Это исследование показывает, что Tanshinone IIA (Tan IIA) смягчает фиброз после инфаркта миокарда, вероятно, с помощью модуляции IL-33/ST2, как показано на животных моделях и молекулярном стыковке, а также подтверждено ELISA и Western blot.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Исследовательская статья
* These authors contributed equally
Это исследование показывает, что Tanshinone IIA (Tan IIA) смягчает фиброз после инфаркта миокарда, вероятно, с помощью модуляции IL-33/ST2, как показано на животных моделях и молекулярном стыковке, а также подтверждено ELISA и Western blot.
Инфаркт миокарда (МИ), тяжелая форма ишемической болезни сердца, часто приводит к фиброзу миокарда, являющемуся ключевым фактором сердечной дисфункции и сердечной недостаточности. Эпикардиальная жировая ткань (EAT) всё больше участвует в сердечно-сосудистой патологии через цитокин-опосредованный модуляцию сердечно-сосудистой функции. Tanshinone IIA (TanIIA) — липофильное соединение, полученное из Salvia miltiorrhiza, обладающее противовоспалительными, антиоксидантными и противофиброзными свойствами. Целью данного исследования было оценить терапевтический потенциал TanIIA в ослаблении пост-инфарктивного миокарда фиброза и изучить его основные механизмы с помощью интегративного подхода, сочетающего эксперименты in vivo и in silico анализы. Была создана мышиная модель MI, а для оценки связывания TanIIA с ключевыми компонентами сигнального пути экспрессированного гена 2 (IL-33/ST2), экспрессированного интерлейкином-33/стимуляцией роста, был использован молекулярный докинг. Наши результаты показали, что лечение TanIIA значительно улучшало функцию сердца, снижало гистологические повреждения и смягчало фиброз миокарда, а также снижало уровень N-концевого про-мозгового натриуретического пептида (NT-proBNP) и высокочувствительного сердечного тропонина I (hs-cTnI). TanIIA также ослаблял воспалительные реакции и окислительный стресс в сыворотке, миокарде и EAT. Механистически TanIIA понизил экспрессию IL-33 и ST2, подавил путь фактора дифференцировки миелоидов 88 (MyD88)/ядерный фактор каппа-B (NF-κB) и снизил уровень трансформирующего фактора роста-β1 (TGF-β1). Анализ in silico также показал, что TanIIA демонстрирует сильные связывающие сродства с IL-33, ST2, MyD88 и NF-κB p65, при этом наиболее стабильное взаимодействие прогнозируется для ST2. В совокупности эти результаты показывают, что TanIIA облегчает миокардиальный фиброз, индуцированный МИ, модулируя воспаление и окислительный стресс, связанный с EAT, потенциально через многоцелевое ингибирование оси IL-33/ST2. Эти результаты подтверждают TanIIA как перспективного терапевтического кандидата для лечения постинфарктного фиброза миокарда.
Инфаркт миокарда, патологически определяемый как смерть кардиомиоцитов вследствие длительной ишемии, остаётся угрожающим жизни сердечно-сосудистымсобытием 1. Несмотря на значительные достижения в реперфузионных стратегиях и фармакотерапии, инфаркт МИ остаётся ведущей причиной заболеваемости и смертности во всёммире 2,3,4,5,6. Ключевым патофизиологическим следствием ИМ является миокардиальный фиброз — чрезмерное отложение внеклеточных матриксовых белков, который является основным фактором последующих неблагоприятных клиническихисходов 7. Это фиброзное рубцовство, хотя и необходимо для предотвращения разрыва стенок желудочка, часто превращается в процесс дезадаптивного восстановления, запускаемого сложными воспалительными и межклеточные сигнальныепути 5,7,8,9,10. Заменяя функциональный миокард неконтрактильной рубцовой тканью, мальадаптивный фиброз приводит к увеличению скованности желудочков, прогрессирующей сердечной дисфункции и, в конечном итоге, сердечнойнедостаточности 9,11. Поэтому исследование новых фармакологических методов лечения, направленных на цель и ослабление постинфарктного фиброза, является критически важной терапевтической целью для повышения долгосрочной заболеваемости и смертности пациентов.
