Очистка и идентификация антимикробного белка из зелёной водоросли tetraspora sp. CU2551

Tanaporn Klinsanit; Yothawut Tonawut; Natwikar Laokua; Rawirat Pansomsuay; Wanthanee Khetkorn; Cherdsak Maneeruttanarungroj

doi:10.3791/70066

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Очистка и идентификация антимикробного белка из зелёной водоросли tetraspora sp. CU2551

329 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70066

⸱

17 февраля 2026 г.

Tanaporn Klinsanit¹ , Yothawut Tonawut¹ , Natwikar Laokua¹ , Rawirat Pansomsuay¹ , Wanthanee Khetkorn² , Cherdsak Maneeruttanarungroj¹^,³

¹Department of Biology, School of Science, King Mongkut's Institute of Technology Ladkrabang, ²Division of Biology, Faculty of Science and Technology, Rajamangala University of Technology Thanyaburi, ³Bioenergy Research Unit, School of Science, King Mongkut's Institute of Technology Ladkrabang

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает рабочий процесс для изучения целых антимикробных белков с использованием различных методов, включая оптимизацию буферов экстракции белков, нарушение водорослей клеток, фракционирование белков с помощью ионообменной хроматографии, разделение белков с помощью SDS-PAGE и антимикробные анализы активности. Активный белок был впоследствии подтверждён и идентифицирован с помощью анализа LC-MS/MALDI-TOF.

Аннотация

Антимикробная резистентность (АМР) — это растущая глобальная угроза здоровью, требующая открытия новых антимикробных препаратов. Белки и пептиды, полученные из водорослей, привлекают всё больше внимания благодаря своему биоактивному потенциалу; однако стандартизированные протоколы исследования антимикробных пептидов (АМП) в зелёных водорослях, особенно Tetraspora sp. CU2551, остаются ограниченными. Этот протокол описывает пошаговый рабочий процесс по выделению, очистке и характеристике антимикробных целых белков из зелёной водоросли Tetraspora sp. CU2551. Процедура включает оптимизированную экстракцию белка, хроматографическую фракционирование, электрофоретическое отделение, скрининг антимикробной активности и идентификацию белков. Условия экстракции белка сначала оптимизируются для снижения фоновых ингибирующих эффектов, исходящих от буферных компонентов. Когда идентичность активного пептида неизвестна, применяется анализ с вытяжением вниз для оценки связывания белков между разными ионообменными смолами и для выбора подходящей матрицы очистки. DEAE-сефарозная ионообменная хроматография является подходящим методом обогащения антимикробных белковых фраций. Все фракции систематически оцениваются на антимикробную активность и анализируются SDS-PAGE. Белковая полоса, соответствующая самой высокой антимикробной активности, а также особо выраженный электрофоретический профиль, удаляется и подвергается анализу LC-MS/MALDI-TOF для идентификации белков. Рабочий процесс дополнительно дополняется in silico анализами для прогнозирования свойств, связанных с антимикробными пептидами, с использованием общедоступных биоинформатических инструментов. Этот протокол предоставляет универсальную основу для открытия антимикробных белков и может легко адаптироваться к другим видам водорослей и смежным биотехнологическим приложениям.

Введение

Антимикробная резистентность (АМР) представляет собой растущую глобальную проблему^{здравоохранения 1}, подчёркивая важность постоянных стратегий выявления новых антимикробных агентов из природных источников. Хотя всё больше исследований по антимикробным свойствам белков и пептидов, полученных из^{водорослей} ^2,3. Большинство исследований сосредоточены на методах на основе пептидов или^{гидролизата 4}, а стандартизированные методы сохранения и оценки активности целых белков водорослей остаются^{ограниченными 5}. В этой статье описывается метод, направленный на выделение, очистку и оценку целостных белков зелёной водоросли Tetraspora sp. CU2551 на антимикробную активность.

