Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Метагеномное секвенирование следующего поколения спинномозговой жидкости для обнаружения патогенов центральной нервной системы

292 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70075

⸱

17 апреля 2026 г.

 ,  ,  , 
1University of California, San Francisco Weill Institute for Neurosciences, Department of Neurology, University of California, San Francisco

В этой статье

Краткое содержание

Этот исследовательский протокол описывает оптимизированный рабочий процесс для метагеномного секвенирования следующего поколения (mNGS) спинномозговой жидкости. Решая проблемы, характерные для образцов с низкой биомассой, метод обеспечивает надёжное обнаружение патогенов в различных условиях ресурсов, обеспечивая универсальную основу для исследований нейроинфекционных заболеваний.

Аннотация

Метагеномное секвенирование следующего поколения (mNGS) стало мощным инструментом для объективного обнаружения патогенов и транскрипционного профилирования хозяина в клинических и исследовательских условиях. Хотя его полезность для диагностики инфекций центральной нервной системы (ЦНС) всё больше признаётся, образцы спинномозговой жидкости (ЦСЖ) представляют собой уникальные трудности из-за низкого содержания нуклеиновых кислот и подверженности деградации. В данном исследовании представлен оптимизированный научно-ориентированный протокол для платформ секвенирования Illumina, адаптированный к c/cf, mNGS, охватывающий обработку образцов, экстракцию нуклеиновых кислот, подготовку библиотек, секвенирование и биоинформатический анализ. Также предлагаются подходы к контролю качества, адаптируемые как к условиям с высокими и низкими ресурсами, включая альтернативы капиллярному электрофорезу. Это исследование демонстрирует надёжность протокола через два представительных когорты: высокоуглублённый рабочий процесс на базе NovaSeq и экономичный рабочий процесс на базе NextSeq. В этих когортах патогены были обнаружены более чем в 50% случаев, что подчёркивает диагностический потенциал метода даже при адаптациях, ограниченных ресурсами. Этот протокол способствует воспроизводимой мСПГ СМС, обеспечивая основу для разнообразных применений в исследованиях и диагностике нейроинфекционных заболеваний.

Введение

Метагеномное секвенирование следующего поколения (mNGS) — это всё более используемый молекулярный метод, позволяющий обнаруживать широкий спектр нуклеиновых кислот в данной окружающей среде или образцехозяина 1. Амплифицируя и секвенируя подавляющее большинство генетического материала в образце, mNGS не требует предвзятой гипотезы о конкретных микроорганизмах, которые могут присутствовать. mNGS показала свою полезность как диагностический инструмент в различных клинических условиях, например, для обнаружения редких патогенов или нетипичных проявлений инфекционныхзаболеваний 1,2,3. Кроме того, транскрипционный профиль хозяина также фиксируется с помощью данных секвенирования РНК, полученных в анализе mNGS, что позволяет исследователям лучше понять иммунный ответ хозяина на различные состоянияболезни 4. Применимость mNGS в широком спектре клинических и исследовательских контекстов, а также резкое снижение стоимости генерического секвенирования за последние десятилетия привели к значительному росту использования этойтехнологии 5.

В частности, mNGS показала перспективы в выявлении инфекций центральной нервной системы (ЦНС), которые по-прежнему сложнодиагностировать 2,6,7. До появления клинического тестирования mNGS Калифорнийский проект по энцефалиту изучал причины энцефалита по всему штату и обнаружил, что более половины случаев оставались недиагностированными, несмотря на использование расширенной панели молекулярных тестов и детальной клинической оценки8. Теперь, более двух десятилетий спустя, клинически подтверждённый анализ mNGS на спинномозговой жидкости (СМС) выявил наличие патогенных организмов в ЦФ почти у 15% пациентов с подозрением на инфекции ЦНС в течение семи лет7. Кроме того, среди пациентов с подтверждённым инфекционным диагнозом один из пяти был диагностирован только с помощью клинического mNGS теста на ликворд, что подчёркивает полезность такого подхода7. Кроме того, исследования также продемонстрировали потенциал предсказания вероятности различных инфекций ЦНС на основе транскриптома хозяина, сгенерируемого анализомmNGS 9,10,11.