Salvia miltiorrhiza (Danshen), традиционная китайская медицина, и её различные препараты широко применяются для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Таншинон IIA, его основной липофильный компонент, обладает множеством кардиопротекторных свойств, включая антиатеросклеротические, антимиокардиальные ишемические и антиоксидантныеэффекты 12,13,14,15. Механистически TanIIA оказывает противовоспалительные и противофиброзные эффекты, модулируя различные сигнальныепути 13,14,15,16,17. Примечательно, что TanIIA напрямую нацеливается на адипоциты, подавляя их воспалительные реакции и тем самым смягчая клеточнуюдисфункцию 18. Однако, распространяются ли эти защитные эффекты TanIIA на жировую ткань эпикарда, остаётся выясненным.
Эпикардиальная жировая ткань, уникальный висцеральный жировой депо, тесно участвует в патогенезе ишемической болезни сердца (ХПР), фибрилляции предсердий (ФП) и сердечной недостаточности. Анатомически расположенный между миокардом и висцеральным слоем эпикарда без промежуточного фасциального слоя, EAT способствует прямой паракринной связи с соседними сердечнымиструктурами 19,20,21,22. В своём физиологическом состоянии EAT является кардиопротективным, обеспечивая метаболическую поддержку и выделяя противовоспалительные и антиоксидантныеадипокины 20,21,23,24,25,26. Напротив, при патологических состояниях EAT становится источником провоспалительных, прооксидативных и профиброзных медиаторов, которые вызывают неблагоприятное переустройствосердца 27,28,29,30. В результате была сформулирована гипотеза, что TanIIA может подавлять фиброз миокарда, ослабляя воспалительные реакции и окисляющий стресс в эпикардиальных жирах, потенциально через новый сигнальный путь.
Интерлейкин-33, член семейства цитокиновIL-1 31, известен своими мощными антигипертрофическими и антифиброзными свойствами в сердечно-сосудистойсистеме 25. Его биологические эффекты опосредованы отдельным рецепторным комплексом ST2, который существует в двух изоформах: трансмембранном рецепторе (ST2L), который инициирует сигнализацию, и растворимом приманщике (sST2), который удерживаетIL-3333. Клинически уровни sST2 в сыворотке резко повышаются после инфаркта миокарда (МИ) и служат надёжным прогностическим маркером неблагоприятных исходов при сердечной недостаточности и миокардите 33,34,35,36. Канонический сигнальный каскад IL-33/ST2L включает рекрутацию адаптерного белка MyD88 и последующей активации TRAF6, что приводит к фосфорилированию и деградации ингибитора NF-κB (IκB) и последующей ядерной транслокацииNF-κB 37,38. Этот путь тесно связан с другими ключевыми воспалительными цитокинами; например, сигнализация IL-33/MyD88 может способствовать секреции противовоспалительного цитокина IL-1039, тогда как провоспалительный цитокин TNF-α может, в свою очередь, усиливать воспалительный ответ, активируя NF-κB для индуцирования экспрессииIL-33 40,41. Важно, что и IL-33, и ST2 экспрессируются в жировой ткани, где, как считается, оказывают локальное противовоспалительныеэффекты 31,42,43. Однако вопрос, связаны ли кардиопротекторные эффекты TanIIA с модуляцией оси IL-33/ST2, пока не изучены.
Поэтому данное исследование было направлено на проверку центральной гипотезы о том, что TanIIA предотвращает фиброз миокарда, смягчая воспаление и окислительный стресс, возникающие из жировой ткани эпикарда, за счёт модуляции пути IL-33/ST2. В частности, мы выдвинули гипотезу, что это терапевтическое действие обусловлено прямым многоцелевым взаимодействием TanIIA с ключевыми белками в этом сигнальном каскаде. Чтобы подтвердить это, мы применили двойной подход. Во-первых, модель инфаркта миокарда на крысе была использована для подтверждения эффективности TanIIA in vivo в ослаблении неблагоприятного ремоделирования сердца. Во-вторых, чтобы предоставить прямую молекулярную основу для этих наблюдений, была использована вычислительная стыковка для характеристики потенциального связывания TanIIA с четырьмя ключевыми узлами пути — IL-33, ST2, MyD88 и NF-κB p65. Исследуя механизм от уровня тканей до специфических молекулярных связывающих событий, данное исследование направлено на создание новой механистической основы кардиопротекторных эффектов TanIIA.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Все экспериментальные процедуры и практики по защите животных проводились в строгом соответствии с Этическими правилами по уходу и использованию лабораторных животных Комитета по этичным животным Цзянсийского университета китайской медицины (No JZLLSC2023-0702), Китай.
