Методическая статья

Функциональная оценка эпителиального барьера десневой кости мыши с помощью флуоресцентных трассеров

DOI:

10.3791/70085

⸱

27 февраля 2026 г.

 ,  ,  , 
1Department of Physiology and Pathophysiology, Peking University School of Basic Medical Sciences, State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, 2State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, Peking University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель этого протокола — предоставить стандартизированный подход к количественной оценке целостности эпителиального барьера мышиных десен путем местного нанесения флуоресцентно-маркированного декстранса различных молекулярных размеров на поверхность дессен in vivo, а затем проведения ex vivo визуализации с использованием однофотонной микроскопии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Десневой эпителиальный барьер служит критически важной защитой в области орального иммунитета и гомеостаза. Целый эпителиальный барьер эффективно предотвращает проникновение вредных веществ из оральной среды, тогда как его нарушение тесно связано с патогенезом таких заболеваний, как пародонтит и плоский лишайник. Здесь мы разработали метод, основанный на локальном применении, для оценки целостности эпителиального барьера деснав у мышей. Сначала на поверхность губной десни молярной области была нанесена смесь флуоресцентно маркированного декстранса с разной молекулярной массой (40 или 70 кДа) в карбоксиметиллюлозе с содержанием 2% натрия. После 30-минутного инкубационного периода верхней челюсти была вскрыта и закреплена в специализированном держателе для немедленной визуализации с помощью системы микроскопии с одним фотоном. Этот подход позволяет визуализировать и количественно оценивать трассеры разных размеров по всему эпителиальному слою, обеспечивая функциональное отчёт целостности эпителиального барьера десна, применимое для изучения воспаления полости рта, заживления ран и моделирования заболеваний.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Десневой эпителиальный барьер представляет собой критически важный защитный интерфейс в полости рта, сохраняя целостность тканей за счёт избирательного регулирования транспортировки веществ и предотвращения микробнойинвазии 1. Состоящая из стратифицированного плоского эпителия, соединённого плотными комплексами соединения, эта динамическая структура точно контролирует параклеточную проницаемость, чтобы ограничить неселективное проникновение микроорганизмов, макромолекул и растворённых веществ2. Множество факторов могут нарушить целостность барьера десна. В полости рта проживает второе по разнообразие микробное сообщество в человеческом организме, где более 700 видов бактерий колонизируют поверхности зубов, десневые щели и слизистые полостирта 3,4. Эпителиальные клетки, выстилающие ткани десна, постоянно подвергаются воздействию этой плотной микробнойсреды 5.

Факторы вирулентности, выделяемые пародонтальными патогенами (например, Porphyromonas gingivalis), включая липополисахариды, нарушают функцию эпителиального барьера, вызывая воспалительные реакции в тканях деснав и способствуя патологическомупрогрессированию 6,7. Воспалительные медиаторы и механические стрессоры дополнительно усугубляют дисфункцию барьера, увеличивая восприимчивость к заболеваниям полостирта 8. Пероральные пробиотики могут помочь предотвратить пародонтоз, способствуя стабильности эпителиального барьера десна. Тем не менее, биологические взаимодействия между микроорганизмами и эпителиальными клетками десен в модуляции барьерной функции остаются в значительной степенинеясными 9. Поэтому разработка надёжных методов оценки функции эпителиального барьера имеет первостепенное значение.

Однофотонная лазерно-сканирующая микроскопия, известная своей высокой разрешенностью и проверенной системой обнаружения, оказалась особенно ценной для изучения образцов тканей ex vivo 10. Современные методы визуализации значительно улучшают оценку свойств барьера десна. Поверхностная природа десневых тканей, с эпителиальными клетками, расположенными примерно в 100 мкм от поверхности, делает их идеальными для таких методов визуализации. Наши исследования установили метод экс-виво оценки, использующий флуоресцентно-маркированные декстрансы разной молекулярной массы в качестве парацеллюлярных проницаемых индикаторов. В сочетании с однофотонной лазерно-сканирующей микроскопией этот метод позволяет точно количественно определить функцию эпителиального барьера десна, давая представление о механизмах пародонтоза и возможных терапевтических вмешательствах.

