карбидного сверла. Занулите сверло на отмеченном месте на стыке сагиттального шва, ростральной вены и поверхности черепа.
2. Переместите сверло на координаты A/P и M/L каждой области мозга (таблица 1). В каждом месте просверлите краниотомию и аккуратно удалите твердую мозговую поверхность на каждой краниотомии с помощью пустого кончика шприца объёмом 27 г или меньше.
Введите вирус.
1. Протяните стеклянные микропипетки так, чтобы их кончики сужались не менее 7 мм и имели отверстие 10–30 мкм.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Перезапускайте шаги 2.9.2–2.9.12, если в микропипетке есть воздушные пузырьки после любого из последующих шагов.
2. Заполните пустой стеклянный кончик микропипетки минеральным маслом. Вставьте и закрепите кончик микропипетки в нанолитровый инжектор. Используйте интерфейс нанолитрового инжектора, чтобы выбросить как можно больше минерального масла из микропипетки.
3. Установите нанолитровый инжектор на стереотактическую раму. Вырежьте небольшой кусочек парафинового воскового листа и положите его на голову мыши.
4. Пипетта 1 мкл смеси вирусов jRCaMP1b:GCaMP6f на парафиновый воск. Опустите кончик нанолитрового инжектора так, чтобы стеклянный наконечник микропипетки оказался в вирусной смеси, и заполните микропипетку вирусом с помощью интерфейса инжектора.
5. Повторяйте версию 2.9.4, пока весь используемый вирус не будет передан на нанолитровый инжектор (Таблица 1). Удалите и утилизируйте парафиновый воск в контейнер для биологических отходов.
6. Занулить кончик микропипетки инжектора в отмеченном месте на стыке сагиттального шва, ростральной вены и поверхности черепа.
7. Начиная с самого вентрального или самого дорсального места инъекции (Таблица 1), перемещайте кончик микропипетки к каждому месту, опускайте его, чтобы касаться поверхности мозга, и обнулите Z-позицию на стереотактической оправе.
8. В каждом месте опустите кончик микропипетки в мозг, пока он не достигнет 0,1 мм вентрального относительно места инъекции. Затем поднимите кончик микропипетки на 0,1 мм к конечному месту инъекции. Дайте окружающей ткани осесть вокруг кончика микропипетки в течение 30 секунд.
9. Используя интерфейс нанолитрового инжектора, введите 300 нл вирусной смеси 1:1 jRCaMP1b:GcaMP6f со скоростью 1–2 нл/с, чтобы рассеять смесь в текущем месте впрыскивания.
10. Оставьте кончик микропипетки в месте введения не менее 5 минут после завершения инъекции. Медленно поднимайте кончик микропипетки из мозга, чтобы снизить риск распространения вируса сверху по дорожке инъекции.
11. После введения вирусной смеси 1:1 jRCaMP1b:GcaMP6f в каждом участке используйте интерфейс инъекции нанолитра, чтобы вернуть поршень нанолитрового инжектора в исходное место. Снимите микропипетку и утилизуйте её в контейнер для биологических острых отходов.
12. При необходимости повторяйте шаги 2.9.2–2.9.11 для каждой области мозга, направленной на экспрессию GRAB-DA1m. В каждом целевом участке вводите 150 нл вместо 300 нл, используемых для вирусной смеси.
Многоволоконный массив импланта.
1. Закрепите мультиволоконный массив на стереотактической раме с помощью любого крепления, которое может удерживать мультиволоконный массив за штифты для поддержания стабильности во время имплантации (рисунок 2I).
2. Скорректируйте положение мультифиберного массива так, чтобы каждое волокно совпадало с центром соответствующей краниотомии, а самая длинная клетчатка лежала на поверхности мозга. Обнулить стереотаксический манипулятор в этом месте и постепенно опустить мультиволоконный массив до 0,25 мм выше D/V позиции самой глубокой инъекции вируса (таблица 1, рисунок 2J).
3. Поставьте холодную чашу для смешивания на лёд и добавьте к ней 1 ложку цементного порошка, 4 капли жидкой основы и 1 каплю катализатора. Миксируйте 20 секунд.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Повторяйте этот шаг всякий раз, когда используется жидкий цемент и требуется больше.
4. Используйте шприц и иглу 23–31 G для переноса жидкого цемента в промежутке между мультифибровым массивом и черепом.
5. Нанесите жидкий цемент с помощью тонкого пластикового аппликатора или иглы шприца, чтобы полностью покрыть четыре стороны мультифиберного массива, формируя пирамидоподобную форму черепа (рисунок 2K). Дайте цементу высохнуть минимум 15 минут.
6. Сшивайте кожу вдоль разреза, чтобы череп не был обнажен.
Дайте мыши восстановиться.
1. Уменьшите концентрацию изофлурана до 0.
2. Перенесите мышь из стереотактической рамки на грелку и дождитесь, пока мышь станет бодрой и будет двигаться, прежде чем вернуть её в клетку.
3. Дайте мыши восстановиться как минимум две недели, прежде чем начинать эксперименты.

3. Многосторонняя двухцветная кальциевая визуализация (рисунок 1C)