Однако доступность этого перспективного метода ограничена уникальными трудностями, характерными для обработки и обработки образцов СМС. В частности, количество ДНК и РНК ликвора часто ниже минимального количества, указанного в наборах для подготовкибиблиотеки 12,13. Качество нуклеиновых кислот также может быть неоптимальным, поскольку образцы ликвора, собранные для клинических целей, часто хранятся при температурах, при которых ДНК и РНК могут оставатьсяактивными 14. В этой статье описывается исследовательский протокол mNGS CSF для платформ секвенирования Illumina, оптимизированный для максимизации вероятности получения полезных данных для обнаружения патогенов (рисунок 1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол был разработан и протестирован на основе образцов, собранных в рамках исследований, одобренных Институциональным обзорным советом UCSF.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Обработка образцов и аналитический рабочий процесс для обнаружения патогенов в области метагеномного секвенирования мозговой жидкости (ЦСЖ) с помощью спинномозговой жидкости (ЦСЖ).Эта диаграмма демонстрирует основные этапы влажного лабораторного и биоинформатического путей мСП (CSF). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

1. Вопросы обращения с образцами CSF

ПРИМЕЧАНИЕ: результаты mNGS оптимальны, если подготовка библиотеки ликвора происходит во время сбора или если образцы СМЖ сохраняются методом мгновенного замораживания в жидком азоте с последующим длительное хранение при -80 °C 15. Альтернативно, использование консервантных растворов, таких как ДНК/РНК-щит, во время сбора образцов позволяет хранить их при комнатной температуре более длительноевремя — 16,17. Это может быть предпочтительнее в ситуациях, когда возникают сомнения по поводу надёжности холодовой цепи. Кроме того, предотвращение ненужных циклов замораживания и оттаивания также помогает сохранить целостность нуклеиновых кислот, и может быть разумно предварительно аликвотировать образцы при сборе, если для образцов СМЖ ожидается несколько аналитических процессов18,19.

2. Экстракция нуклеиновой кислоты ликвора

ВНИМАНИЕ: Выполняйте работу в соответствующем шкафу с уровнем биобезопасности в перчатках и лабораторном халате, чтобы снизить риск передачи инфекционных организмов. Реагенты вредны при глотке, вдыхании или контакте с кожей. Утилизировать использованные материалы как опасные химические отходы в соответствии с местными нормативами.

  1. Набор быстрой ДНК/РНК обычно хорошо работает для образцов с низким содержанием нуклеиновых кислот.
  2. Разморозить образцы СМФ на льду, затем перенести по 100 мкл–1 мл каждого образца в трубку на 1,5 мл и центрифугировать при 16 000 г при 4 °C в течение 10 минут.
  3. Аккуратно уберите пипетку от супернатанта, оставив после себя гранулу (которая часто невидима невооружённым глазом) и 100 мкл супернатанта.
  4. Добавьте 100 мкл ДНК/РНК-щита к оставшимся 100 мкл супернатанта и гранул, и тщательно перемешайте пипетку.
  5. Затем добавьте 600 мкл буфера лизиса ДНК/РНК и смесьте пипетку, пока раствор не станет однородным.
  6. Следуйте оставшейся части протокола экстракции ДНК/РНК, описанному производителем в дополнительных приложениях A, со следующими важными изменениями, специфичными для ликвордовой жидкости:
    1. Выполните все этапы центрифугации в течение 1 минуты на максимальной скорости (~21 000 x g), кроме финального этапа промывания ДНК/РНК, который должен длиться 3 минуты на максимальной скорости.
    2. Элюируйте образец, добавив 22 мкл (вместо 25 мкл) безнуклеазной воды непосредственно на матрицу столбца, затем инкубируйте 3 минуты при комнатной температуре. Больший объём обычно приводит к большему общему объёму нуклеиновой кислоты, элюируемой из столбца.
    3. После элюции пропустите проток обратно на матрицу колонки и снова центрифугуйте в течение одной минуты на максимальной скорости. Перенесите образец в новую накопительную трубку объёмом 1,5 мл и либо сразу приступите к подготовке библиотеки, либо храните при -80 °C.

3. Подготовка библиотеки РНК CSF

ВНИМАНИЕ: Выполняйте работу в соответствующем шкафу для биобезопасности, в перчатках и лабораторном халате. Реагенты вредны при глотке, вдыхании или контакте с кожей. Утилизировать использованные материалы как опасные химические отходы в соответствии с местными нормативами.