Протокол, установленный в этом исследовании, сочетающий локализованную доставку на основе гелевых трассеров с трёхмерной ex vivo визуализацией, специально оптимизирован для решения уникальных задач оценки эпителиального барьера десна. Во-первых, существующие методы внутривенных трассерных инъекций (Таблица 1) не способны точно оценить проницаемость локализованных мини-эпителиальных участков для внешнихагентов 11. Во-вторых, традиционные гистологические подходы требуют декальцификации и сечения, которые нарушают структуру тканей и являются трудоёмкимии трудоёмкими 12,13,14. В отличие от этого, наш протокол использует высококлеивый гель для эффективного удержания трассеров на сложной локальной поверхности. Кроме того, с помощью 3D-изображения она обеспечивает точную, неразрушительную количественную оценку глубины проникновения и распределения трассеров в эпителии десна, полностью сохраняя пространственную архитектуру ткани. Следовательно, этот метод особенно подходит для высокоразрешающей пространственно-временной оценки функции эпителиального барьера деснав в сложной и ограниченной ротовой среде.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все экспериментальные процедуры были одобрены Этическим комитетом по исследованиям животных Пекинского университетского центра здравоохранения и соответствовали Руководству по уходу и использованию лабораторных животных (публикация NIH No 85-23, пересмотренная 1996 год). В ходе процесса экспериментальные животные тщательно обрабатывались, чтобы минимизировать их боль и дискомфорт.

Детали каждого этапа работы по оценке проницаемости in vivo при эпителии деснав мышей описаны ниже (рисунок 1A). Здесь мы привели пример обнаружения функции эпителиального барьера как в моделях мышиного пародонтита, вызванного лигацией, так и Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis). Весь персонал прошёл комплексное обучение по защите лабораторных животных и асептической технике.

1. Обращение с животными

  1. В течение исследования домашние животные находятся в стандартных условиях без специфических патогенов (SPF) с 12-часовым циклом света и темноты, а также обеспечивают корм и воду ad libitum.
  2. Подготовка и введение анестетиков и трасеров
    1. Поддерживайте стерильные условия на протяжении всего протокола и используйте инструменты, очищенные 75% этанолом.
    2. Для эксперимента используйте самцов мышей дикого типа (WT) C57BL/6J в взрослой взрослой группе 8-10 недель. Разделите мышей на три группы: контрольную (необработанную) и две экспериментальные группы (модели мышиного пародонтита, вызванного лигацией и P. gingivalis).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При группировании следует отбирать мышей с похожим весом тела и недельным возрастом, чтобы уменьшить влияние возраста и веса на проницаемость эпителий десна. Модели пародонтита, индуцированного связыванием, и P. gingivalis, представляют собой широко используемые модели пародонтита у мышей. Для подробных протоколов моделирования обратитесь к литературе по моделям15 и P . gingivalis, индуцированных16 мышиным пародонтитом.
    3. Выберите флуоресцентные трассеры с неперекрывающимися спектрами, такие как декстран с маркировкой FITC (40 кДа; FD40) и родамина с меткой B декстран (70 кДа; RD70), чтобы обеспечить чёткое обнаружение сигналов с помощью соответствующих фильтров FITC и родамина.
    4. Разведи трассеры. Чтобы следовать этому протоколу, смешайте FD40 (1 г/л) и RD70 (1 г/л) в 2% карбоксиметилцеллюлозном геле и храните при 4 °C.
    5. Внутрибрюшинное введение 1,25% триброметанола (200 мг/кг массы тела, 15-17 мкл/г массы тела) для анестезии мышей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы трибромеэтанола чувствительны к свету. Трет-амиловый спирт — это горючий, летучий и раздражающий органический растворитель. Все процедуры, связанные с подготовкой, обращением и введением, должны выполняться в вытяжной камере с химическим дымом или в очень хорошо проветриваемом помещении, строго вдали от источников возгорания. Персонал должен носить соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), включая перчатки, химические защитные очки и лабораторный халат. Утилизация отходов: Отходы раствора трибромеэтанола, трет-амилового спирта и все загрязнённые материалы (например, шприцы, наконечники пипеток, перчатки) должны быть собраны и утилизированы как опасные химические отходы в строгом соответствии с нормами и протоколами вашего учреждения по охране окружающей среды и безопасности (EHS) для горючих и токсичных химикатов.
  3. Во время анестезии поддерживайте температуру корпуса на уровне 37 ± 0,5 °C с помощью грелки с обратной связью. Наносите глазную мазь с эритромицином, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте соответствующий уход за всеми животными на протяжении всего исследования.
  4. После хирургических процедур убедитесь, что животные поодиночно лежат на мягкой подстилке в тёплой, тихой клетке для восстановления до полной ходьбы. Следите за животными дважды в день в течение 48 часов и возвращайте их в домашнюю клетку только после полного восстановления, оцениваясь по нормальной осанке, активности и кормлению.
  5. Удержите ротовую полость открытой с помощью кляпа и примените смесь 5 мкл до 50 мкл из двух или более парацеллюлярных проницаемых индикаторов с разной молекулярной массой местно на поверхность губной десни молярной области (рисунок 1B). Оставьте на 30 минут. Если животное проглотит смесь, нанесите её снова.
  6. Изоляция верхней челюсти
    1. Через 30 минут применения индикаторов проницаемости закрепите мышей на картоне, положите их в положение на спине и заклейте конечности.
    2. После фиксации откройте ротовую полость для выделения верхней челюсти. Аккуратно очистите окружающие ткани и тщательно прополосните образец PBS.
    3. Поместите верхнюю челюсть на стеклянную форму, с обеих сторон для моделирования глины для надёжного крепления накладки на образец.