Протокол описывает пошаговый процесс, включающий экстракцию целых белков, фракционирование с помощью ионообменной хроматографии, оценку антибактериальных свойств, разделение белков на основе геля, идентификацию белков с помощью масс-спектрометрии и прогнозирование антимикробных пептидов с использованием технологий in silico. Эффективность антибактериальных препаратов оценивается с помощью стандартных тестов на диффузию агара и ингибирования роста жидкости на типичных грамположительных и грамотрицательных бактериальных^{штаммах} ^4,6. Этот подход позволяет связывать выявленную антимикробную активность с определёнными белковыми фракциями или электрофоретическими диапазонами, а не полагаться только на переваренные пептидные смеси или исключительно на вычислительные прогнозы, которые могут не выявить антимикробные белки или последовательности, похожие на АМФ, вне канонических определений^{баз данных} ^7,8.

Следование этому протоколу позволяет читателям надежно получать биоактивные белковые фракции, содержащие потенциальные антимикробные белковые последовательности, подходящие для будущей валидации и оценки функционала. Репрезентативные результаты указывают на выявление биоактивных фракций, содержащих как известных, так и неизвестных кандидатов в белки. Этот протокол предоставляет универсальную и практическую основу для идентификации антимикробных веществ из целых белков, полученных из водорослей и других биологических источников.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

В этом исследовании не участвовали люди, животные или позвоночные. Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с институциональными рекомендациями по биобезопасности и этике исследований Школы науки Института технологий короля Монгкута в Ладкрабанге (KMITL), Таиланд. Все микробные эксперименты проводились в лабораторных условиях уровня биобезопасности 2 (BSL-2), следуя стандартам ВОЗ и национальному стандарту биобезопасности⁹.

Во всех экспериментальных процедурах надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты, включая лабораторные халаты, перчатки и маски для лица. Собирайте и утилизируйте химические и серебросодержащие отходы в соответствии с институциональными руководящими принципами по управлению опасными отходами перед отправкой их лицензированной компании по управлению отходами.

Приготовьте концентрированные растворы опасных химикатов, включая сульфат натрия, β-меркаптоэтанол и реагенты для окрашивания серебра, содержащие формальдегиды, в химическом выхлопчике. Проводить эксперименты с использованием низких рабочих концентраций и малых объёмов на лабораторном столе в соответствии со стандартными практиками лабораторной безопасности.

1. Культура водорослей

ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте асептические условия на протяжении всего выращивания водорослей.

Подготовка стартовой культуры
1. Подготовьте стерильную среду TAP (pH 7,0)¹⁰ и впустите 150 мл в стерильные колбы Эрленмайера объёмом 500 мл.
2. Инокуляция среды 1% (v/v) инокулума на ночную культуру Tetraspora sp. CU2551 с использованием асептической техники в шкафе класса I для биобезопасности.
3. Инкубировать культуры в оснащённом светом инкубаторе при 35 °C, 120 об/мин и 45,9 мкмоль/^{м 2}/с в течение 48 часов. Используйте полностью взрослую культуру как старт для масштабирования культуры.
Масштабируемая культура и сбор клеток
1. Переложите 25 мл стартовой культуры в 275 мл свежей стерильной среды TAP. Инкубировать культуры в одинаковых условиях в течение 48 часов.
2. Собирайте клетки водорослей центрифугой при 3 800 × г в течение 15 минут при 25 °C.
3. Промыйте гранулы один раз стерильной дистиллированной водой и снова центрифугуйте при 3 800 × г в течение 15 минут при 25 °C.
4. Полностью удалите супернатант и храните гранулы водорослей при −20 °C до дальнейшей обработки.

2. Формулировка буфера лизиса и скрининг фонового ингибитора

ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с SDS и β-меркаптоэтанолом в резиновых или нитриловых перчатках. Откройте концентрированную бутылку β меркаптоэтанола в вытяжке с химическим паром.