ПРИМЕЧАНИЕ: Важные соображения перед началом: истощение рРНК предпочтительнее полиаденилированного обогащения для выделения мРНК, поскольку истощение рРНК не требует дополнительных этапов очистки шариков (что может снизить доход полезной мРНК), а некоторые транскрипты нейроинвазивных вирусов РНК не имеют полиаденилирования. ERCC (консорциум контроля внешних РНК) РНК Spike-In может быть добавлен в качестве меры контроля качества, хотя это не является строго обязательным. Если РНК хранилась при -80 °C после извлечения, оттаивайте на льду до начала.

  1. Фрагментация и прайминг РНК: Пипетт смешивает следующее в пробирке полимеразной цепной реакции (ПЦР): образец РНК 3,5 мкл, 0,5 мкл 1:2500 разбавленный ERCC spike-in, 4 мкл буфера реакции первой цепи (5 раз), 1 мкл случайных праймеров и 1 мкл 1:100 разбавленной рРНК (таблица материалов). В термоциклере установите нагретую крышку на 105 °C и инкубуйте образцы при 75 °C в течение 2 минут, 70 °C 2 минуты, 65 °C 2 минуты, 60 °C 2 минуты, 55 °C 2 минуты, 37 °C 5 минут и 25 °C 5 минут.
  2. Синтез кДНК первой цепи: Pipette смешивает фрагментированную и праймированную РНК (10 мкл) с 8 мкл безнуклеазной водой и 2 мкл ферментов синтеза первой цепи. В термоциклере установите нагретую крышку на 105 °C и инкубируете образцы при 25 °C в течение 10 минут, 42 °C 15 минут и 70 °C 15 минут.
  3. Синтез кДНК второй цепи: Пипетт смешивает синтезированную ДНК первой цепи (20 мкл) с буфером реакции синтеза второй цепи 8 мкл, смесью ферментов синтеза второй цепочки 4 мкл и 48 мкл водой без нуклеазы. В термоциклере инкубировать образцы в течение 1 часа при 16 °C, с нагретой крышкой.
  4. Выполните очистку магнитных шариков (Дополнительные приложения B) с использованием соотношения 1,8x магнитных шариков SPRI (144 мкл). Элюировать в 53 мкл безнуклеазную воду и перенести 50 мкл последнего супернатанта (содержащего очищенную двухцепочечную кДНК) в чистую ПЦР-трубку без нуклеазы. В этот момент образцы можно безопасно заморозить при -20 °C на ночь, если это необходимо.
  5. Завершение подготовки библиотеки кДНК: если образец хранили при -20 °C ночью, разморозить на льду перед повторным началом. Пипетты смешивают очищенную ds-cDNA (50 мкл) с 7 мкл буфера для последней подготовки реакции и 3 мкл ферментной смеси для подготовки концов.
  6. В термоциклере инкубировать образцы при 20 °C в течение 30 минут и при 65 °C в течение 30 минут, при закрытой нагретой крышке.
  7. Перевязка адаптера (выполните этот этап на льду): Создайте разбавление адаптера в соотношении 1:100 в воде без нуклеаз. Пипетировать конечную реакционную смесь (60 мкл) в трубку с мастер-смесью 30 мкл лигации, 1 мкл усилителем лигации и 2,5 мкл разбавлённого адаптера 1:100. Убедитесь, что адаптер добавлен отдельно (например, не заранее смешан с мастер-миксом или усилителем лигации), чтобы избежать образования димеров адаптера.
  8. В термоциклере инкубировать образцы при 20 °C в течение 15 минут, с нагретой крышкой.
  9. Немедленно переходите к очистке магнитных шариков (Дополнительное приложение 2) с использованием соотношения 0,9x магнитных шариков SPRI (87 мкл).
  10. Элюировать в воду без нуклеазы 17 мкл и перевести 15 мкл последнего супернатанта в чистую ПЦР-трубку без нуклеазы
  11. Штрих-кодирование ПЦР: Пипетте очищенную кДНК с адаптером (15 мкл) в пробирку с 3 мкл ферментом USER, 25 мкл Q5 Master Mix и 10 мкл уникальных штрих-кодированных праймеров. В термоциклере установите нагретую крышку на 105 °C, инкубируете образцы при 37 °C в течение 15 минут, затем при 98 °C 30 секунд, а затем проведите 19 циклов при температуре 98 °C в течение 10 с и при 65 °C в течение 75 секунд. Завершите ПЦР, инкубировав при 65 °C в течение 5 минут.
  12. Выполните окончательную очистку магнитных шариков с помощью соотношения магнитных шариков 0,8x (43 мкл). Элюировать в воду без нуклеазы 23 мкл и после последнего этапа разделения шариков передать 20 мкл в чистую ПЦР-трубку без нуклеаз. В этот момент образцы можно безопасно заморозить при -20 °C на ночь, если это необходимо.

