Этот протокол описывает двухфазный метод экстракции кислотой и растворителем для выделения короткоцепочечных жирных кислот из образцов мышиных фекалий с низким входом без дериватизации.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Извлечение короткоцепочечных жирных кислот из мышиных фекалий с использованием двухфазного кислотно-растворительного метода
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В этой статье описывается протокол экстракции короткоцепочечных жирных кислот (SCFA) из образцов мышиных фекалий с низким входом с использованием двухфазной стратегии кислотно-растворительной экстракции. Метод рассчитан на индивидуальные каловые входы примерно 20–50 мг и использует разбавленный соляную кислоту и этилацетат для обеспечения фазового разделения без дериватизации. Протокол включает гомогенизацию кала, окисление, разделение органических растворителей и центрифугирование при низких температурах, и может выполняться с использованием стандартного лабораторного оборудования, широко доступного в исследовательских лабораториях. После извлечения SCFA подходят для дальнейшего анализа с помощью рутинных газовых хроматографических платформ. Успешное выполнение протокола подтверждается обнаружением чётко разрешённых пиков SCFA при характерных временах удержания выше фонового шума, что демонстрируется для основных фекальных SCFA, включая ацетат, пропионат и бутират, из отдельных образцов мышей. Этот протокол решает распространённую процедурную задачу в исследованиях на мелких животных, предоставляя стандартизированный рабочий процесс для извлечения фекальных SCFA из ограниченного количества образцов при сохранении совместимости с рутинными аналитическими рабочими процессами.
Введение
Этот протокол был разработан для возможности экстракции короткоцепочечных жирных кислот (SCFA) из образцов мышиных фекалий с низким входом в формате, совместимом с рутинным анализом на основе газовой хроматографии (GC). SCFAs — это летучие органические жирные кислоты с менее чем шестью атомами углерода, в основном уксусной, пропионовой и масляной кислотами, которые образуются микробиотой кишечника путём ферментации неперевариваемых пищевыхволокон 1. Количественная оценка этих метаболитов от отдельных мышей часто требуется в исследованиях на мелких животных, где кал ограничен, а образцы связаны с поведенческими, метаболическими или физиологическимифенотипами 2,3,4,5,6. Поэтому необходим практический рабочий процесс экстракции с низким уровнем входа для поддержки экспериментальных проектов, основанных на измерениях SCFA на каждом животном.
Существующие подходы к анализу каловых SCFA имеют ряд методологических ограничений. Количественная оценка SCFA в образцах калов остаётся аналитически сложной из-за их летучости, низкого количества и сложности биологическихматриц 7. Стандартные рабочие процессы часто требуют этапов деривативизации, больших объёмов образцов и специализированного оборудования, такого как автоматизированная обработка жидкости, специализированные платформы для гомогенизации или твердофазные колонкиэкстракции 8,9,10,11. Эти требования могут ограничивать доступность и масштабируемость, особенно в исследованиях на мышях, где выброс фекалий на животное минимален, а продольные или генотипно-специфические выборкираспространены 12,13,14. В результате сохраняется методологический пробел в протоколах, позволяющих экстракцию SCFA из малых входов калов без дериватизации, при этом совместимость со стандартными рабочими процессами газовой хроматографии.
Описанный здесь протокол устраняет этот пробел, используя двухфазную стратегию экстракции кислотой и растворителем с использованием разбавленной соляной кислоты и этилацетата. Рабочий процесс включает гомогенизацию фекалий, закисление, разделение органических растворителей и центрифугирование при низких температурах, и рассчитан на работу с небольшими входными массами фекалий. В отличие от рабочих процессов на основе дериватизации, требующих дополнительных этапов модификации химических веществ или специализированных платформ для подготовки образцов, этот протокол позволяет напрямую экстракцию SCFA в формате, совместимом с рутинным анализом на основе GC с использованием стандартного лабораторногооборудования 2.