Подготовка буфера после лизиса
1. Подготовьте эталонный буфер^{лизиса 11} , состоящий из 10 мМ Tris-HCl (pH 9,0), дополненного 0,1 % с в/v SDS и 38 мМ β-меркаптоэтанола.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Критический шаг: оптимизировать концентрации SDS и β-меркаптоэтанола, чтобы избежать ложноположительной антимикробной активности.
2. Подготовьте полные факториальные наборы буфера лизиса путём варьирования додецилсульфата натрия (SDS) (0, 0,01, 0,05 или 0,1% w/v) и β-меркаптоэтанола (0, 0,5, 1 или 2 мМ), получая 16 формул.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Составы всех тестируемых составов буфера лизиса приведены в таблице 1. Добавьте β-меркаптоэтанол непосредственно перед использованием.
Фон антимикробного скрининга
1. Используйте перфоратор, чтобы подготовить диски диаметром 6 мм из бумаги No42 Whatman. Нанесите по 5 мкл каждой формулы буфера лизиса на буфер на бумажный диск и проведите диффузионные анализы в соответствии с рекомендациями^{CLSI 6}. Инкубировать пробные пластины при 37 °C в течение 20 часов и оценить зоны торможения.
  1. Тестовые формулы против Bacillus subtilis TISTR 1248, Staphylococcus aureus TISTR 746, Escherichia coli TISTR 074 и Pseudomonas aeruginosa TISTR 2370.
2. Выберите формулу, не демонстрирующую ингибирующую активность для последующего извлечения белка.

3. Извлечение белка

ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте образцы при низкой температуре во время соникации и центрифугирования.

Разморозить замороженные гранулы водорослей (начиная с шага 1.2.5) при 37 °C и снова заморозить при −20 °C. Повторяйте циклы заморозки-оттаивания (-20 °C / 37 °C) 3 раза.
Добавьте оптимальный буфер лизиса (10 мМ Tris-HCl, pH 9,0, 0,01% SDS, 2 мМ β-меркаптоэтанол) к итоговому объёму 5 мл и сохраняйте образцы на льду на протяжении всей последующей обработки. Нарушить работу ячеек с помощью звуковой работы зонда (25 кГц, 500 Вт, амплитуда 40%, 1 с включения/выключения, 5 минут).
Добавьте коктейль с ингибитором протеазы согласно инструкции производителя и аккуратно перемешайте.
Центрифуга лизирует при 3 800 × г в течение 15 минут при 4 °C и собирает супернатант в виде сырого белкового экстракта.
Экстракты проясняют центрифугой при 10 000 × г в течение 10 минут при 4 °C. Соберите и храните супернатанты при 4 °C.

4. Оценка антимикробной активности

Дисковые диффузионные анализы
1. Культивировать патогенные бактерии (Bacillus subtilis TISTR 1248, Staphylococcus aureus TISTR 746, Escherichia coli TISTR 074 и Pseudomonas aeruginosa TISTR 2370) на питательном агаре при 37 °C в течение 16–18 часов.
2. Используя стерильную алюминиевую петлю, соскребайте колонии с поверхностей агара и повторно подвесьте в 0,9% (w/v) NaCl. Отрегулируйте бактериальные суспензии до стандарта Макфарланда 0,5 и равномерно стирайте мазок на агаревые пластины Мюллера-Хинтона.
3. Разместите стерильные бумажные диски на инокуленные поверхности агар и нанесите 5 мкл тестовых образцов. Инкубировать пластины при 37 °C в течение 16-20 часов и измерять зоны торможения с помощью суппорта Вернье.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраняйте равномерное расстояние между всеми дисками.
Определение MIC и MBC
1. Приготовьте бактериальные суспензии при 2 × 10⁶ CFU/мл в 4x бульоне Мюллера-Хинтона.
2. Пипетт 50 мкл бактериальных суспензий и 100 мкл серийно разбавленных образцов белка в пластины с 96 лунками и отрегулировать все колодцы до итогового объёма 200 мкл с помощью буфера Tris-HCl 10 мМ (pH 7,5).
3. Используйте 5 мкл стрептомицина (50 мкг) в качестве положительного контроля. Используйте 10 мМ Tris-HCl (pH 7,5) и 0,9 % (с в/в) NaCl в качестве отрицательных контролей.
4. Инкубировать пластины при 37 °C в течение 20 часов и определить MIC как наименьшую концентрацию без видимого роста бактерий.
5. Аликвоты из чистых скважин на агар Мюллер-Хинтон для определения MBC.
Определение кривой роста бактерий
1. Приготовьте бактериальные суспензии при 1 × 10⁶ CFU/mL в 2x бульоне Мюллера-Хинтона.
2. Инкубировать 100 мкл бактериальной культуры с 100 мкл белковых образцов в пластине на 96 лунок при 37 °C в течение 20 часов.
3. Используйте 5 мкл стрептомицина (50 мкг) в качестве положительного контроля. Используйте стерильную дистиллированную воду, 10 мМ Tris-HCl (pH 7,5) и 500 мМ NaCl в 10 мМ Tris-HCl (pH 7,5).
4. Измеряйте OD₆₀₀ каждые 30 минут с помощью считывателя микропластин с орбитальным периодическим встряском (за 2 минуты до измерения).
5. Рассчитывайте кривые роста и конкретные темпы роста.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Высокие концентрации белков могут мешать измерениям оптической плотности.