4. Подготовка библиотеки ДНК CSF

ВНИМАНИЕ: Проводите работу в шкафчике соответствующего уровня биобезопасности в перчатках и лабораторном халате. Реагенты вредны при глотке, вдыхании или контакте с кожей. Утилизировать использованные материалы как опасные химические отходы в соответствии с местными нормативами.

  1. Если извлеченная ДНК хранилась при -20 °C ночью, её разморозили на льду перед повторным началом.
  2. Фрагментация ДНК и подготовка на конце: Тщательно смешайте буфер реакции первой цепи путём вихря и пипетки, смешивая раствор для повторной суспензии осадка. Пипетная смесь содержит 3,5 мкл экстракции ДНК, 22,5 мкл воды без нуклеаз, 7 мкл буфера реакции первой цепи и 2 мкл смеси ферментов первой цепи.
  3. В термоциклере установите нагретую крышку на 105 °C и инкубируете образцы при 37 °C в течение 5 минут, затем при 65 °C в течение 30 минут.
  4. Процесс ПЦР с помощью адаптера и штрихкодирования идентичен для библиотек ДНК и РНК. Повторите разделы 7–10 «Подготовка библиотеки РНК по ЦВО» с фрагментированной и готовой на концах ДНК, чтобы завершить подготовку библиотеки ДНК.

5. Контроль качества библиотеки и пулирование

  1. Количественно определите концентрацию библиотек образцов с помощью комплекта для количественной оценки ДНК и соответствующего флюорометра. Водные контроли должны иметь значительно меньшие (или неизмеримые) концентрации по сравнению с остальными образцами.
  2. Оценивайте размеры библиотеки образцов, запуская образцы на автоматическом капиллярном электрофорезном аппарате.
  3. В качестве альтернативы, если автоматизированная капиллярная электрофорезная машина недоступна, дополнительно усилите 1-2 мкл образца, проведя ПЦР-реакцию с универсальными праймерами Illumina, а затем проведите электрофорез 10 мкл готового продукта на 2% агарозном геле. Утилизировать использованные материалы как опасные химические отходы в соответствии с местными нормативами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная длина библиотеки составляет примерно 400–500 пар оснований, поэтому будущие инкубации фрагментации следует корректировать, если размеры библиотек будут больше или короче желаемого. Кроме того, крайне важно оценить наличие адаптерных димеров, которые имеют примерно 150 пар оснований в длину и возникают, когда две адаптерные молекулы случайно связываются друг с другом без вставной последовательности. Даже если адаптерные димеры присутствуют в небольших количествах, они обычно эффективно кластерируются и секвенируются на ячейке потока, уменьшая долю пригодных считываний во время секвенирования. Таким образом, при наличии адаптерных димеров проводите дополнительную очистку магнитных шариков с соотношением 0,8x магнитных шариков SPRI. (Стоит отметить, что если >10% образца — адаптерный димер, может потребоваться 2-3 круга очистки магнитных шариков, чтобы удалить большинство адаптерных димеров).
  4. Для обеспечения одинаковой глубины секвенирования между образцами в одном и том же цикле необходимо объединить эквимолярные величины каждого образца. Если размеры библиотек сопоставимы для всех образцов, просто объедините эквивалентные массы каждой библиотеки РНК и повторите это отдельно для каждой библиотеки.

6. Вопросы по секвенированию

  1. Объединённые образцы теперь готовы к секвенированию на устройствах секвенирования Illumina. Если секвенирование проводится внутри компании (а не через специализированное ядро секвенирования), аккуратно денатурируйте и разбавляйте объединённые библиотеки в соответствии с инструкциями устройства секвенирования перед загрузкой пула на картридж реагента (типичная концентрация составляет 4 нМ для большинства платформ секвенирования Illumina).
  2. Рассчитайте предполагаемую глубину секвенирования, деля ожидаемый выход данных для ячейки потока Illumina на количество мультиплексированных образцов в пробеге.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Определение желаемой глубины секвенирования зависит от нескольких факторов, включая стоимость, используемое устройство секвенирования и цели эксперимента. Два примера различных глубин секвенирования приведены ниже в разделе «Репрезентативные результаты».