Симуляции молекулярного стыковки
Для изучения прямых взаимодействий между TanIIA и IL-33, ST2L, MyD88 и NF-κB p65 был применён подход молекулярного стыковки . 3D-координаты TanIIA были получены из базы данных PubChem, и первоначальный файл SDF впоследствии был преобразован в формат PDB. Кристаллическая структура IL-33 (PDB ID: 4KC3), ST2L (PDB ID: 4KC3), MyD88 (PDB ID: 7L6W) и NF-κB p65 (PDB ID: 1NFI) была получена из белкового банка данных. Первичная обработка рецептора проводилась в PyMOL (v2.3.4), где молекулы воды и исходные лиганды удалялись, а затем проводилась дальнейшая подготовка в AutoDockTools для добавления и распределения заряда водорода. Обе молекулы в конечном итоге были преобразованы в формат PDBQT. AutoDock Vina (v1.1.2) использовался для симуляции стыковки в определённой сетке, центрированной на активном месте. Оптимальная поза для связывания была выбрана на основе минимальной энергии связывания, а детальные взаимодействия были выявлены с помощью веб-инструмента PLIP. Окончательная стыковка была визуализирована с помощью PyMOL (v2.3.4).
Животные
Самцы крыс Sprague-Dawley (SD), класс SPF, возраст 6 недель и вес 200 ± 20 г (сертификат No SCXK(Su)2023-0009). Крысы содержались в стандартизированных условиях, включая 12-часовой цикл свет/тьма и температуру 22 °C ± 2 °C. Во время эксперимента животным был разрешён неограниченный доступ как к еде, так и к воде.
Экспериментальный протокол
Модель инфаркта миокарда у крыс была установлена путём связки левой передней нисходящей (LAD) коронарной артерии. Крысы, оперированные с помощью Sham, проходили те же хирургические процедуры без LAD-перевязки. Кратковременно крыс подвергались анестезии с помощью внутрибрюшной инъекции пентобарбитала 1% натрия (50 мг/кг), затем эндотрахеальной интубации и вентиляции. Была проведена левая торакотомия для обнажения сердца. Затем LAD был перевязан швом 4-0, не васывающимся. Успешная индукция инфарктива была подтверждена поднятием сегмента ST на непрерывной электрокардиограмме и видимым бланшированием передней стенки левой желудочки. После операции крысы получали цефокситин натрия (200 мг/кг/сутки, в течение трёх дней). Через двадцать четыре часа после операции выживших крыс случайным образом разделили на шесть групп (n = 10 на группу):
Фиктивная группа: получали внутрибрюшинные инъекции физиологического раствора (1 мл·кг-1,�день).
Группа с инфарктом инфарктивного раствора (1 мл·кг-1,1-1 день).
Группа TanIIA-L (низкая доза): получали внутрибрюшинные инъекции TanIIA (7,5 мг·кг-1·1-день).
Группа TanIIA-M (средняя доза): получали внутрибрюшинные инъекции TanIIA (15 мг·кг-1·1-1-дневные).
Группа TanIIA-H (высокая доза): получали внутрибрюшнические инъекции TanIIA (30 мг·кг-1,�1-день).
Группа XST (положительный контроль): получена пероральная вентиляция валсартана (30 мг·кг-1·1-1-1).
Все процедуры проводились ежедневно в течение 28 дней подряд. Дозы TanIIA и XST были выбраны на основе предыдущих исследований и наших предварительных неопубликованных данных44,45.
Электрокардиограмма (ЭКГ) и эхокардиография
После 28 дней лечения функция сердца была оценена с помощью трансторакальной эхокардиографии. При 2% изофлурановой анестезии (режим движения) были получены изображения в режиме М для определения диаметров левого желудочка, энд-диастолический/систолический диаметр (LVIDd/s). Фракция выброса левого желудочка (LVEF) и фракционное сокращение (LVFS) были рассчитаны в среднем из трёх последовательных сердечных циклов. Кроме того, электрокардиограммы записывались до операции, через 15 минут после перевязки и в экспериментальной конечной стадии для мониторинга электрической активности сердца.
Отбор проб и окрашивание хлоридом 2,3,5-трифенилтетразолия (TTC)
Кровь из брюшной аорты центрифугировала при 1370 × г в течение 15 минут для выделения сыворотки, которая хранилась при -80 °C. Сердечная и эпикардиальная жировая ткань были быстро удалены и взвешены. Для молекулярных анализов ткани EAT и инфарктных пограничных зон были мгновенно замораживаны в жидком азоте и хранятся при -80 °C. Другие образцы тканей были зафиксированы в 4% параформальдегиде для гистологического исследования. Кроме того, выбранные сердца были заморажены при -20 °C, сечение и окрашены TTC для оценки размера инфаркта. Материалы и ткани животных используются и обрабатываются в соответствии с лабораторными нормами безопасности.