Настройте устройство сбора данных (DAQ).
1. Подключите GND к порту AGND выше порта Ch7 с помощью электрического провода.
2. Подключите DIO0 к порту Ch0 с помощью электрического провода.
Подключите фотометрическую систему к DAQ.
1. Подключите конец разъёма Baby Neill Constant (BNC) разделённого BNC-кабеля (разъём BNC на одном конце, красный и чёрный электрические провода с другого) к входному порту фотометрической системы. Подключите конец разъёма BNC другого разделённого BNC-кабеля к выходному порту фотометрической системы.
2. Возьмите разделённый BNC-кабель, подключённый к входному порту фотометрической системы, и подключите его красный конец к порту DIO1 на DAQ. Возьмите разделённый BNC-кабель, подключённый к выходному порту фотометрической системы, и подключите его красный конец провода к порту Ch1 на DAQ.
3. Подключите чёрные заземляющие провода от обоих разделённых BNC-кабелей к порту DAQ GND.
Синхронизировать поведение и фотометрические камеры.
1. Объединяйте несколько поведенческих камер для одновременной записи поведения с разных ракурсов.
  1. Подключите опто-изолированный выход (контакт 4, белый провод) основной камеры поведения к неизолированному входу вторичной камеры (контакт 1, зелёный провод) с помощью резистора 3,3 KΩ. Подключите выход основной камеры 3,3 В (вывод 3, красный провод) к тому же резистору 3,3 кОм и к Ch2 на DAQ.
  2. Подключите опто-изолированный выход каждой вторичной камеры к её выходу 3,3 В с помощью резистора 3,3 кΩ.
  3. Подключите заземление основной камеры (контакт 6, коричневый провод) к заземлению каждой вторичной камеры. Подключите все заземляющие провода камеры к порту DAQ AGND выше порта Ch2 и к выходному заземлению фотометрической системы.
Настройте настройки камеры поведения с помощью соответствующего программного обеспечения для съёмок изображений.
1. Установите «Частоту кадров приобретения» на 45 Гц и усиление на 1.
2. Установите время экспозиции на 2998 мкс, нижний предел экспозиции на 100 мкс, а верхний предел экспозиции на 150000 мкс.
  ПРИМЕЧАНИЕ: «Частота кадров при получении» может не быть фактической частотой кадров, которая будет захвачен. В зависимости от времени экспозиции и запрашиваемой пропускной способности, это значение может потребоваться установить выше конечной частоты изображения. При необходимости отрегулировать «Получение частоты кадров» так, чтобы отображаемая «Результирующая частота кадров» составляла 40 Гц.
Настройте программное обеспечение DAQ (дополнительный файл 7).
1. В программном обеспечении DAQ добавьте DAQ как «Устройство» и переключитесь на «Панель конфигурации».
2. Во вкладке «Каналы» под «Аналоговый вход» активируйте каналы 0–2. В разделе «Цифровой» активируйте канал 0.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Ch0 соответствует сигналу логической транзитор-транзиторной логики (TTL), Ch1 — фотометрической системе, а Ch2 — последовательно-цепным камерам.
3. В разделе «Analog Input» называйте канал 0 «TTL», канал 1 «Photometry_system», а канал 2 «Behavior_cameras», что означает «Transitor-Transistor Logic». В разделе «Цифровой» укажите канал 0 «TTL_trigger».
4. Во вкладке «Триггеры» установите триггеры на ручное управление. Во вкладке «Частоты дискретизации» установите частоту дискретизации на 350 Гц.
5. Переключитесь на «Панель дисплея» и введите окна «Strip», «Scalar» и «Output» в графический интерфейс.
Настройте программное обеспечение фотометрической системы (Дополнительный файл 8).
1. Разработайте рабочий процесс в программном обеспечении визуального кодирования, чтобы принять 5-вольтовый TTL-импульс для запуска записей и сохранить временную метку для каждого кадра, флуоресцентные излучения для красного и зелёного каналов для каждого волокна, а также исходное видео, как описано в руководстве по фотометрической системе.
2. Используя узел для фотометрической системы в рабочем процессе, убедитесь, что система настроена на запись чередующихся кадров с светодиодами 560, 470 и 415 нм при частоте 120 Гц при рабочей частоте кадров 40 Гц.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Этот подход мультиплексирования с временным делением (TDM) решает спектральное перекрытие между GCaMP и RCaMP путём временного разделения их возбуждения, обеспечивая независимое возбуждение каждого индикатора в последовательных кадрах. Используемая здесь система записи использует оптимизированные фильтры полосного излучения (зелёный канал: 500–530 нм; красный канал: >длинный проход 580 нм), которые дополнительно минимизируют спектральные перекрёстные помехи, ограничивая обнаруженные фотоны длинами волн, преимущественно излучаемыми каждым индикатором. Изосбестическая длина волны 415 нм одинаково возбуждает GCaMP и RCaMP, но вызывает минимальные кальциевые изменения флуоресценции, обеспечивая сигнал управления артефактами движения. Вместе TDM-возбуждение и спектральная фильтрация обеспечивают преимущественную отпечатку 470-нм кадров активности GCaMP (рисунок 3A), 560-нм кадры преимущественно отражают активность RCaMP (рисунок 3B), а 415-нм кадры обеспечивают кальциев-независимые сигналы для коррекции движения.
Проводите фотометрические записи in vivo .
1. Приобретите мышь, прошедшую вирусные инъекции и имплантацию мультифиберного массива, как описано во втором шаге.
2. Очистите соединительные поверхности патчкорда и имплантированного многоволокнистого массива этанолом и ватной палочкой. Используя узел для системы фотометрии в процессе визуального кодирования и фотометр, настройте каждый из уровней питания светодиодов 415, 470 и 560 так, чтобы они выдавали примерно 1,2 мВт освещения от патчкорда.
3. Нанесите индекс на соединительную поверхность патчкорда. Выровняйте патчкорд с имплантированным мультифибровым массивом мыши с штифтами массива и сдвигайте патчкорд вниз, пока он не достигнет заодно с поверхностью имплантированного мультиволоконного массива.
4. Затяните винты для патчкорда, чтобы закрепить мультиволоконный массив в патчкорде. Пусть мышь привыкнет перед началом экспериментов (рисунок 2L–M).
5. Задайте имена файлов.
  1. Для каждой камеры поведения нажмите красную кнопку «записать», чтобы открыть окно записи в программном обеспечении записи камеры поведения, и укажите имя файла.
  2. Откройте программу DAQ, нажмите кнопку шестерёнки и перейдите в «параметры логирования», где укажите имя файла.
  3. Нажмите на узел 'PhotometryWriter' в процессе визуального кодирования системы фотометрии, чтобы указать имя файла.
6. В окнах записи программного обеспечения для камеры поведения нажмите «начать запись» для каждой камеры. Далее нажмите кнопку воспроизведения в процессе визуального кодирования фотометрии и записи в программном обеспечении DAQ.
7. Нажмите на переключатель TTL, чтобы начать синхронную запись на всех камерах.
8. Запись завершена.
  1. Нажмите на TTL-переключатель, чтобы завершить синхронные записи камеры
  2. Нажмите кнопку стоп в процессе визуального кодирования фотометрии, «остановить запись» в окнах записи камеры поведения.
9. Повторяйте шаги 3.7.5–3.7.8 до конца экспериментов и отключите мышь.
  ПРИМЕЧАНИЕ: После экспериментов потоки данных фотометрии и поведенческой камеры могут быть выровнены с пользовательским кодом с использованием выходных данных программного обеспечения DAQ. В частности, (1) изменение напряжения TTL указывает на время начала и смещения TTL, (2) изменения в напряжении поведения камеры указывают на момент открытия и закрытия затвора камеры для съёмки каждого кадра поведенческого видео, и (3) начальное изменение напряжения в системе фотометрии, записанного на DAQ, можно сравнить с временем начала TTL, а временные метки фотометрической камеры выходят из программного обеспечения визуального кодирования для определения временных меток фотометрической камеры.