7. Анализ данных для обнаружения патогенов

  1. Используйте открытую веб-платформу Chan Zuckerberg ID (CZID, https://www.czid.org, Illumina mNGS Pipeline v8.3) для проведения метагеномного анализа с целью обнаружения патогенов. CZID также включает опции загрузки сэмплов через командный интерфейс и прямой передачи из аккаунта Illumina BaseSpace в CZID. Подробный обзор анализа данных CZID mNGS доступен по адресу https://chanzuckerberg.zendesk.com/hc/en-us/articles/13770737266196-Guide-to-mNGS-Data-Analysis
  2. Войдите в CZID, нажмите «загрузить», выберите «метагеномика» для типа анализа и выберите входные файлы fastq из секвенирования. Вводите необходимую информацию для каждого образца, включая название образца, тип образца (CSF) и нуклеотид (РНК или ДНК).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Загруженные файлы проходят автоматическую обработку через конвейер CZID, который включает несколько вычислительных инструментов, таких как STAR, Bowtie2, Trimmomatic, PriceSeq и GSNAP, среди прочих, для удаления низкокачественных чтений и последовательностей чтения человека. Конвейер затем выравнивается и собирает фильтрованные последовательности с помощью баз данных нуклеотидов (NT) и белков (NR) Национального центра биотехнологической информации (NCBI) через программы Minimap2 и DIAMOND соответственно. Итоговый результат CZID включает подсчёты таксонов NT/NR и контиг-счёты (смежные, перекрывающиеся сегменты, создаваемые при сборке) для каждого образца.
  3. После обработки нажмите на папку проекта с образцами и перейдите к панели сводки.
  4. Прокрутите вниз, чтобы изучить количество считываний на образец (и сравните с ожидаемым количеством считываний на основе используемой ячейки Illumina и количества образцов, мультиплексированных в ходе секвенирования), процент считываний, проходящих фильтрацию контроля качества, и коэффициент дублирования сжатия для оценки предвзятого переусиления ПЦР.
  5. Наличие загрязнения фрагментами нуклеиновых кислот окружающей среды — либо в процессе сбора образцов ликвора, либо при извлечении/подготовке в библиотеке — является распространённымявлением 20. Чтобы определить, являются ли бактериальные, грибковые и паразитические показания истинно положительными, можно рассмотреть потенциальные методы, использующие нормированные показатели чтений (чтения на миллион, или rPM):
    1. Создайте фоновую модель (например, используя образцы воды, извлечённые, подготовленные и секвенированные) непосредственно внутри CZID, чтобы отфильтровать таксоны с rPM, которые схожи или меньше по количеству по сравнению с фоновой моделью (и, следовательно, могут представлять загрязнение). В папке проекта проверьте каждый из образцов контроля воды и нажмите «фоновая модель» для создания. При анализе каждого образца выберите фоновую модель и нажмите «threshold filters», чтобы применить «NTZ Score» > 1 (или выше) для фильтрации вероятных загрязнителей.
    2. Используйте заранее заданные пороги rPM, такие каквыборка rpM > 10* (средний rPM контрольный) или log10 (выборка rPM) как минимум на 1 лог больше log 10 (средний rPMпо всей когорте). Сначала скачайте специфичный для каждого образца rPM для каждого образца, проверив каждый образец на странице проекта, нажав «Скачать и выбрав «Результаты комбинированных выборочных таксонов». Полученный файл .csv можно анализировать с помощью статистического программного обеспечения, такого как R или Stata, по желанию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывая низкую относительную численность вирусных патогенов, любой вирус с известным нейроинвазивным потенциалом и хотя бы одно считывание, совпадающее с вирусным геномом, должны считаться положительным результатом (и желательно подтверждены повторным mNGS или специфическим клиническим тестированием патогена). Кроме того, аналитический конвейер требует , чтобы каждое чтение файла fastq было вычислительно согласовано с наиболее вероятным эталонным геномом базы данных NCBI. В результате некоторые варианты могут быть относительно неспецифичными для конкретного патогена и теоретически соответствовать широкому кругу организмов, а не конкретному таксону, указанному в CZID. Учитывая этот риск, ручное подтверждение положительных вызовов следует выполнять путем подтверждения выравнивания через веб-инструмент NCBI BLAST (конкретные считывания таксона можно напрямую отправить из CZID в NCBI BLAST, нажав на значок взрыва рядом с соответствующим таксоном).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Контроль качества библиотеки
После экстракции ДНК/РНК измеряемая концентрация экстракции ДНК обычно составляет 1–10 нг/мкл. Однако концентрация экстракционной РНК часто составляет порядка pg/μL, поэтому она часто не обнаруживается спектрофотометром. После подготовки библиотеки очищенные и амплифицированные библиотеки кДНК и ДНК обычно имеют концентрации 0,5–10 нг/мкл и 10–30 нг/мкл соответственно. Данные капиллярного электрофореза и электроферограммы на