Гистологическое исследование
Для гистопатологической оценки парафиновые срезы подвергались окрашиванию гематоксилином и эозином (H&E) для наблюдения морфологии миокарда. Трихромное окрашивание Массона использовалось для оценки степени миокардиального фиброза и размера эпикардиальных адипоцитов, при этом количественно оценивалась доля объема коллагена (CVF). Кроме того, соотношение коллагена типа I и типа III в неинфарктированной области было определено с помощью окрашивания красного (PSR). Все разделы были отсканированы цифровым способом для количественного анализа.
Иммуногистохимия
Срезы миокарда, вложенные в парафин, были депарафинированы и регидратированы. Анализ антигена проводился с использованием цитратного буфера (pH 6,0). Срезы блокировались 3% BSA, затем инкубировали ночью при 4 °C с первичными антителами против коллагена I, коллагена III, IL-33, ST2, MyD88, NF-κB p65 и TGF-β1. Затем срезы инкубировали с вторичным антителом, маркированным HRP, в течение 1 часа при комнатной температуре. Окрашивание визуализировалось с помощью DAB, а ядра контрокрашивались гематоксилином. Изображения были сделаны с помощью цифрового сканера и анализировались с помощью программного обеспечения для анализа изображений для количественной оценки интегрированной оптической плотности (IOD) положительного окрашивания.
Ферментно-связанный иммуносорбентный анализ
Концентрации hs-cTnI, NT-proBNP, IL-33 и ST2 были количественно измерены в образцах сыворотки. Кроме того, уровни IL-10 и TNF-α измерялись в сыворотке, гомогенатах миокарда и лизатах жировой ткани эпикарда. Все анализы проводились с использованием коммерчески доступных наборов для ферментно-связанного иммуноферментного анализа (ELISA) согласно протоколам производителя.
Вестерн блоттинг
Общий белок извлекался из гомогенатов ткани, а концентрации определялись с помощью анализа на бицинхониновую кислоту (BCA). Равные количества белка отделялись электрофорезом геля натрия додецилсульфата и полиакриламида (SDS-PAGE) и переносились на мембраны поливинилиденфторида (PVDF). После блокировки 5% обезжиренным молоком мембраны инкубировали ночью при 4 °C с первичными антителами против IL-10, фактора некроза опухолей α (TNF-α), IL-33, ST2, NF-κB p65, TGF-β1 и GAPDH (1:1000). Впоследствии мембраны инкубировали с помощью вторичного антитела, конъюгированного с HRP (1:5000), и визуализировали с помощью реагента ECL. Интенсивность полос измерялась с помощью программного обеспечения, а уровень белка нормализовался до GAPDH как внутренний контроль.
Статистический анализ
Все статистические анализы проводились с использованием программного обеспечения для медицинской статистики. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Для сравнения между двумя независимыми группами использовался t-тест. В случае нескольких групп применялся либо односторонний, либо двусторонний ANOVA с последующим пост-хок тестом Tukey. Для всех анализов P < 0,05 считался статистически значимым.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Влияние TanIIA на функцию сердца у крыс с инфарктом миокарда (Рисунок 1)
Состояние здоровья и изменения массы тела: Крысы в группе с инфарктом показали плохое общее состояние, с вздутием живота, тогда как крысы в группах TanIIA — улучшенным состоянием здоровья, увеличением потребления пищи и воды, а также повышенной активностью. Через 4 недели у крыс группы TanIIA наблюдалось значительное увеличение массы...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
В настоящем исследовании изучаются эффекты TanIIA на фиброз миокарда после инфаркта миокарда, а также связанные с этим механизмы. Основные признаки следующие: (1) TanIIA ослабляет неблагоприятное ремоделирование сердца и улучшает функцию сердца, подавляя сердечный фиброз. (2) Обнаружено, что TanIIA ингибирует миокардиальный фиброз, ослабляя воспалительные реакции и окисляющий стресс в эпикардиальных жирах. (3) TanIIA опосредует антифиброзные эффекты через сигнальный путь IL-33/ST2.
<...Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, описанную в этой статье.