4. Обработка данных (рисунок 1D, дополнительный файл 9)

Предварительно обработайте данные кальциевого изображения.
1. Де-интерлив кадров кальциевых изображений для создания отдельных потоков сигнала, записанных в ответ на светодиоды 415 нм, 470 нм и 560 нм.
2. Используйте алгоритм адаптивного итеративно перевзвешенного штрафования наименьших квадратов (airPLS)⁴⁴ для коррекции базового дрейфа.
3. Вычислить ΔF/F с помощью следующих параметров:
  
  ПРИМЕЧАНИЕ: Базовый период должен быть стабильным периодом до экспериментальной манипуляции (например, до появления социального партнёра). Если базовый период слишком короткий (<2–3 мин) или проявляет большие колебания, которые могут быть загрязнены артефактами движения, рассмотрите возможность нормализации с использованием средней флуоресценции на протяжении всей сессии вместо ограниченного базового периода.
Правильные артефакты движения (рисунок 4A).
1. Используйте регрессионный подход, хотя подходят альтернативные методы (см. Таблицу 2)
2. Z-score сигналы ΔF/F, использующие медиану для нормализации величины сигнала по регионам:
3. Примените регрессию лассо с регрессией L1. Lasso (оператор наименьшей абсолютной усадки и выбора) осуществляет автоматический выбор признаков, снижая коэффициенты неинформативных предикторов до нуля.
  1. Выполнить поиск по сетке по параметрам регуляризации (α = 0,0001, 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 10, 100). Поиск по сетке определяет оптимальный баланс между сложностью модели и перенагоном. Этот шаг можно полностью автоматизировать с помощью кросс-валидационных процедур, доступных в стандартных библиотеках машинного обучения (например, scikit-learn на Python).
  2. Для двухцветной фотометрии (наш рекомендуемый подход) используйте все доступные 415-нм изосбестовые контрольные каналы в 12 регистрируемых областях в качестве предикторов (см. рисунок 4B–C и Результаты для обоснования). Для одноцветной фотометрии (только GCaMP или только RCaMP) ограничите предикторную матрицу только изосбестовым сигналом из того же волокна, где корректируется кальциевый сигнал.
  3. Выберите модель, которая минимизирует среднеквадратичную ошибку между предсказанным и наблюдаемым сигналом.
4. Вычитаем предсказанную компоненту движения из сигнала, чтобы получить скорректированную активность.
Сгладьте сигнал с помощью фильтра Савицкого-Голея с окном 725 мс.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы одновременно записывать до 12 областей мозга SBN, мы создали настраиваемый мультиволоконный массив по вышеуказанному протоколу. После восстановления после операции мыши были зафиксированы во время социального взаимодействия (рисунок 5). Во всех экспериментах самцам мышей с CD1 разрешалось взаимодействовать с самцами мышей Balb/c в их домашней клетке. Мы использовали мышей Vgat-Cre для экспрессии jRCaMP1b⁴⁰ в ГАМКергических нейронах в зависимости от Cre в 11 областях мозга SBN, GCaMP6f³⁹ в не-ГАМКергических клетках^{— 45} в тех же областях мозга, и GRAB-DA1m³³ в Nucleus accumbens⁴² (Таблица 1). Гистологическое подтверждение таргетирования клетчаткой можно найти в наших предыдущих^{публикациях} ^42,43. Здесь мы стремились проверить эффективность различных методов коррекции артефактов движения. В частности, мы сравнили эффективность использования: (1) только медианного фильтра; (2) Регрессия лассо с регуляризацией L1 с использованием только одноволокнистых изосбестических сигналов (метод с одним предиктором)¹¹ и (3) регрессия лассо с использованием изосбестических сигналов всех волокон в качестве предикторов (мультипредикторный подход)^41,42 (Рисунок 4A). Критически важно, что методы на основе лассо корректируют исходный сигнал, используя независимый от активности флуоресцентный сигнал, генерируемый в ответ на светодиод с изосбестической частотой (415 нм), тогда как сглаживание медианного фильтра не учитывает независимый от активности сигнал.