5. Анализ с вытягиванием вниз и очистка белка

Выпадающий анализ
1. Уравновесьте смолу DEAE-сефарозу с буфером Tris-HCl 10 мМ (pH 8,0) или смолу CM-сефароз с буфером фосфатов 10 мМ (pH 7,0).
2. Смешайте 100 мкл уравновешенной смолы с 500 мкл сырого белкового экстракта, затем добавьте 100 мкл соответствующего буфера равновесия (10 мМ Трис-ГКЛ, pH 8,0 для DEAE; 10 мМ фосфатного буфера, pH 7,0 для CM). Инкубировать с мягкой инверсией (10 инверсий).
3. Кратко центрифугировать, собрать супернатант и оценить антимикробную активность с помощью дискового диффузионного анализа.
4. Выберите рабочую смолу (DEAE-сефарозу). Для оптимизации pH уравновесьте смолу с 10 мМ Tris-HCl при pH 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 или 9.0 и следуйте шагам 5.1.1–5.1.3.
5. Выберите состояние pH, демонстрирующее антимикробную активность для ионообменной хроматографии.
Очистка белка на основе ионообменной хроматографии
1. Упаковывайте смолу DEAE-сефарозу в стеклянную хроматографическую колонку (объём слоя 16 мл) и уравновесьте с буфером Tris-HCl 10 мМ (pH 7,5) при 25 °C для 10 столбцов.
2. Загрузить 15 мл сырого белкового экстракта (раздел 3.6) при расходе 8 мл/мин.
3. Промывайте колонку буфером равновесия, пока поглощение на 280 нм не опустится ниже 0,05.
4. Элютные связанные белки с использованием линейного градиента NaCl 0-500 мМ при 10 мМ Tris-HCl (pH 7,5) на 500 мл при 8 мл/мин.
5. Собирайте 5 мл фракций, контролируйте поглощение на 280 и 220 нм и храните их на льду. Храните фракции при 4 °C до проведения антимикробного скрининга и анализа белков.

6. SDS-PAGE и серебристое окрашивание

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте серебряные окраски в капюшоне с химическим дымом и наденьте соответствующие средства индивидуальной защиты. Готовьте все решения заново.

Разделяйте белковые фракции с помощью 12% SDS-СТРАНИЦА¹² и визуализируйте полосы с помощью серебряного^{окрашивания 13}.
Исключить целевые белковые диапазоны и сдать образцы для анализа MALDI-TOF MS.
Идентифицировать белки с помощью поиска в базе данных по NCBInr.