Исследование было поддержано Высшей дисциплиной провинции Цзянси — Дисциплиной китайской и западной интегративной медицины Университета китайской медицины Цзянси (zxyylxk20220103). Дополнительное финансирование было получено благодаря нескольким инициативам при поддержке Сяомин Вана, включая научно-технический исследовательский проект провинциального департамента образования провинции Цзянси (GJJ2200940), проект команды преподавателей высшего уровня студентов бакалавриата Цзянси (2020008), проект реформы послевузовского преподавания в Цзянси (JXYJG2019117), качественные курсы для аспирантов провинции Цзянси (2020041) и проект инноваций студентов бакалавриата Цзянси университета китайской медицины (2023091). Спонсор участвовал в разработке исследования, решении о публикации и подготовке рукописи.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Комплект для количественной оценки белков BCA | Корпорация Thermo Fisher | PICPI23223 | |
| Набор CAT | Shanghai Enzyme Link Биотехнология | 202211202 | |
| Антитело к коллагену I | Wuhan Servicebio Biotechnology Co., Ltd | GB114197 | |
| Антитело к коллагену III | Shenyang Wanleibio Biotechnology Co., Ltd | WL03186 | |
| Антитела к GAPDH | Корпорация Cell Signaling Technology | #5174 | |
| GraphPad Prism | Корпорация программного обеспечения GraphPad | версия 9.0 | |
| Комплект GSH | Shanghai Enzyme Link Биотехнология | 202211131 | |
| H& Раствор для окрашивания электронных электронов | Beijing Solarbio Technology Co., Ltd | H8070; G1100 | |
| Антитела IgG, маркированные HRP-мечеством для коз против кроликов | Beijing Solarbio Technology Co., Ltd | SE134 | |
| Hs-cTnI Набор | Шанхайская биотехнологическая компания Юаньцзе | 20220808 | |
| Антитела к ИЛ-10 | Shenyang Wanleibio Biotechnology Co., Ltd | WL03088 | |
| IL-10 Набор | Шанхайская биотехнологическая компания Юаньцзе | 202211172 | |
| IL-33 Набор | Шанхайская биотехнологическая компания Юаньцзе | 202211192 | |
| Антитела к IL-33 | Shenyang Wanleibio Biotechnology Co., Ltd | WL04438 | |
| Программное обеспечение ImageJ | Национальные институты здравоохранения | версия Фиджи | |
| Image-Pro | Media Cybernetics, США | Версия 6.0 | |
| Самцы крыс Спраг-Доули (SD) | Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd | SCXK(Su)2023-0009 | |
| Набор для окрашивания Masson | Wuhan Bolf Biotechnology Co., Ltd | 20221218 | |
| Комплект MDA | Shanghai Enzyme Link Биотехнология | 202211171 | |
| Антитело MyD88 | Shenyang Wanleibio Biotechnology Co., Ltd | WL02494 | |
| NT-proBNP Набор | Шанхайская биотехнологическая компания Юаньцзе | 20220805 | |
| Ядерный фактор kappa-B(NF-κ B)(p65) антитела | Abmart Corporation | TP56372 | |
| Открытый Вавилон | Проект инструментария с открытым исходным кодом по химической информатике | Версия 2.3.2 | |
| Мембраны поливинилиденфторида (PVDF) | Мерк Миллипор | R9M2784 | |
| Решение PSR | Beijing Solarbio Technology Co., Ltd | G1472 | |
| Комплект SOD | Shanghai Enzyme Link Биотехнология | 202211201 | |
| Антитела к ST2 | Корпорация Proteintech Group | 11920-1-AP | |
| Комплект ST2 | Шанхайская биотехнологическая компания Юаньцзе | 202211183 | |
| Статистические решения для продуктов и услуг (SPSS) | Корпорация IBM | Версия 26.0 | |
| Инъекция сульфотаншинона натрия | Shanghai Pharmaceutical First Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd | 2012303 | |
| Сверхчувствительный люминесцентный реагент ECL | Биотехнологическая компания Далянь Мэйлунь | MA0186 | |
| TGF-и бета; 1 антитело | Корпорация ABclonal | A2124 | |
| Капсула Titanvin Valsartan | Hunan Qianjin Xiangjiang Pharmaceutical Co., Ltd | 211120 | |
| TNF и альфа; Набор | Шанхайская биотехнологическая компания Юаньцзе | 202211202 | |
| TNF и альфа; Антитела | Shenyang Wanleibio Biotechnology Co., Ltd | WL01581 | |
| Решение TTC | Fuzhou Phygene Biotechnology Co., Ltd | 20210620 | |
| Ультравысокоразрешающая система ультразвуковой визуализации для мелких животных | VEVOcompany | Vevo 2100 |