Мы оценивали коррекцию движения с помощью двух разных показателей: абсолютного высокочастотного шума и джиттера. Высокочастотный шум определялся как стандартное отклонение первой производной сигнала, отражающее величину резких колебаний сигнала. Джиттер был определен как коэффициент вариации производной сигнала, который отражает величину изменчивости сигнала от кадра к кадру относительно среднего значения производной сигнала. Мы обнаружили, что оба подхода, основанные на Лассо (однопредиктор и мультипредиктор) значительно превосходят медианный фильтр по снижению как высокочастотного шума, так и джеттера, при этом коррекция с мультипредикторами немного превосходит коррекцию одного предиктора (рисунок 4C–D; Высокочастотный шум, n=414 для 23 сигналов в 18 сессиях записи: тест Крускаля-Уоллиса, H = 501.9420, p < 0.001; пост-hoc тесты Mann-Whitney U с коррекцией Бонферрони: сглаженная против односайтовой регрессии ***p < 0,001, сглаженная против многосайтовой регрессии***p < 0,001, односайтовая против многосайтовой **p = 0,0073; Джиттер: тест Крускал-Уоллис, H = 495.6685, стр. < 0.001; пост-hoc тесты Mann-Whitney U с коррекцией Бонферрони: сглаженная против односайтовой регрессии ***p < 0,001, сглаженная против многоточковой регрессии***p < 0,001, одноместная против многосайтовой ***p = 0,0006). В частности, мультипредикторный подход (с использованием всех волоконных изосбестиков) показал преимущества для сигналов красного канала (RCaMP): 5 из 12 красных сигналов показали значительно меньший остаточный шум по сравнению с коррекцией с одним предиктором (n = 18 записей/регион). Для джиттера BNST (t-тест, t = 5,42, ***p < 0,001), POA (t-тест, t = 2,68, *p = 0,011), AH (t-тест, t = 2,66, *p = 0,012) и PAG (тест Mann-Whitney U, U = 279, ***p < 0,001) показали превосходство мультипредикторов. Для высокочастотного шума BNST (тест Mann-Whitney U, U = 285, ***p < 0,001), POA (тест Mann-Whitney U, U = 292, ***p < 0,001), AH (t-тест, t = 7,10, ***p < 0,001), PAG (t-тест, t = 13,72, ***p < 0,001) и LHb (t-тест, t = 5,47, ***p < 0,001) показали превосходство по мультипредикторам. Сигналы зелёного канала (GCaMP) не показали значимых различий между двумя подходами Lasso во всех 12 регионах по метрикам джиттера или высокочастотного шума (все p>0.05, полный список статистических тестов см. Таблицу 3). Это говорит о том, что для двухцветной фотометрии включение кросс-канальной изосбестовой информации улучшает коррекцию движения для красных сигналов, вероятно, потому что изосбестики зелёного канала обеспечивают более чистую информацию о движении. Эти данные показывают, что коррекция артефактов движения с использованием методов регрессии на основе изосбеста значительно превосходит простые методы фильтрации, при этом многоканальная регрессия даёт особые преимущества для записи с двумя цветами.

figure-results-1
Рисунок 1. Запись из сети социального поведения с использованием многопрофильной двухцветной фотометрии волоконного соединения. (A) Схематическое представление того, как построить мультиволоконный массив (multifiber). (B) Схематическое представление рабочего процесса хирургии. (C) Схематическое представление двухцветных экспериментов по кальциевой визуализации. (D) Пример использования изосбестического сигнала для вычисления сигнала, скорректированного с изменением движения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2. Изображения ключевых процедур изготовления и хирургии. (A) Изготовленный патчкорд, готовый к записи. (B) Мультиволоконная решетка, помещённая в индивидуальный стереотаксический держатель с сверлом размером 0,25 мм x 5,5 мм, расположенной над сквозным отверстием для волокна. (C) Многоволоконный массив с очищенными сквозными отверстиями и приклеенными шестигранными гайками. (D) Разрезание волокна с помощью волокнистого приписчика. (E) Многоволоконный массив со всеми волокнами, приклеенными суперклеем и размещёнными на индивидуальную полировочную шайбу. (F) Увеличенный вид того, как выравнивать и прикручивать разъём патчкорда к мультиволоконному массиву. (G) Полностью собранный мультиволоконный массив с приклеенными штифтами. (H) Мышь, прикреплённая к стереотаксической раме с разрезом на коже головы, чтобы обнажить череп. (I) Изготовленная многоволоконная решетка, прикреплённая к стереотактическому манипулятору для управления мультифибром во время операции. (J) Увеличенный вид многоволоконного массива, опускаемого в мозг. (K) Многоволокнистый массив полностью опущен и прикреплен к черепу зубным цементом. (L) Мультиволоконный массив на животном, надёжно подключённый к патчкорду перед записью. (M) Изображение животного в клетке с подключением патчкорда до и/или во время записи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3. Спектральное разделение. Примеры примеров демонстрируют минимальную спектральную перекрёстную связь между кальциевыми индикаторами. Сигналы GCaMP6f (синий) демонстрируют устойчивую активацию во время возбуждения 470 нм, но незначительную реакцию на возбуждение 560 нм. Сигналы jRCaMP1b (красный) демонстрируют обратный рисунок с сильной активацией от 560 нм, но минимальным откликом на освещение 470 нм. (A) Одновременно записывались сигналы GCaMP6f и jRCaMP1b с освещением только 470 нм. (B) То же, что и (a), но с освещением только 560 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4. Сравнение различных методов мультиволоконной обработки сигналов. (A) Схема, изображающая многосайтовую регрессионную коррекцию фотометрического сигнала. Этот подход включает последовательные этапы обработки, при которых все доступные 415-нм изосбестические сигналы линейно соотносятся с каждым кальциезависимым сигналом. Предсказанные компоненты движения вычитаются из этого сигнала для получения итогового показания активности. z-баллированные сигналы ΔF/F от двух сигналов с выраженным наличием артефактов движения. (B) Сверху вниз: изосбестовый сигнал из того же волоконного/изображенного канала, отображающий артефакты движения, сглаженный только RCaMP (слева) или GCaMP (справа) (медианно-фильтрованный, зелёный), тот же сигнал с регрессионной корректировкой по оптоволокном/каналу изображения (циан), многоволоконный регрессионный сигнал (синий). (C) Слева: средний балл высокочастотного шума для каждого записанного сигнала (n = 21 сессия). Высокочастотный шум вычисляется как стандартное отклонение первой производной каждого сигнала. Оценки шума показаны для 1) сигнала с корректированной базовой линией, но некорректированного сигнала (серый), 2) сигнала с коррекцией базовой линии и медианной фильтрации (розовый), 3) сигнала с корректированной регрессией базовой и одноволокнистой линии с сглаживанием Савицкого-Голея (циан), и 4) сигнала с коррекцией регрессии по базовой и многоволоконной линии с сглаживанием Савицкого-Голея (синий). Центр: средний процент шума, удалённый только с помощью сглаживания, одноволоконной или многоволоконной регрессии, агрегированных по всем 23 сигналам. Процент удалённого шума рассчитывается как доля высокочастотного шума, возникающего в результате коррекции относительно общего уровня шума в сыром сигнале, скорректированном на базовую линию. Данные отображаются как среднее ± SEM (тест Крускал-Уоллис, H = 501.9420, p < 0.001; пост-хок тесты Mann-Whitney U с коррекцией Бонферрони: сглаженная против односайтовой регрессии ***p < 0.001, сглаженная против многосайтовой регрессии***p < 0.001, одноместная против многоточочной **p = 0.0073). Справа: Процент сигналов, при которых высокочастотный шум статистически отличается после коррекции на основе регрессии с одним волоконным и мультиволоконным режимом, разделённый по типу сигнала. Для каждого из 23 сигналов уровни шума после коррекции на одном участке сравнивались с уровнями шума после коррекции на несколько точек с помощью независимых t-тестов (если они распределены нормально), либо тестов Mann-Whitney U (непараметрическая альтернатива). Синие сегменты указывают на сигналы, где коррекция на несколько точек приводила к значительно меньшему шуму, чем коррекция на одном сайте (p < 0,05). Серые сегменты указывают на сигналы без значительной разницы между методами коррекции. Циановые сегменты указывают на сигналы, где коррекция на одном месте приводила к значительно снижению шума. E: Vgat- GCaMP6f. ДА: ХВАТАЙ-ДА. I: Vgat+ jRCaMP1b. (D) То же самое, что и (C), но с изображением вариативности кадра к кадру (джиттер), рассчитанной как производная коэффициента вариации каждого сигнала (тест Крускаля-Уоллиса, H = 495.6685, p < 0.001; пост-хок тесты Mann-Whitney U с коррекцией Бонферрони: сглаженная против односайтовой регрессии ***p < 0.001, сглаженная против многоточочной регрессии***p < 0.001, одноточковая против многоточочной ***p = 0.0006). Полный список статистических тестов и результатов см. Таблицу 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 5. Многопрофильная демонстрация двухцветной фотометрии волокон. Репрезентативные сигналы от нескольких типов индикаторов, фиксируемые одновременно во время социального поведения (тест резидент-незваный гость, эпоха входа незваного гость). Следы показывают ненормализованные и исходно-вычитаемые, но не корректированные артефактами движения GCaMP6f (Cre-отрицательные нейроны), jRCaMP1b (ГАМКергические Vgat-Cre+ нейроны) и GRAB-DA1m (дофаминовый сенсор в ядре accumbens) на сайтах социальных поведенческих сетей у одного и того же животного. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1. Координаты вируса и длина волокон для каждой целевой области мозга социальной поведенческой сети. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2. Сравнение методов коррекции артефактов движения для многопрофильной фотометрии волокон . Основные принципы, оптимальные сценарии использования, преимущества и ограничения следующих методов коррекции артефактов движения: простая линейная регрессия, регрессия Лассо с регрессией L1 (с использованием мультипредикторного подхода), байесовское генеративное моделирование, частотное масштабирование и итеративно перевзвешенные наименьшие квадраты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 3. Детали и результаты статистических тестов, использованных на рисунке 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительный файл 1. Файл 3D-печати для разъёма патчкорда.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 2. 3D печать для разъёма патчкорда без сквозных отверстий.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 3. 3D печать для стереотактического сверлящего аксессуара.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 4. Индивидуальный чертёж шайбы для полировки.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 5. 3D печатный файл для многосайтового фотометрического массива, ориентированного на 12 сайтов SBN.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 6. 3D печатный файл для многосайтового фотометрического массива без сквозных отверстий, направленных на сайты.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 7. Конфигурационный файл DAQ для программного обеспечения DAQ.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 8. Файл визуального кодирования для фотометрической системы.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 9. Код на Python, используемый в Протоколе Step 4 и для сравнений, корректирующих артефакты движения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетчаточная фотометрия — это полезная и экономичная методика для фиксации популяционной активности кальция из глубоких областей мозга или определённых типов клеток у свободно движущегося^{животного.} Запись из нескольких областей мозга одновременно позволяет пользователю сравнивать динамику между областями или проекциями во время натуралистического поведения или подготовки к фиксированной голове⁽^5,7,12). Здесь мы подробно описываем методы записи двумя цветами из до 12 областей мозга в подкорковой «сети социального поведения» мозга с использованием специального волоконного массива и коммерчески доступной системы камер. Ниже мы обсуждаем ключевые шаги внедрения этого метода, возможные изменения и стратегии устранения неполадок, а также его значимость и ограничения по сравнению с существующими подходами.