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Существуют важные аспекты, которые могут потребовать изменений в этом протоколе в зависимости от желаемой глубины секвенирования, используемой платформы секвенирования и доступности оборудования для контроля качества. Тем не менее, две представленные здесь когорты демонстрируют, что надёжное обнаружение патогенов возможно в широком спектре экспериментальных условий. В частности, когорта B показала, что, несмотря на ряд мер по снижению затрат — секвенирование мелкой глубины, исключение ко...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

М.Р.В. получает финансирование из независимых исследовательских грантов от Roche/Genentech, Novartis и Kyverna Therapeutics, а также является основателем и членом совета директоров Delve Bio Inc. Он оказывал консультационные услуги компаниям Pfizer, Vertex Pharmaceuticals, Ouro Medicines и Indapta Therapeutics.

Благодарности

Это исследование было поддержано финансированием Международного центра Фогарти Национальных институтов здравоохранения в рамках премии No D43TW009343. Мы хотели бы поблагодарить многих исследователей из Wilson Lab, UCSF и CZI, которые внесли вклад в разработку и оптимизацию протоколов mNGS для различных исследовательских приложений за последние несколько лет.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Полоска для ПЦР-трубки объемом 0,2 млЭппендорф30124359
1,5 мл ДНК-трубок LoBindЭппендорф30108051
Трубки с безопасным замком объёмом 1,5 млЭппендорф30120191
ERCC РНК Spike-In MixТермо Фишер4456740
Реагенты высокой чувствительности D1000Agilent5067-5585
Мастер-микс усилителя библиотеки Invitrogen CollibriТермо ФишерA38539050
Mastercycler x50Термо Фишер6311000010
NEBNext Multiplex Oligos для IlluminaNew England Biolabs7335S/L
Комплект подготовки библиотеки ДНК NEBNext Ultra IINew England BiolabsE7645
Комплект подготовки библиотеки РНК NEBNext Ultra II для IlluminaNew England BiolabsE7770
NextSeq 500/550 Высокопроизводительный комплект v2.5 (150 циклов)Illumina20024907
NextSeq 550IlluminaНет
QIAseq FastSelect -rRNA HMR KitКиаген334386
Qubit 1X набор для высокочувствительного анализа dsDNAКубитQ33230
Флуорометр Кубит-4Термо Фишерн/д
Quick-ДНК/РНК микроподготовка плюс набор для микроподготовки ДНК и РНК;ЗимоD7005
TapeStation 4150AgilentG2992AA

