С помощью таймлапс-визуализации можно проследить полный процесс регенерации сфероидов Гидры . Этот протокол описывает генерацию сфероидов Гидры , рассматривает различные стратегии крепления и подробно описывает, как проводить долгосрочную живую визуализацию с использованием вращающейся дисковой конфокальной микроскопии, а также световой флуоресцентной микроскопии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Подготовка и живые визуализации регенерирующих сфероидов Гидры
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Гидра славится своей исключительной регенеративной способностью. Удивительно, но небольшие регенерирующие фрагменты ткани Гидры , называемые сфероидами Гидры , могут создавать органайзер de novo. После установления этот органайзер направляет окружающую ткань к дифференциации в соответствующие структуры полости рта. В течение нескольких дней сфероид может развиться в небольшой, но полностью оформленный полип. Относительно короткий временной масштаб этого процесса позволяет непрерывно снимать весь процесс с таймлапсом, предоставляя уникальную возможность для изучения пространственно-временной динамики регенерации. Здесь мы представляем подробный рабочий процесс и демонстрируем репрезентативные результаты для генерации таймлапс-наборов регенерирующих сфероидов Гидры . Протокол включает подробную процедуру генерации сфероидов и рекомендации по выбору оптимальных образцов для визуализации. Мы обсуждаем стратегии монтажа, подходящие для долгосрочной визуализации живых образцов, и демонстрируем подходы визуализации с использованием как вращающегося дискового конфокального, так и светового листового микроскопов. Описанные здесь принципы широко применимы к другим модельным системам, в которых динамические морфогенетические процессы можно изучать с помощью долгосрочной визуализации.
Введение
Гидра — небольшой пресноводный полип, наиболее известный своей исключительной регенеративной способностью. Фрагменты ткани, вырезанные из середины тела, складываются в полый сфероид, состоящий из двух эпителиальных слоёв Гидры — эктодермы и энтодермы. Во время регенерации эти сфероиды Гидры образуют органайзер de novo1. Примерно через 3 дня ось тела удлиняется, и клетки на конечностях головы и стопы дифференцируются. Благодаря относительно короткому времени весь процесс регенерации можно зафиксировать с помощью живой визуализации. Наборы данных с таймлапсом сыграли ключевую р....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все описанные процедуры выполнялись в соответствии с этическими нормами швейцарских национальных правил по исследованиям на животных. Перед началом эксперимента Гидру следует кормить нормально, 3 раза в неделю, как минимум 2 недели. Гидра , используемая для экспериментов, должна бытьздоровой в 12 лет, без половых органов и без почков. Недавно выросшую гидру, которую можно узнать по меньшей длине по сравнению с другими гидрами в колонии, также следует избегать.
1. Подготовка сфероидов Гидры (рисунок 1
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мы успешно сгенерировали долгосрочные наборы данных с таймлапсом для регенерации сфероидов Гидры с использованием как вращающейся дисковой конфокальной микроскопии (SDCM), так и световой флуоресцентной микроскопии (LSFM). Регенерация происходила нормально в обеих установках визуализации: сфероиды нарушили симметрию, удлинились и развили щупальца и стопу в течение 3 дней (рисунок 5A, рисунок 6A, дополнительное ви.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
И SDCM, и LSFM хорошо подходят для генерации долгосрочных таймлапс-наборов регенерирующих сфероидов Гидры. Оптические принципы, на которых основана каждая техника, уникальны и, следовательно, обладают уникальными преимуществами и ограничениями (Таблица 2). SDCM предпочтительнее, если не требуется полное, высокоразрешающее изображение образца. В одном эксперименте можно сфотографировать несколько образцов, что делает его особенно полезным для тестирования различн.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Лор Плантар из Центра передовой визуализации и микроскопии FMI за её ценный вклад. Эта работа была поддержана исследовательским фондом Novartis.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
```html
```
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 20×/0.8 объектив Plan-Apochromat | Zeiss | 440640-9903-000 | Для конфокальной микроскопии с вращающимся диском |
| Объектив 20×/1.0 W Plan-Apochromat с погружением в воду | Zeiss | 421452-9700-000 | Используется в качестве детектирующего объектива в Zeiss Lightsheet 7 |
| 3D-печать держатель для монтажа камеры FEP | изготовлен по заказу | ||
| Импульсная пластинка со стеклянным дном на 4 колодца (№1.5H) | Ibidi | 80427 | |
| Агароза | Carl Roth | 3810.4 | |
| Алюминиевый формовочный блок для камеры FEP | изготовлен по заказу | ||
| Хлорид кальция | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Сжатый воздух | Durable | POWERCLEAN STANDARD 400 | |
| Культуральная тарелка (6 см) | Thermo Fisher Scientific | 150288 | |
| D-(+)-глюкоза | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Фольга FEP (толщина 127 мкм) | Adtech Polymer Engineering | ||
| FluoSpheres с карбоксилатно-модифицированной поверхностью (0.2 мкм, темно-красные) | Thermo Fisher Scientific | F8807 | |
| Стеклянный капилляр | Brand | 701904 | |
| Стеклянная пастеровская пипетка (150 мм) | VWR | 612-1701 | |
| Hydra vulgaris | |||
| Программное обеспечение для имэйджинг | Visitron | VisiView | Для конфокальной микроскопии с вращающимся диском |
| Инвертированный световой микроскоп | Zeiss | Axio observer 7 | Для конфокальной микроскопии с вращающимся диском |
| Микроскоп светового листа | Leica | Viventis Deep LS2 | |
| Микроскоп светового листа | Zeiss | Lightsheet 7 | |
| Агароза с низкой температурой плавления | Thermo Fisher Scientific | R0801 | |
| Хлорид магния | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Сульфат магния | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Микроскальпель | pfm medical | 200300745 | |
| Резинка для пипеток | |||
| Трансферпеттор с поршневой трубкой | Brand | 701932 | |
| Хлорид калия | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Бензиновая горелка Bunsen | INTEGRA Biosciences | FIREBOY plus | |
| sCMOS-камеры | Photometrics | Prime 95B | Для конфокальной микроскопии с вращающимся диском |
| Бикарбонат натрия | Fluka Analytical, Sigma-Aldrich | 71630 | |
| Дигидроглицинат натрия | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| Пируват натрия | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Сканирующая единица конфокального микроскопа с вращающимся диском (с отверстиями 50 мкм) | Yokogawa | CSU-W1 | Для конфокальной микроскопии с вращающимся диском |
| Стереоскоп | Leica | M80 | |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | |
| Термоформовщик | Yuyao Jintai Machine Factory | Jintai JT-18 | |
| Тканевая культуральная чаша (10 см) | VWR | 734-2321 | |
| Буфер Tris-HCl | Roche Diagnostics | 10812846001 |
Ссылки
- Bode, P. M., Bode, H. R. Formation of pattern in regenerating tissue pieces of hydra attenuata: I. Head-body proportion regulation. Dev Biol. 78 (2), 484-496 (1980).
- Fütterer, C., Colombo, C., Jülicher, F., Ott, A. Morphogene....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