Протокол включает три основных этапа. Во-первых, изготовление многоволоконных массив и патчкордов требует сверления индивидуальных 3D-печатных деталей по стереотактическим координатам, затем вставки волокон, полировки и контроля качества для обеспечения эффективности светопропускания ≥75%. Точное выравнивание сверления (допуск ±0,03 мм) и тщательная полировка имеют решающее значение. Распространённые неисправности включают низкую эффективность светопропускания (<75%) и забитые сквозные отверстия волокна. Низкая эффективность обычно возникает из-за дефектов волокна при расщеплении или неправильной полировки. Решения включают проверку безупречности каждого конца волокна при микроскопии с яркими полями перед вставкой (шаг 1.1.6.2), повторную полировку с использованием полной последовательности зернистости (6 мкм → 0,01 мкм, шаг 1.1.6.1), а также проверку остроты лезвия волокнистого тесака. Для повышения пропускной способности лаборатории могут внедрять модификации рабочих процессов, такие как индивидуальные шаблоны для резки волокон с использованием этапов точного перевода или лазерных систем резки (шаг 1.2.4). Производители коммерческой 3D-печати с высокоточными системами могут снизить потребности в ручном сверлении (шаги 1.1.3–1.1.4, шаг 1.2.3), хотя точность размеров может варьироваться между партиями.

Во-вторых, хирургическая имплантация включает выравнивание черепа (толерантность ±0,03 мм), вирусные инъекции в 11–12 участках и имплантацию мультиволокнистого массива, а затем фиксацию цементом. Точность прицеливания снижается, когда выравнивание черепа превышает допустимые допустимые нормы. Это можно смягчить, измеряя шаг в нескольких передних и задних точках на расстоянии 8,25 мм друг от друга и измеряя катушку в боковых позициях ±2,0–2,5 мм, при этом обеспечивая полную стабилизацию черепа с ушными планками. Пузырьки воздуха в микропипетках для инъекции вирусов препятствуют точной доставке и требуют возобновления подготовки микропипеток (шаг 2.9). Во время имплантации многоволокнистого массива избегайте контакта цемента с кончиками волокна, строя цементные пирамиды от поверхности черепа вверх (шаги 2.10.3–2.10.5) и обеспечивайте достаточное время сушки (≥15 мин).