Этот метод предназначен для исследований, требующих экстракции SCFA из ограниченного количества мышиного фекаля, особенно когда необходимы индивидуальные измерения или когда доступность образцов ограничивает экспериментальную разработку. Он подходит для анализа распространённых SCFAs (C2–C6) на основе GC в образцах калов, но не предназначен для применений, требующих обнаружения, зависимого от дериватизации, ультра-следовой количественной оценки за пределами чувствительности GC или оценки системных концентраций SCFA.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Постоянный комитет по животным в Mass General Brigham (MGB), Бостон, штат Массачусетс, США, одобрил предыдущий протокол по животным, направленный на минимизацию количества используемых животных. Этот протокол соответствует руководящим принципам и нормативам Национального института здравоохранения. Эта рукопись была сформирована в соответствии с руководящими принципами ARRIVE. Схема протокола показана на рисунке 1, а необходимые материалы перечислены в Таблице материалов.
Рисунок 1: Схема протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой рисунка.
1. Сбор и подготовка образцов кала
- Собирайте свежие образцы фекалий (~30 мг) в отдельных микроцентрифугных пробирках по 1,5 мл. Записывайте точную входную массу фекального соображения для каждого образца, чтобы позволить точную нормировку концентрации SCFA.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что при заборе для каждого образца используются чистые флаконы, перчатки и пинцет. Все стеклянные изделия и инструменты должны быть автоклавированы перед использованием. Этот протокол был проверен для входных масс калов примерно 20–50 мг на образец, при этом в качестве репрезентативного входа используется ~30 мг. Объёмы экстракции остаются постоянными в этом диапазоне. - Разместите и маркируете необходимое количество флаконов центрифуг, соответствующих образцам.
- Приготовьте разбавлённую соляную кислоту (0,5 M; pH 1–2), медленно добавляя концентрированный HCl (12 M, реагент ACS) в сверхчистую воду.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: HCl — коррозийный; Он может вызвать серьёзные ожоги кожи, глаз и дыхательных путей. Опасно вдыхать. - Размораживайте образцы при комнатной температуре в течение 30–45 минут или до полного размораживания.
2. Гомогенизация и закисление образцов
- Добавьте 255 мкл раствора 0,5 M HCl в каждую флакон центрифуга.
- Возьмите новый флакон и наполните его 70% этанолом для очистки пинцета. Очистите пинцеты, окунув его в этанол, а затем высушите на чистом бумажном полотенце.
ВНИМАНИЕ: Этанол горючий и может раздражать кожу и глаза; Вдыхание паров может вызвать головокружение. - Организуйте этаноловую ванну для пестиков, положив их в контейнер и наполнив емкость 70% этанолом, пока все пестики не будут полностью погружены.
- Достаньте нужный образец из коробки с образцом. Снимите крышку флакона и удалите один образец (~ 30 мг) фекалий.
- Поместите образцы фекалий в соответствующие флаконы центрифуга.
- После того как все образцы будут помещены в нужные флаконы центрифуга, уберите пестик из ванны с этанолом. Высушите пестик чистым бумажным полотенцем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте новый пестик для каждого образца. - Используйте пестики для правильного измельчения и растворения образцов фекалий, см. рисунок 2. Измельчите образец кала до получения визуально однородной суспензии без видимых твёрдых фрагментов.
Рисунок 2: Измельчение образцов фекалий с помощью пестика. Свежесобранные фекалии измельчают для достижения равномерной консистенции для анализа SCFA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
- Использованные пестики положите в пустую коробку для последующей мытьи.
- Вихрь сэмплов с помощью импульсного вихревого миксера на максимальной скорости в течение 10 секунд, с плотно закрытыми лампами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что флаконы центрифуг плотно закрыты, чтобы не проливать смесь.
3. Экстракция SCFA и фазовое разделение
- Центрифугуйте образцы при 16 000 × г в течение 10 минут при 4 °C, обеспечивая правильный баланс центрифуги.
- После запуска центрифуги помечайте новые флаконы центрифуга, соответствующие образцам. После завершения центрифугирования удалите образцы из центрифуги.
- Установить пипетку объёмом 200 мкл на 120 мкл. Аккуратно соберите 120 мкл водного супернатанта после центрифугирования, чтобы избежать нарушения гранулы. Перенесите супернатант в недавно маркированные флаконы центрифуг и сбросьте гранулу.