2. Установка однофотонного микроскопа

  1. Аккуратно поместите расчленённую верхнюю челюсть мыши на специально разработанный держатель для образцов, обеспечив стабильное расположение для съёмок.
  2. Получайте изображения с помощью вертикального однофотонного микроскопа с водяным погружением 25×/NA 1.0, с фокусом на закреплённой области под верхней челюстью.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентные сигналы должны быть видны сразу после снятия трассерного геля.

3. Визуализация верхней челюсти

  1. Начинайте визуализацию сразу после выбора интересующей области на щечной поверхности второго моляра в верхней челюсти.
  2. Получить изображения Z-стека с шагом 1 мкм, начиная с верхней челюсти до глубины 100-200 мкм, для трёхмерной (3D) реконструкции.
  3. Проведите визуализацию серии Z, чтобы оценить проницаемость эпителиального барьера в верхней челюсти. Настройте параметры программного обеспечения в указанном ПО следующим образом:
    1. В меню Файл создайте новую папку и присвоите ей описательное имя для набора данных.
    2. Во вкладке Acquisition установите формат XY на 512 × 512 с разрешением 0,99 мкм/пиксель.
    3. Установить коэффициент увеличения на 1.
    4. Установите длины волн возбуждения на 488 нм (FD40) и 561 нм (RD70), с окнами излучения 500-550 нм и 570-620 нм соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значения усиления были установлены на 50 (488 нм) и 60 (561 нм) соответственно.
    5. Для серии Z и 3D-изображения выберите режим ND Acquisition. Установите Z-step на 1 мкм (регулируйте по необходимости).
  4. После настройки параметров выберите режим Live , чтобы визуализировать десневую область как в отдельных, так и в объединённых флуоресцентных каналах внутри окна изображения.
  5. Нажмите «Запустить сейчас», чтобы начать приобретение после настройки параметров.

4. Измерение проницаемости

  1. Разделите интенсивность флуоресценции FD40 и RD70 на разные каналы. Фоновый вычитание не требуется; объединить срезы по оси Z. Затем используйте программное обеспечение ImageJ, чтобы рассчитать интенсивность флуоресценции, оценить проницаемость и указать функцию эпителиального барьера.
    1. Нажмите «Файл» и выберите «Открыть», чтобы открыть изображение верхней челюсти, сделанное под однофотонным микроскопом.
    2. Перейдите в меню «Изображение » и измените тип изображения на 8-битный формат для анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения, полученные флуоресцентными микроскопами и конфокальными системами, как правило, выполнены в формате RGB и не могут использоваться напрямую для измерения интенсивности флуоресценции. Их нужно разделить на отдельные каналы или импортировать монохромные изображения напрямую.
    3. Откройте меню Анализ , выберите Set Dimensions и отметьте Area, Mean и IntDen. Подтвердите, нажав OK.
    4. Выберите канал для анализа и отрегулировайте порог: Перейти к Изображение | Корректируйте | Порог. Система автоматически применяет значение по умолчанию и алгоритм, обычно используя красный цвет для обозначения выбранных регионов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку флуоресцентные изображения обычно имеют чёрный фон, также выберите опцию «Тёмный фон ».
    5. Задайте параметры измерения: перейдите в раздел «Анализ » и выберите «Измерения набора». В диалоговом окне отметьте Mean Gray и Limit to threshold. Наконец, нажмите OK.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется отметить метку «Отображение », чтобы название изображения отображалось в таблице результатов, что облегчает идентификацию экспериментальной группы.
    6. Выполните измерение: выберите инструмент свободного выбора . Используйте курсор, чтобы вручную и точно обвести контур области флуоресцентного сигнала на стороне десневой ткани. Нажмите Анализ | Измеряйте. Появится таблица результатов, где IntDen представляет интенсивность флуоресценции.
  2. Скопируйте результаты в таблицу для вычислений и импортируйте для построения графиков.
  3. Расчёт относительной интенсивности флуоресценции: Сначала рассчитайте среднюю интенсивность флуоресценции контрольной группы. Затем разделите значение интенсивности флуоресценции каждой экспериментальной группы на среднее по контрольной группе, чтобы получить относительную интенсивность флуоресценции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Согласно стандартизированному протоколу, верхняя челюсть мыши, содержащая ткани дессен, была закреплена на специально разработанном держателе (рисунок 1C). Микроскопическое исследование выявило зелёные (FD40) и красные (FD70) флуоресцентные сигналы в дессенах, что демонстрирует проникновение трассеров через эпителиальный барьер. После определения области интереса под глазной линзой изображения были получены с помощью программного обеспечения. В контрольной г...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Десневой эпителий служит важным физическим барьером против бактериального вторжения, в то время как оральные микроорганизмы обладают двойной регуляторной способностью, либо нарушая целостность барьера факторами вирулентности, либо способствуя его поддержанию. Эти биологические взаимодействия в конечном итоге определяют гомеостаз тканей или прогрессирование заболевания17,18. Опираясь на эту основу, мы разработали инновационный мет...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликтов интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (гранты 32030010, 31972908, 81991500, 81991502).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
40 kDa FITC-labeled dextranSigma Aldrich78331
70 kDa rhodamine B-labeled dextranSigma AldrichR9379
Blunt tissue separation nickelBejinghuabo CompanyNZW28
carboxymethylcelluloseMREDAM049898
Disposable sterile syringeZhiyu Company1 мл
ImageJ softwareNational Institutes of Health
MicrotubesAxygenMCT-150-C1.5 мл
NIS-Elements AR Image SoftwareNikon
Phosphate buffered saline 1xServicebioG4207-500
Single photon microscope Nikon A1 MP+Nikon
Tissue scissorsBejinghuabo CompanyM286-05