Ссылки

  1. Chiu, C. Y., Miller, S. A. Clinical metagenomics. Nat Rev Genet. 20 (6), 341-355 (2019).
  2. Wilson, M. R., et al. Clinical metagenomic sequencing for diagnosis of meningitis and encephalitis. N Engl J Med. 380 (24), 2327-2340 (2019).
  3. Forbes, J. D., Knox, N. C., Ronholm, J., Pagotto, F., Reimer, A. Metagenomics: the next culture-independent game changer. Front. Microbiol. 8, (2017).
  4. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  5. DNA Sequencing Costs: Data. , National Human Genome Research Institute (US). https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/DNA-Sequencing-Costs-Data (2026).
  6. Wilson, M. R., et al. Chronic meningitis investigated via metagenomic next-generation sequencing. JAMA Neurology. 75 (8), 947-955 (2018).
  7. Benoit, P., et al. Seven-year performance of a clinical metagenomic next-generation sequencing test for diagnosis of central nervous system infections. Nat Med. 30 (12), 3522-3533 (2024).
  8. Glaser, C. A., et al. In search of encephalitis etiologies: diagnostic challenges in the California encephalitis project, 1998-2000. Clinical Infectious Diseases. 36 (6), 731-742 (2003).
  9. Ramachandran, P. S., et al. Integrating central nervous system metagenomics and host response for diagnosis of tuberculosis meningitis and its mimics. Nat Commun. 13, 1675(2022).
  10. Xing, Z., et al. Integrating DNA/RNA microbe detection and host response for accurate diagnosis, treatment, and prognosis of childhood infectious meningitis and encephalitis. J Transl Med. 22, 583(2024).
  11. Omura, C., et al. 298. Host response profiling from clinical metagenomic sequencing data for diagnosis of central nervous system infections. Open Forum Infect Dis. 12 (1), (2025).
  12. Andriuk, L. V., Skochiĭ, P. G. Nucleic acids of the cerebrospinal fluid in acute disorders of cerebral circulation. Zh Nevropatol Psikhiatr Im S S Korsakova. 88 (7), 32-34 (1988).
  13. Olausson, J., et al. Optimization of cerebrospinal fluid microbial DNA metagenomic sequencing diagnostics. Sci Rep. 12 (1), 3378(2022).
  14. Becskei, A., Rahaman, S. The life and death of RNA across temperatures. Comput Struct Biotechnol J. 20, 4325-4336 (2022).
  15. Wang, C., Liu, H. Factors influencing degradation kinetics of mRNAs and half-lives of microRNAs, circRNAs, lncRNAs in blood in vitro using quantitative PCR. Sci Rep. 12 (1), 7259(2022).
  16. Cb, T., et al. DNA/RNA preservation in glacial snow and ice samples. Frontiers in microbiology. 13, (2022).
  17. Kazantseva, J., et al. Optimisation of sample storage and DNA extraction for human gut microbiota studies. BMC microbiology. 21 (1), (2021).
  18. Xiaoli, J., et al. The impact of repeated freeze-thaw cycles on the quality of biomolecules in four different tissues. Biopreservation and biobanking. 15 (5), (2017).
  19. Kellman, B. P., et al. Multiple freeze-thaw cycles lead to a loss of consistency in poly(A)-enriched RNA sequencing. BMC genomics. 22 (1), (2021).
  20. Zinter, M. S., Mayday, M. Y., Ryckman, K. K., Jelliffe-Pawlowski, L. L., DeRisi, J. L. Towards precision quantification of contamination in metagenomic sequencing experiments. Microbiome. 7 (1), 62(2019).
  21. Mayday, M. Y., Khan, L. M., Chow, E. D., Zinter, M. S., DeRisi, J. L. Miniaturization and optimization of 384-well compatible RNA sequencing library preparation. PLoS One. 14 (1), e0206194(2019).
  22. Sakiyama, Y., et al. Brain biopsy and metagenomic sequencing enhance aetiological diagnosis of encephalitis. Brain Commun. 7 (3), fcaf1650(2025).
  23. Sakiyama, Y., Yuan, J., Yoshimura, A., Takei, J., Ando, M., Takashima, H. Etiological insights of encephalitis and encephalitis-like central nervous system diseases: brain tissue metagenomic next-generation sequencing. Neurology. 102 (7-1), 3782(2024).
  24. Sun, J., et al. Correcting PCR amplification errors in unique molecular identifiers to generate accurate numbers of sequencing molecules. Nat Methods. 21 (3), 401-405 (2024).
  25. Tan, J. K., et al. Laboratory validation of a clinical metagenomic next-generation sequencing assay for respiratory virus detection and discovery. Nat Commun. 15 (1), 9016(2024).
  26. Prasanna, A. kshatha Clin-mNGS: Automated pipeline for pathogen detection from clinical metagenomic data. , https://github.com/AkshathaPrasanna/Clin-mNGS (2025).
  27. Marra, P. S., et al. Metagenomic next-generation sequencing in patients with infectious meningoencephalitis: a comprehensive systematic literature review and meta-analysis. Open Forum Infect Dis. 12 (5), ofaf274(2025).
  28. Ramachandran, P. S., Wilson, M. R. Metagenomics for neurological infections - expanding our imagination. Nat Rev Neurol. 16 (10), 547-556 (2020).
  29. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87(2014).
  30. Simner, P. J., Miller, S., Carroll, K. C. Understanding the promises and hurdles of metagenomic next-generation sequencing as a diagnostic tool for infectious diseases. Clin Infect Dis. 66 (5), 778-788 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Метагеномное секвенирование следующего поколения спинномозговой жидкости для обнаружения патогенов центральной нервной системы
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.