В-третьих, запись и обработка данных включают синхронизацию камеры с помощью системы DAQ, калибровку питания светодиодов (выход 0,1 мВт по оптоволокну, 1,2 мВт выход/12-волоконный патчкорд) и предварительную обработку сигнала с изосбестическими элементами управления. Конвейер коррекции движения, представленный здесь, использует регрессию лассо, которая хорошо подходит для многоканальных конфигураций предикторов, поскольку автоматически сжимает неинформативные предикторы до нуля, сохраняя только те, что существенно способствуют коррекции артефактов. Это свойство делает его особенно выгодным для двухцветной фотометрии: включая изосбестические сигналы как из красных, так и из зелёных каналов в качестве предикторов, Lasso избирательно использует каналы, передающие подлинную информацию о движении, обеспечивая значительно лучшее снижение шума в сигналах красного канала (RCaMP) по сравнению с коррекцией одного волокна (рисунок 4C–D)). Поскольку Lasso автоматически определяет наиболее информативные предикторы, настоятельно рекомендуется использовать все доступные изосбестические каналы в качестве входа. Тем не менее, регрессия лассо — один из нескольких допустимых методов коррекции; альтернативы включают байесовское генеративное^{моделирование 46}, частотное^{масштабирование 47} и итеративно перевзвешенные наименьшие квадраты (IRLS⁾⁴⁸, все они, вероятно, дают сопоставимую редукцию артефактов, с рекомендациями по реализации в Таблице 2. Сохраняющееся плохое качество сигнала, несмотря на оптимизированную предобработку, вероятно, указывает на аппаратные или хирургические проблемы, поэтому шаги 1–2 следует пересмотреть

Помимо этих процедурных аспектов, двухцветная фотометрия вносит дополнительные технические сложности, связанные со спектральной сепарацией. Важным аспектом в двухцветной фотометрии является управление спектральным перекрытием между зелёным и красным кальциевыми индикаторами. Хотя полное устранение спектральных перекрёстных контактов сложно из-за перекрывающихся эмиссионных спектров GCaMP и RCaMP, наш временной мультиплексный подход с интерливированным светодиодным возбуждением (470 нм для GCaMP, 560 нм для RCaMP, 415 нм изосбестовых) и оптимизированными фильтрами пропускающего излучения существенно смягчают эту проблему. На практике мы наблюдаем минимальную перекрёстную активность: стимуляция 470 нм вызывает незначительную активность в красном канале, и наоборот при стимуляции 560 нм в зелёном канале (рисунок 3). Исследователи, обеспокоенные остаточным спектральным перекрытием, могут дополнительно оптимизировать свои системы, выбирая узкополосные эмиссионные фильтры с максимальным спектральным разделением на основе их специфических комбинаций индикаторов.

По сравнению с другими подходами к крупномасштабным нейронным записям, индивидуальная двухцветная многоцелевая фотометрия волокна обладает множеством значительных преимуществ. Во-первых, в то время как одноволокнистая^{фотометрия} ^1,2,3, современные внеклеточные^записи ^4,6 или подходы к корковой поверхности ^8,9 ограничены одной или пространственно ограниченной областью мозга (например, на корковой поверхности), настраиваемый 3D-печатный дизайн, который мы здесь используем, позволяет нацеливать до 12 областей мозга в любую часть мозга с оптическими волоконами 200 мкм. Для сравнения, коммерчески доступные мультиволоконные^{феррулы} ^5,7 поддерживают только оптоволоконную оптику диаметром 100 мкм и аналогично ограничены ограниченным набором областей мозга, непосредственно вентрально от линейного массива феррула. Что касается наведения и записи из определённых областей мозга, основной компромисс — между диаметром волокна и полем зрения фотометрической системы. 3D-печатные мультиволоконные массивы с волокнами 200 мкм записывают с большей площадки на каждом объекте по сравнению с коммерчески доступными многоволоконными феррулами. В текущем протоколе поле зрения камеры фотометрической системы ограничивает запись 12 оптическими волоконами при 200 мкм. Это ограничение можно преодолеть, уменьшив диаметр волокна до 100 мкм для до 60 волокон или построив индивидуальную фотометрическую систему с более крупным объективом камеры.