- Добавьте равное количество (120 мкл) этилацетата в новомаркированные флаконы вместе с супернатирующей жидкостью. Повторяйте это для всех образцов.
ВНИМАНИЕ: Этилацетат горючий и может раздражать кожу, глаза и дыхательную систему. Избегайте вдыхания паров и длительного контакта. - Снова отнесите образцы к центрифуге. Убедитесь, что центрифуга правильно сбалансирована, а крышка ротора надёжна. Вращайтесь при 2 374 × г в течение 20 минут при 4 °C.
- После центрифугирования аккуратно соберите 120 мкл верхней органической фазы, не нарушая нижнюю водную фазу. Переложите экстракционный супернатант с SCFA в новые, маркированные флаконы центрифуг.
ПРИМЕЧАНИЕ: Собранный объём может быть менее 120 мкл. Если эмульсия присутствует на границе, продлите центрифугирование или охлаждайте образцы на льду до достижения четкого фазового разделения. Процедурные пустые образцы, обрабатываемые параллельно без фекального материала, могут быть включены в качестве дополнительного этапа контроля качества для оценки фоновых уровней SCFA, введённых реагентами или обработкой. - Проверьте предыдущие флаконы, чтобы убедиться, что нижний слой не был случайно поднят.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы, связанные с добавлением кислоты и обращением с органическими растворителями, должны выполняться быстро, при этом трубки по возможности оставались закрытыми, чтобы минимизировать потери от испарения или испарения.
4. Обработка и хранение экстракций
- Найдите и правильно промаркуйте коробку для экстракции, затем поместите в неё извлечённые образцы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы можно безопасно приостановить после сбора органической фазы, храня экстракты при −20 °C до 24 часов в плотно закрытых пробирках, а затем перемещивать до −80 °C для длительного хранения. - Поставьте коробку в морозильник при температуре -80 °C, чтобы дождаться анализа SCFA.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку и этилацетат, и SCFA обладают высокой летучей кислотностью, извлечённые образцы следует анализировать сразу после хранения при −80 °C. Длительное хранение может нарушить целостность образца.
5. Анализ газовой хроматографии
- Проанализировать экстракцированные SCFA с помощью GC с использованием капиллярной колонны из сплавленного кремнезема с неподвижной фазой свободных жирных кислот при расходе 30, 300 и 20 мл/мин для водорода, воздуха и азота соответственно. Введите 1 мкл аликвот органического экстракта для анализа.
- Для количественных применений включайте внутренние стандарты и калибровочные процедуры (например, 2-этилмасляную кислоту), как описано выше2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные настройки, специфичные для инструментов, приведены в упомянутыхметодах 14.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Приведённый выше протокол дал бы экстракционные аликвоты SCFA по 120 мкл, соответствующие числу образцов фекалий, из которых они были получены. Успешное выполнение протокола экстракции подтверждается наличием чётко разрешённых пиков SCFA при характерных временах удержания с интенсивностью сигнала выше фонового шума. При выполнении по описанию протокол даёт фекальные профили SCFA, подходящие для количественного сравнения между образцами. Мы количественно определили восемь SCFA: уксусная к...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол содержит несколько критически важных этапов, обеспечивающих эффективное и воспроизводимое извлечение SCFA из образцов мышиных фекалий малого объёма. Протокол использует двухфазную систему кислотно-растворительной экстракции с использованием определённых объёмов разбавленной соляной кислоты и этилацетата, адаптированную к физико-химическим свойствам SCFA как слабых органических кислот с низкомолекулярной массой. Кислотление переводит SCFA в протонированную форму, уменьшая ио...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.