7. Прогнозирование антимикробных пептидов

Получить кандидатные белковые последовательности из анализа NCBInr.
Оценивать антимикробный потенциал с помощью общедоступных инструментов прогнозирования AMP (например, DBAASP, APD3, AMPScanner, CAMPR4) и баз данных.
Результаты прогнозирования экстракта, включая вероятностные оценки антимикробных препаратов, предсказанную классификацию и физико-химические свойства (чистый заряд, содержание гидрофобных остатков, индекс GRAVY [ExPASy ProtParam] и амфипатичность).
Интегрировать вычислительные результаты на разных платформах для приоритизирования кандидатов на антимикробные белки для дальнейшей валидации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Прогнозы in silico поддерживают выбор кандидатов и не являются окончательной классификацией антимикробных пептидов.

8. Статистическое тестирование

Проводите все эксперименты в биологических трёх экземплярах. Анализ данных с помощью одностороннего ANOVA, затем многодиапазонный тест Дункана или соответствующие пост-хок анализы с уровнем доверия 95%.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Разработанный рабочий процесс на основе целостных белков, интегрирующий оптимизированную экстракцию белка, фракционирование ионного обмена, антимикробный скрининг и идентификацию белков, успешно позволил обнаружить биоактивные белковые фракции из Tetraspora sp. CU2551. Этот протокол разработан для минимизации фоновых артефактов при сохранении целостности нативного белка, позволяя напрямую связывать антимикробную активность с определёнными хроматографическими фракциями и электроф...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для получения надёжных антимикробных показателей с использованием этого протокола необходимо тщательно контролировать несколько критически важных этапов, особенно при экстракции белка и раннем скрининге биоактивности. Оптимизация буфера лизиса крайне важна, поскольку фоновая ингибация буферных компонентов часто является источником ложноположительных результатов при скрининге антимикробных белков. Антимикробная активность, наблюдаемая в оригинальной буферной^{формуле 11}

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.