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, C., et al. Study on the protection of gingival epithelial barrier by interleukin-22 through regulating microbiota and E-cadherin expression. Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. 59 (7), 653-662 (2024).
  2. Presland, R. B., Jurevic, R. J. Making sense of the epithelial barrier: what molecular biology and genetics tell us about the functions of oral mucosal and epidermal tissues. J Dent Educ. 66 (4), 564-574 (2002).
  3. Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
  4. Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J Clin Microbiol. 43 (11), 5721-5732 (2005).
  5. Meyle, J., Chapple, I. Molecular aspects of the pathogenesis of periodontitis. Periodontol 2000. 69 (1), 7-17 (2015).
  6. Oriuchi, M., et al. Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide damages mucosal barrier to promote gastritis-associated carcinogenesis. Dig Dis Sci. 69 (1), 95-111 (2024).
  7. Takeuchi, H., Nakamura, E., Yamaga, S., Amano, A. Porphyromonas gingivalis infection induces lipopolysaccharide and peptidoglycan penetration through gingival epithelium. Front Oral Health. 3, 845002(2022).
  8. Abe, T., Hajishengallis, G. Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice. J Immunol Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).
  9. Chatterjee, A., Bhattacharya, H., Kandwal, A. Probiotics in periodontal health and disease. J Indian Soc Periodontol. 15 (1), 23-28 (2011).
  10. Shin, D., et al. Photon-efficient imaging with a single-photon camera. Nat Commun. 7, 12046(2016).
  11. Yang, X., et al. Targeting endothelial tight junctions to predict and protect thoracic aortic aneurysm and dissection. Eur Heart J. 44 (14), 1248-1261 (2023).
  12. Cai, Y., et al. Foxf1 maintains endothelial barrier function and prevents edema after lung injury. Sci Signal. 9 (424), ra40(2016).
  13. Hou, A., Mohamed Ali, S., Png, E., Hunziker, W., Tong, L. Transglutaminase-2 is critical for corneal epithelial barrier function via positive regulation of claudin-1. Ocul Surf. 28, 155-164 (2023).
  14. Kitsuki, T., et al. Enhanced junctional epithelial permeability in trpv4-deficient mice. J Periodontal Res. 55 (1), 51-60 (2020).
  15. Chen, W., et al. Porphyromonas gingivalis impairs oral epithelial barrier through targeting grhl2. J Dent Res. 98 (10), 1150-1158 (2019).
  16. Lemaitre, M., et al. Periodontal tissue regeneration using syngeneic adipose-derived stromal cells in a mouse model. Stem Cells Transl Med. 6 (2), 656-665 (2017).
  17. Takahashi, N., et al. Gingival epithelial barrier: regulation by beneficial and harmful microbes. Tissue Barriers. 7 (3), e1651158(2019).
  18. Ye, P., Chapple, C. C., Kumar, R. K., Hunter, N. Expression patterns of E-cadherin, involucrin, and connexin gap junction proteins in the lining epithelia of inflamed gingiva. J Pathol. 192 (1), 58-66 (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Gingival Epithelial BarrierFluorescent TracersOral ImmunityBarrier IntegrityMouse GingivaSingle Photon MicroscopyDextran TracersOral InflammationWound HealingDisease Modeling

Похожие статьи