Наконец, эта настраиваемая двухцветная многопрофильная фотометрическая платформа для волокна используется для продольного отслеживания динамики нейронной активности двух генетически разных нейронных популяций в 11-12 областях мозга. Используя стратегию Cre-in/Cre-исключающей, экспрессирующую Cre-зависимый RCaMP и Cre-исключающий GCaMP среди популяций SBN у мыши Vgat-cre, было показано, что как агрессивный опыт, так и наблюдение способствуют общим паттернам динамики активности по всему SBN во время будущих защитных социальных^{взаимодействий 42}. Используя ту же вирусную стратегию у мыши Esr1-cre для записи с нейронов, экспрессирующих эстрогеновых рецепторов альфа, и неэкспрессирующих нейронов, территориально-специфические паттерны социального поведения были связаны с быстрым, чувствительным к гормонам перераспределением кода социального действия по всему SBN, что усиливает активность, связанную с поведением, в домашней^{территории 43}. Эти территориально-специфичные различия в поведении и сетевом кодировании требуют циркулирующего тестостерона у самцов мышей. Хотя в этих исследованиях использовался вирусный подход и единая линия Cre, будущие исследования могут расширить эти методы, используя интерсекциональные вирусные подходы, генетически экспрессированные кальциевые индикаторы или флуоресцентные репортеры нейромодуляторной и нейропептидной сигнализации.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ни одного.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Финансирование осуществлялось от NIH K99MH135212 (к E.M.G.), NIH F32MH126562 (к E.M.G.), DP2MH126375 (к A.L.F.), NIH R01MH126035 (к A.L.F.), NYSCF (к A.L.F.), фонду Саймонса (SCGB) (к A.L.F.), фонду Клингенштейна (к A.L.F.) и стипендии Альфреда П. Слоуна (для A.L.F.), Фонда Макнайта (A.L.F), Институт Аллена (A.L.F). A.L.F. — исследователь Робертсона Нью-Йоркского фонда стволовых клеток.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Сверло #76	Город буровых долочек	#76
Сверло #78	Город буровых долочек	#78
Сверло #92	Город буровых долочек	#92
0,01 и мю; Листы для полировки с зерном	ThorLabs	LFCF2
Сверла размером 0,25 мм x 5,5 мм	Город буровых долочек	Индивидуальный продукт	Сверло размером 0,25 x 5,5 мм, связался с компанией для сборки
1 и мю; Листы для полировки с зерном	ThorLabs	LF1D
12 Волокно-ветвящийся патчорд	Дорическая линза	CustomBBP(12)_200/220/3000-0.37 _5m_SMA-12xCL_LAF
200 и мю; Оптическое волокно m	ThorLabs	FT200UMT
3 μ Листы для полировки с зерном	ThorLabs	LF3D
30 & MU; Листы для полировки с зерном	ThorLabs	LF30D
6 μ Листы для полировки с зерном	ThorLabs	LF6D
Впитываемый шов	Ethicon	J421H
Адаптивная итеративно перевзвешенная документация штрафных наименьших квадратов	Google	Н/Д	https://code.google.com/archive/p/airpls/
Штифты из легированной стали	МакМастер-Карр	98381a983
Поведенческие камеры	Teledyne FLIR	Блэкфлай С
Бонсай	Bonsai Software Foundation	Версия 2.9.0
Микроскоп Brightfield	Leica	ES2
Бульдогские зажимы	FineScienceTools	18038-45
DAQ	Измерительные вычисления	MC USB-200 серии DAQ
Программное обеспечение DAQ	Измерительные вычисления	DAQami
Бур	Kopf Instruments	Стереотаксическая дрель модели 1911 года
Волоконный тесак	ThorLabs	XL411/CLVB
Система фотометрии волокон	Нейрофотометрия	FP3002
Руководство по системе фотометрии с волокном	Нейрофотометрия	Н/Д	Руководство по устройству хостинга веб-страниц: https://neurophotometrics.com/documentation
Волокнистый скрайкер	ThorLabs	S90C
Волокнистый стриппер	ThorLabs	T10S13
Тонкие щипцы	FineScienceTools	11252-00
Тонкие ножницы	FineScienceTools	14084-08
Винты привода G5	Открытая площадка производства Ephys	OEPS-7105
Отвёртка G5	Открытая площадка производства Ephys	OEPS-7121
GCaMP6f	Лаборатория вирусной нейроинженерии PNI	EF1a-Cre выходит-GCaMP6f-WPRE-hGHpA
GRAB-DA	Addgene	hSyn-GRAB_DA1m-WPRE-hGHpA
Грелка	Adroit Medical Supplies	HTP-1500
Система отопления	Кент Сайентифик	RT-0515
Изофлуран	Коветрус	29405
jRCaMP1b	Addgene	pAAV.Syn.Flex.NES-jRCaMP1b.WPRE.SV40
Латунные шестигранные гайки M0.6	MetricScrews.us	21614
Реагенты и инструменты для метабондного цемента	Паркелл	S380
MicroFine ABS-подобные смоляные 3D-печати	ProtoLabs	Индивидуальный продукт	См. дополнительные кодовые файлы 1-3, 5, 6
Нанолитровый инжектор	Драммондская научная компания	Nanoject II	Нанолитровый инжектор
Восковые листы Parrafin	Амкор	Универсальная лабораторная плёнка ParaFilm M
Пипетка	ThermoFisher Scientific	4641310N
Полировочный Пак	Машиностроительный цех физического факультета Принстонского университета	Индивидуальный продукт	См. Дополнительный кодовый файл 4
Пауэрметр	ThorLabs	PM100D
Оптическая мазь Puralube	Дехра	P1490-1
Python	Фонд программного обеспечения Python	Н/Д
Мягкая пластиковая трубка для патчкорда	МакМастер-Карр	3774N4
SpinView	Teledyne FLIR	версия 1.25.0.52	Программное обеспечение для обработки изображений, управляющее камерами поведения
Стереотактический кадр	Kopf Instruments	Модель 1900 года
Документация TMAC	Н/Д	Н/Д	Код TMAC: https://github.com/Nondairy-Creamer/tmac
Трубка для стереотактической рамки	Сен-Гобен	E-3603
Вапорайзер	Кент Сайентифик	Вапорайзер VetFlo