Благодарности

Эта работа была поддержана исследовательскими грантами от Школы науки Института технологий короля Монгкута Ладкрабанг, предоставленных С. Манеруттанарунгроджу (RA/TA-2566-M-013) и Института технологий короля Монгкута в Ладкрабанге, предоставленных Й. Тонавуту (KREF016329). Масс-спектрометрический анализ был проведён Отделом службы протеомики факультета медицинских технологий Университета Махидол в Таиланде.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Раствор акриламида/бисакриламида	Био-Рад Лаборатории	1610156	Для приготовления геля SDS-PAGE Категория: Химическое
Спиртовая лампа / Горелка Бунзена	Различные	—	Для асептической техники Категория: Инструмент
AMPScanner	Университет Джорджа Мейсона (Велтри и др.)	—	Инструмент прогнозирования AMP на основе глубокого обучения Категория: Программное обеспечение / База данных
Инструменты прогнозирования антимикробных пептидов (DBAASP, APD3, AMPscanner, CAMPR4)	Различные академические источники	—	Анализ AMP in silico Категория: Программное обеспечение / База данных
APD3	Лаборатория Ванга, Университет Небраски	—	База данных антимикробных пептидов Категория: Программное обеспечение / База данных
Автоклав	Томи	—	Стерилизация среды и материалов Категория: Инструмент
Шкаф биобезопасности класс I/II	Различные	—	Асептическая обработка Категория: Инструмент
BioTool 2.0	Bruker Daltonics	—	Инструмент для визуализации спектров MS и пептидов Категория: Программное обеспечение
Брэдфордский реагент	Merck	B6916	Количественная оценка белков Категория: Химические
CAMPR4	Индийский технологический институт Бомбея	—	Коллекция антимикробных пептидов Категория: Программное обеспечение / База данных
Центрифуга, Eppendorf 5415R Рефрижераторная микроцентрифуга	Эппендорф	—	Микроцентрифугирование Категория: Инструмент
Центрифуга, Thermo Scientific Megafuge 8R	Термо Фишер Сайентифик	—	Центрифугирование большого объёма Категория: Инструмент
Колонка хроматографии (стеклянная)	Различные	—	Ионообменная хроматография Категория: Стеклянная посуда
CM-Сефарозная смола	Merck	CEF100	Катионообменная смола Категория: Химические (смола)
Ватная палочка	Различные	—	Бактериальная инокуляция Категория: пластиковая керамика
Кюветт, кварц	Hellma Analytics	—	УФ-спектрофотометрия Категория: Стекло
DBAASP	Институт биоорганической химии (Россия)	—	База данных антимикробной активности и структуры пептидов Категория: Программное обеспечение / База данных
DEAE-сефарозная смола	Merck	DEFF100	Анионообменная смола Категория: химическая (смола)
Колба Эрленмайера, 100 мл	Различные	—	Выращивание водорослей Категория: Стеклянная посуда
Колба Эрленмайера, 500 мл	Различные	—	Выращивание водорослей Категория: Стеклянная посуда
Escherichia coli TISTR 074	TISTR, Таиланд	—	Тестовый микроорганизм Категория: Биологический материал
ExPASy ProtParam	Швейцарский институт биоинформатики	—	Онлайн-инструмент для вычисления физико-химических свойств белков Категория: Программное обеспечение / База данных
Формальдегид	Merck	1.04002	Серебряное окрашивание Категория: Химические
Морозильник (-20 и градусов; C)	Различные	—	Хранение образцов Категория: Инструмент
Гель-электрофорезная система (Mini-PROTEAN Tetra)	Био-Рад Лаборатории	—	SDS-PAGE Категория: Инструмент
Стеклянная пробирка (16 и 150 мм)	Pyrex / Duran	—	Образцы обращения Категория: Стеклянная посуда
Перчатки, нитрил	Различные	—	Личная защита Категория: пластиковая посуда
Коктейль с ингибитором протеазы (100 раз)	Термо Фишер Сайентифик	87786	Ингибирование протеаз Категория: Химическое вещество