Благодарности
Мы с благодарностью выражаем признательность за финансовую поддержку этого исследования, предоставленную Национальными институтами здоровья через R21AG065606 и R21AG08176 Иин Чжан, а также за поддержку Фонда семьи Бортэн и пожертвование семьи Тан Ин Чжану.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Центрифуга | ThermoFisher | 75003424 | "Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge" |
| Центрифуги для пробирок | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Столик для микротрубок | Millipore Sigma | HS29025F-5EA | |
| Этилацетат | ThermoFisher | 022912.K2 | HPLC Grade, ≥99.5% |
| Зеленые пестики | Fisher Scientific | 50-189-9195 | |
| HCl | Fisher Scientific | SA49 | ACS Certified (10 N, stock solution); diluted to 0.5 M for use |
| Пипетка на 1000 μL | USA Scientific | 7110-1000 | |
| Наконечники для пипеток на 1000 μL | USA Scientific | 1111-2821 | |
| Этанол | Fisher Scientific | BP82011 | Molecular Biology Grade, 70% solution |
| Пипетка на 200 μL | USA Scientific | 7100-2200 | |
| Наконечники для пипеток на 200 μL | USA Scientific | 1110-1800 | |
| Пинцет | ThermoFisher | 046638.KT | |
| Вортекс | Fisher scientific | 50-136-7909 | "Research Products International Corp VORNADO Miniature Vortex Mixer, Purple Cup" |
Ссылки
- Koh, A., De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P., Bäckhed, F. From dietary fiber to host physiology: short-chain fatty acids as key bacterial metabolites. Cell. 165 (6), 1332-1345 (2016).
- Zhang, Y., et al. Transmission of Alzheimer's disease-associated microbiota dysbiosis and its impact on cognitive function: evidence from mice and patients. Mol Psychiatry. 28 (10), 4421-4437 (2023).
- Sun, Y., et al. PYY-mediated appetite control and obesity alleviation through short-chain fatty acid-driven gut-brain axis modulation by Lacticaseibacillus rhamnosus HF01 isolated from Qula. J Dairy Sci. 108 (8), 7960-7978 (2025).
- He, J., et al. Short-chain fatty acids and their association with signalling pathways in inflammation, glucose and lipid metabolism. Int J Mol Sci. 21 (17), 6356(2020).
- Fock, E., Parnova, R. Mechanisms of blood-brain barrier protection by microbiota-derived short-chain fatty acids. Cells. 12 (4), 657(2023).
- Kachoueiyan, F., et al. Butyrate: a key mediator of gut-brain communication in Alzheimer's disease. Metab Brain Dis. 40 (5), 189(2025).
- Kim, K. S., Lee, Y., Chae, W., Cho, J. Y. An improved method to quantify short-chain fatty acids in biological samples using gas chromatography-mass spectrometry. Metabolites. 12 (6), 525(2022).
- Ueyama, J., et al. Freeze-drying enables homogeneous and stable sample preparation for determination of fecal short-chain fatty acids. Anal Biochem. 589, 113508(2020).
- Papanicolas, L. E., et al. Bacterial viability in faecal transplants: which bacteria survive. EBioMedicine. 41, 509-516 (2019).
- Yao, L., et al. Quantitative analysis of short-chain fatty acids in human plasma and serum by GC-MS. Anal Bioanal Chem. 414 (15), 4391-4399 (2022).
- Zhang, C., Liu, A., Zhang, T., Li, Y., Zhao, H. Gas chromatography detection protocol of short-chain fatty acids in mice feces. Bio Protoc. 10 (13), e3672(2020).
- Zha, X., et al. Microbiota-derived lysophosphatidylcholine alleviates Alzheimer's disease pathology via suppressing ferroptosis. Cell Metab. 37 (1), 169-186.e9 (2025).
- Li, L. J., et al. Neuronal double-stranded DNA accumulation induced by DNase II deficiency drives tau phosphorylation and neurodegeneration. Transl Neurodegener. 13 (1), 39(2024).
- Zhou, H., et al. Glia-to-neuron conversion by CRISPR-CasRx alleviates symptoms of neurological disease in mice. Cell. 181 (3), 590-603.e16 (2020).
- Zhao, G., Nyman, M., Jönsson, J. A. Rapid determination of short-chain fatty acids in colonic contents and faeces of humans and rats by acidified water-extraction and direct-injection gas chromatography. Biomed Chromatogr. 20 (8), 674-682 (2006).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