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cui, G., et al. Concurrent activation of striatal direct and indirect pathways during action initiation. Nature. 494 (7436), 238-242 (2013).
Adelsberger, H., Zainos, A., Alvarez, M., Romo, R., Konnerth, A. Local domains of motor cortical activity revealed by fiber-optic calcium recordings in behaving nonhuman primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (1), 463-468 (2014).
Gunaydin, L. A., et al. Natural Neural Projection Dynamics Underlying Social Behavior. Cell. 157 (7), 1535-1551 (2014).
Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
Sych, Y., Chernysheva, M., Sumanovski, L. T., Helmchen, F. High-density multi-fiber photometry for studying large-scale brain circuit dynamics. Nature Methods. 16 (6), 553-560 (2019).
Steinmetz, N. A., et al. Neuropixels 2.0: A miniaturized high-density probe for stable, long-term brain recordings. Science. 372 (6539), (2021).
Guo, Z., et al. Neural dynamics in the limbic system during male social behaviors. Neuron. 111 (20), 3288-3306.e4 (2023).
Ma, Y., et al. Wide-field optical mapping of neural activity and brain haemodynamics: considerations and novel approaches. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1705), 20150360(2016).
Musall, S., Kaufman, M. T., Juavinett, A. L., Gluf, S., Churchland, A. K. Single-trial neural dynamics are dominated by richly varied movements. Nature Neuroscience. 22 (10), 1677-1686 (2019).
Zhou, Z. C., et al. Deep-brain optical recording of neural dynamics during behavior. Neuron. 111 (23), 3716-3738 (2023).
Martianova, E., Aronson, S., Proulx, C. D. Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals. JoVE. (152), e60278(2019).
Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13 (4), 325-328 (2016).
Newman, S. W. The Medial Extended Amygdala in Male Reproductive Behavior A Node in the Mammalian Social Behavior Network. Annals of the New York Academy of Sciences. 877, 242-257 (1999).
Goodson, J. L. The vertebrate social behavior network: Evolutionary themes and variations. Hormones and Behavior. 48 (1), 11-22 (2005).
O’Connell, L. A., Hofmann, H. A. Evolution of a Vertebrate Social Decision-Making Network. Science. 336 (6085), 1154-1157 (2012).
Wu, M. V., Tollkuhn, J. Estrogen receptor alpha is required in GABAergic, but not glutamatergic, neurons to masculinize behavior. Hormones and Behavior. 95, 3-12 (2017).
Moffitt, J. R., et al. spatial, and functional single-cell profiling of the hypothalamic preoptic region. Science. 362 (6416), eaau5324(2018).
Gegenhuber, B., Wu, M. V., Bronstein, R., Tollkuhn, J. Gene regulation by gonadal hormone receptors underlies brain sex differences. Nature. 606 (7912), 153-159 (2022).
Knoedler, J. R., et al. A functional cellular framework for sex and estrous cycle-dependent gene expression and behavior. Cell. 185 (4), 654-671.e22 (2022).
Musatov, S., Chen, W., Pfaff, D. W., Kaplitt, M. G., Ogawa, S. RNAi-mediated silencing of estrogen receptor in the ventromedial nucleus of hypothalamus abolishes female sexual behaviors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (27), 10456-10460 (2006).
Lee, H., et al. Scalable control of mounting and attack by Esr1+ neurons in the ventromedial hypothalamus. Nature. 509 (7502), 627-632 (2014).
Hashikawa, K., et al. Esr1+ cells in the ventromedial hypothalamus control female aggression. Nature Neuroscience. 20 (11), 1580-1590 (2017).
Fang, Y. -Y., Yamaguchi, T., Song, S. C., Tritsch, N. X., Lin, D. A Hypothalamic Midbrain Pathway Essential for Driving Maternal Behaviors. Neuron. 98 (1), 192-207.e10 (2018).
Wei, Y. -C., et al. Medial preoptic area in mice is capable of mediating sexually dimorphic behaviors regardless of gender. Nature Communications. 9 (1), 279(2018).
Yamaguchi, T., Wei, D., Song, S. C., Lim, B., Tritsch, N. X., Lin, D. Posterior amygdala regulates sexual and aggressive behaviors in male mice. Nature Neuroscience. 23 (9), 1111-1124 (2020).
Yang, B., Karigo, T., Anderson, D. J. Transformations of neural representations in a social behaviour network. Nature. , (2022).
Jacobowitz, D. M., O’Donohue, T. L. alpha-Melanocyte stimulating hormone: immunohistochemical identification and mapping in neurons of rat brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (12), 6300-6304 (1978).
Flanigan, M. E., et al. Orexin signaling in GABAergic lateral habenula neurons modulates aggressive behavior in male mice. Nature Neuroscience. 23 (5), 638-650 (2020).
Bayless, D. W., et al. A neural circuit for male sexual behavior and reward. Cell. 186 (18), 3862-3881.e28 (2023).
Dawson, M., et al. Hypocretin/orexin neurons encode social discrimination and exhibit a sex-dependent necessity for social interaction. Cell Reports. 42 (7), 112815(2023).
Iyilikci, O., et al. Age-specific regulation of sociability by hypothalamic Agrp neurons. bioRxiv. , (2025).
Patriarchi, T., et al. Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics with designed genetically encoded sensors. Science. 360 (6396), eaat4422(2018).
Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496.e19 (2018).
Sun, F., et al. Next-generation GRAB sensors for monitoring dopaminergic activity in vivo. Nature Methods. 17 (11), 1156-1166 (2020).
Duffet, L., et al. A genetically encoded sensor for in vivo imaging of orexin neuropeptides. Nature Methods. 19 (2), 231-241 (2022).
Ino, D., Tanaka, Y., Hibino, H., Nishiyama, M. A fluorescent sensor for real-time measurement of extracellular oxytocin dynamics in the brain. Nature Methods. 19 (10), 1286-1294 (2022).
Wang, H., et al. A tool kit of highly selective and sensitive genetically encoded neuropeptide sensors. Science. 382 (6672), eabq8173(2023).
Dong, C., et al. Unlocking opioid neuropeptide dynamics with genetically encoded biosensors. Nature Neuroscience. 27 (9), 1844-1857 (2024).
Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. eLife. 5, e12727(2016).
Zhang, Z. -M., Chen, S., Liang, Y. -Z. Baseline correction using adaptive iteratively reweighted penalized least squares. The Analyst. 135 (5), 1138(2010).
Iravedra-Garcia, J. M., Guthman, E. M., Cuturela, L., Ocasio-Arce, E. J., Pillow, J. W., Falkner, A. L. Aggression experience and observation promote shared behavioral and neural changes. bioRxiv. , (2024).
Guthman, E. M., Iravedra-Garcia, J. M., Sirrs, L., Le, A., Falkner, A. L. Context rescales a social action code in a hormone-sensitive network. bioRxiv. , (2025).
Zhang, Z. -M., Chen, S., Liang, Y. -Z. Baseline correction using adaptive iteratively reweighted penalized least squares. The Analyst. 135 (5), 1138(2010).
Saunders, A., Johnson, C. A., Sabatini, B. L. Novel recombinant adeno-associated viruses for Cre activated and inactivated transgene expression in neurons. Frontiers in Neural Circuits. 6, (2012).
Creamer, M. S., Chen, K. S., Leifer, A. M., Pillow, J. W. Correcting motion induced fluorescence artifacts in two-channel neural imaging. PLOS Computational Biology. 18 (9), e1010421(2022).
Donka, R. M., Loh, M. K., Konanur, V. R., Roitman, M. F., Roitman, J. D. PASTa: An Open-Source Analysis and Signal Processing Toolbox for Fiber Photometry Data. Current Protocols. 5 (7), e70161(2025).
Keevers, L. J., Jean-Richard-dit-Bressel, P. Obtaining artifact-corrected signals in fiber photometry via isosbestic signals, robust regression, and dF/F calculations. Neurophotonics. 12 (02), (2025).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Двухцветные мультиволоконные фотометрические записи сети социального поведения у мышей

В этой статье

Краткое содержание

Аннотация

Введение

Протокол

Результаты

Обсуждение

Раскрытие информации

Благодарности

Материалы

Ссылки

Перепечатки и разрешения

Теги

Похожие статьи