Инкубатор	Различные	—	Бактериальная культура Категория: Инструмент
Шейкер инкубатора	Различные	—	Культура водорослей Категория: Инструмент
Инокуляционная петля	Любой поставщик лабораторий	—	Микробный перенос Категория: расходный материал
KCl	Merck	P5405	Подготовка буфера Категория: Химические и bbsp;
Масс-спектрометр MALDI-TOF (Рефлекс IV)	Bruker Daltonics	—	Идентификация белков Категория: Инструмент
ТАЛИСМАН	Матричная наука	—	Поисковая система идентификации белков по данным РС Категория: Программное обеспечение / База данных
ТАЛИСМАН 2.2	Матричная наука	—	Идентификация белков Категория: Программное обеспечение
Измерительный цилиндр	Пирекс	—	Размер объёма Категория: Стеклянная посуда
Микроцентрифугальная трубка (1,5 мл)	-	—	Обработка образцов Категория: пластиковая керамика
Микроцентрифуга (2,0 мл)	-	—	Обработка образцов Категория: пластиковая керамика
Микропипетка (100– 1000 и микро; L)	-	—	Жидкое обращение Категория: Инструмент
Микропипетка (1– 10 & микро; L)	-	—	Жидкое обращение Категория: Инструмент
Микропипетка (1– 5 и микро; L)	-	—	Жидкое обращение Категория: Инструмент
Микропипетка (1– 5 мл)	-	—	Жидкое обращение Категория: Инструмент
Микропипетка (20– 200 и микро; L)	-	—	Жидкое обращение Категория: Инструмент
Считыватель микропластин	BioTek	—	Измерение OD600 Категория: Инструмент
Mueller– Хинтон Агар/Бульон	Различные	—	Антимикробные анализы Категория: средняя
Нанодроп / биодроп спектрофотометр	Различные	—	Измерение белка Категория: Инструмент
База данных NCBInr	Национальный центр биотехнологической информации	—	Нерезервирующая база данных белков Категория: Программное обеспечение / База данных
Питательный агар	-	—	Бактериальная культура Категория: среда
Бумажный диск (6 мм)	Whatman No42	—	Дисковый диффузионный анализ Категория: пластиковая керамика
Чашка Петри	Различные	—	Микробная культура Категория: пластиковая керамика
pH-метр	Меттлер Толедо	—	Регулировка pH Категория: Инструмент
Фосфатный буфер (10 мМ, pH 7,0)	-	—	Хроматографический буфер Категория: Буфер
Probe Sonicator (VCX500)	Sonics & Materials Inc.	—	Cell disruption 500 W, 20 кГц, с зондом Категория: Инструмент
Холодильник (4 градуса; C)	Различные	—	Хранение образцов Категория: Инструмент
Серебряная селитра	Исследовательские лаборатории Sisco	94118	Серебряное окрашивание Категория: Химические
Хлорид натрия (NaCl)	Merck	S9888	Буфер элюции Категория: Химические
Додецилсульфат натрия (SDS)	Био-Рад Лаборатории	11667289001	Лизис и PAGE Категория: Химические
Спектрофотометр	Симадзу	—	Измерение поглощения Категория: прибор
Центрифуга с вращением вниз	Эппендорф	—	Быстрое центрифугирование Категория: Инструмент
Staphylococcus aureus TISTR 746	TISTR, Таиланд	—	Тестовый микроорганизм Категория: Биологический материал
Стрептомицин	Merck	S9137-25G	Положительный контроль Категория: Химические
Tetraspora sp. CU2551	Культурная коллекция KMITL	—	Штамм водорослей Категория: Биологический материал
Среда Tri Acetate Phosphate (TAP)	-	—	Культура водорослей Категория: Medium
Tris-HCl	Merck	—	Подготовка буфера Категория: Buffer
Вернье Калипер	Различные	—	Измерение зоны Категория: Прибор
Водяная баня	Различные	—	Контроль температуры Категория: Инструмент
XMASS	Bruker Daltonics	—	Программное обеспечение для масс-спектрометрии MALDI-TOF Категория: Программное обеспечение
&альфа;-циано-4-гидроксициннамовая кислота (CHCA)	Bruker Daltonics	—	Матрица MALDI Категория: Химические

Ссылки

Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis. Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).
Vasquez-Moscoso, C. A., Merlano, J. A. R., Olivera Gálvez, A., Volcan Almeida, D. Antimicrobial peptides (AMPs) from microalgae as an alternative to conventional antibiotics in aquaculture. Prep Biochem Biotechnol. 55 (1), 26-35 (2025).
Mekhalfi, M., Berteina-Raboin, S. Microalgae, cell factories for antimicrobial peptides: a promising response to antibiotic resistance. Antibiotics. 14 (10), 959(2025).
Singh, L. A., et al. Microalgae-derived antioxidants and antimicrobials: a sustainable approach for natural food preservatives. Front Sustain Food Syst. 9, 1669731(2025).
Wang, X., Ma, S., Kong, F. Microalgae biotechnology: methods and applications. Bioengineering. 11 (10), 965(2024).
Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. CLSI supplement M100. , 35th ed, Standards Institute Clinical and Laboratory. (2025).
Sun, S. Progress in the identification and design of novel antimicrobial peptides against pathogenic microorganisms. Probiotics Antimicrob Proteins. 17 (2), 918-936 (2025).
Yang, R., et al. Advances in antimicrobial peptides: from mechanistic insights to chemical modifications. Biotechnol Adv. 81, 108570(2025).
Laboratorybiosafety manual. , 4th ed, World Health Organization. (2020).
Bolton, J. Algal culturing techniques. J Exp Mar Biol Ecol. 336, 262-262 (2006).
Tonawut, Y., et al. In silico encrypted peptide from green alga Tetraspora sp. CU2551 showed high antimicrobial activities. Algal Res. 78, 103382(2024).
Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
Oakley, B. R., Kirsch, D. R., Morris, N. R. A simplified ultrasensitive silver stain for detecting proteins in polyacrylamide gels. Anal Biochem. 105 (1), 361-363 (1980).
Zhu, Q., et al. Effect of sodium dodecyl sulfate (SDS) on microbial community structure and function in lake-terrestrial ecotones: a simulation experiment. Environ Technol Innov. 34, 103594(2024).
Mattern, K. L., Evans, C. A., Lara, J. C. Selective antibacterial action of 2-mercaptoethanol on propionibacteria in skin cultures. Appl Environ Microbiol. 37 (1), 177-179 (1979).
Click, R. E. Review: 2-mercaptoethanol alteration of in vitro immune functions of species other than murine. J Immunol Methods. 402 (1-2), 1-8 (2014).
Ishak, A., Mazonakis, N., Spernovasilis, N., Akinosoglou, K., Tsioutis, C. Bactericidal versus bacteriostatic antibacterials: clinical significance, differences and synergistic potential in clinical practice. J Antimicrob Chemother. 80 (1), 1-17 (2025).
Vaisbourd, E., et al. Principles of bacteriostatic and bactericidal antibiotics at subinhibitory concentrations. mBio. 16 (11), e0206625(2025).
Marciano, C. L., et al. A comprehensive overview of antimicrobial peptides: broad-spectrum activity, computational approaches, and applications. Antibiotics. 14 (11), 1115(2025).
Lu, Z., et al. Studies on the antibacterial activity of the antimicrobial peptide Mastoparan X against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Front Cell Infect Microbiol. 15, 1552872(2025).
Keeratikunakorn, K., Aunpad, R., Ngamwongsatit, N., Kaeoket, K. The effect of antimicrobial peptide (PA-13) on Escherichia coli carrying antibiotic-resistant genes isolated from boar semen. Antibiotics. 13 (2), 138(2024).
Maneeruttanarungroj, C., Lindblad, P., Incharoensakdi, A. A newly isolated green alga, Tetraspora sp. CU2551, from Thailand with efficient hydrogen production. Int J Hydrogen Energy. 35, 13193-13199 (2010).
Brizuela, C. A., Liu, G., Stokes, J. M., de la Fuente-Nunez, C. AI methods for antimicrobial peptides: progress and challenges. Microb Biotechnol. 18 (1), e70072(2025).
Maccari, G., Di Luca, M., Nifosì, R. In silico design of antimicrobial peptides. Methods Mol Biol. 1268, 195-219 (2015).
Huan, Y., Kong, Q., Mou, H., Yi, H. Antimicrobial peptides: classification, design, application and research progress in multiple fields. Front Microbiol. 11, 582779(2020).
Alzain, M., et al. Antimicrobial peptides: mechanisms, applications, and therapeutic potential. Infect Drug Resist. 18, 4385-4426 (2025).
Rivero-Pino, F., Millan-Linares, M. C., Montserrat-de-la-Paz, S. Strengths and limitations of in silico tools to assess physicochemical properties, bioactivity, and bioavailability of food-derived peptides. Trends Food Sci Technol. 138, 433-440 (2023).
Curnutte, J. T., Babior, B. M. Biological defense mechanisms: the effect of bacteria and serum on superoxide production by granulocytes. J Clin Invest. 53 (6), 1662-1672 (1974).
Eleftheriadis, T., Pissas, G., Liakopoulos, V., Stefanidis, I. Cytochrome c as a potentially clinically useful marker of mitochondrial and cellular damage. Front Immunol. 7, 279(2016).
Min, L., Jian-xing, X. Detoxifying function of cytochrome c against oxygen toxicity. Mitochondrion. 7 (1), 13-16 (2007).
Mühlhaus, T., et al. Quantitative shotgun proteomics using a uniform N-labeled standard reveals new insights into the heat stress response of Chlamydomonas reinhardtii. Mol Cell Proteomics. 10 (9), M110.004739(2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Очистка и идентификация антимикробного белка из зелёной водоросли tetraspora sp. CU2551

В этой статье

Краткое содержание

Аннотация

Введение

Протокол

Результаты

Обсуждение

Раскрытие информации

Благодарности

Материалы

Ссылки

Перепечатки и разрешения

Теги