Методическая статья

Колориметрическая оценка активности дейодиназы 1 в микросомах печени человека с помощью реакции Санделла-Кольтхоффа

671 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70104

⸱

10 апреля 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Experimental Toxicology and Ecology, BASF SE, 2Pharmacy, Pharmacology and Toxicology, Free University of Berlin, 3German Federal Institute for Risk Assessment (BfR), German Centre for the Protection of Laboratory Animals (Bf3R)

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает колориметрический метод для надёжной оценки влияния химических веществ на активность дейодиназы 1 (DIO1) в микросомы печени человека с помощью реакции Санделла–Кольтхоффа. Он включает заранее определённые критерии приема и статистические показатели эффективности, а также поддерживает постоянные усилия по включению тестовых рекомендаций ОЭСР.

Аннотация

Этот метод позволяет выявлять тестовые вещества, которые подавляют активность DIO1 и, следовательно, могут нарушать гомеостаз гормонов щитовидной железы. Представленный протокол описывает нерадиоактивный колориметрический метод оценки влияния тестовых веществ на ферментативную активность дейодиназы 1 (DIO1) в микросомы печени человека. Анализ основан на реакции Санделла-Кольтхоффа (SK), которая количественно определяет йодид, выделяющийся при дейодировании обратного трийодотиреонина (rT3) в дийодотиронин (T2). Жёлтый церий (IV) восстанавливается до бесцветного церия (III) в присутствии йодида, что позволяет фотометрическое обнаружить на расстоянии 415 нм. В этой стандартизированной системе концентрация церия (IV) устанавливается на уровне 40 мМ для повышения стабильности и прочности сигнала в описанных условиях. Для обеспечения надёжности и воспроизводимости анализов включена комплексная контрольная система: 6-пропил-2-тиурацил (эталонный продукт), ауротиоглюкоза (положительный контроль), 1-тио-β-D-глюкозная соль натрия (отрицательный контроль) и 1% диметилсульфоксид (контроль растворителем). Протокол включает дальномерный анализ для определения подходящих концентраций теста, стандартизацию активности йодидов, специфичных для микросом, и структурированное химическое интерференционное тестирование при отсутствии микросом, а также дополнительную последующую оценку без дитиотрейтола (DTT) для выявления артефактов, зависящих от DTT. Анализ DIO1-SK подходит для средне- и высокопроизводительного скрининга и механистических токсикологических исследований. Его устойчивость, масштабируемость и применимость к человеческим микрососам делают его ценным инструментом для исследования эндокринных нарушений. Этот протокол поддерживает усилия по проверке нормативных требований.

Введение

Эндокринные разрушители (ЭД) — это химические вещества, которые нарушают гормональную регуляцию и, следовательно, вызывают побочные эффекты у человека 1,2. Дейодиназы (ДИО) — это ферменты, ассоциированные с мембраной, при этом селеноцистеин является ключевым остатком в их активных участках. Это семейство ферментов состоит из трёх различных изоформ (DIO1, DIO2 и DIO3), которые вместе модулируют концентрации циркулирующих гормонов щитовидной железы (TH) и регулируют их тканеспецифическую доступность внутриклеток 3. Тироксин (T4), который служит прогормоном, и трийодотиронин (T3), активная форма, играют важную роль в регулировании энергозатрат, роста, процессов развития и терморегуляции ворганизме. Изоформы ДИО различаются характеристиками специфичности участка дейодирования, кинетическими свойствами и предпочтениясубстрата 3. DIO1 является основной изоформой дейодиназы во взрослой печени и обладает сильной субстратной аффинностью к обратному трийодотиронину (rT3) и сульфатированным йодотиронинам, тогда как DIO2 преимущественно использует T4 и rT3, а DIO3 в основном действует на T4 и T3. Использование микросом печени человека и rT3 в качестве субстрата позволяет селективно обнаруживать активность DIO1, минимизируя помехи от других изоформ. Хотя точные последствия ингибирования DIO1, вызванного веществом, пока не полностью выяснены, данные мутаций человеческих генов, влияющих на DIO1, ясно показывают, что DIO1 может нарушать работу гормоновщитовидной железы 5. В результате возникает критическая необходимость в надёжных и воспроизводимых методах для изучения ингибирования DIO1.

Цель представленного метода — количественно оценить активность DIO1 in vitro с использованием нерадиоактивного колориметрического подхода, основанного на реакции Санделла-Кольтхоффа (SK). DIO1 катализирует преобразование обратного rT3 в T2, процесс, приводящий к высвобождению ионов йодида. Реакция SK обеспечивает чувствительное обнаружение высвобождённого йодида, что позволяет определить активность высвобождения йодида (IRA) как прямую меру активности DIO1. Этот анализ позволяет выявлять ингибирующие эффекты тестовых веществ на DIO1, поддерживая механистическую токсикологию, скрининг или принятие регуляторных решений. Он особенно важен для изучения ингибирования DIO1 как молекулярного инициирующего события неблагоприятных путей, приводящих к нарушению работы щитовидной железы, как это подтверждается международными валидационными усилиями, такими как координированные EURL ECVAM 6,7. Метод был изначально разработан в 2012году 8,9 и дополнительно оптимизировал 6,7 в ответ на растущую потребность в надёжных, воспроизводимых и масштабируемых in vitro анализах, которые можно интегрировать в тестовые батареи для эндокринного скрининга, особенно в контексте метаболизма гормонов щитовидной железы. Недавно было опубликовано применение аналоговых SK-установок для среднего 10 и высокопроизводительногоскрининга 11, что демонстрирует широкую применимость подхода на основе SK.

Хотя анализ DIO1-SK косвенно измеряет активность DIO1, количественно определяя продукты IRA, а не TH, он имеет ряд преимуществ по сравнению с альтернативными методами. В отличие от методов, основанных на радиометированныхсубстратах 12 или масс-спектрометрической количественной оценки истощённых или сформированных гормоновщитовидной железы 13, реакция SK обеспечивает простое, масштабируемое и экономически эффективное считывание, измеряя высвобождение йодида при 415нм 14. Хотя методы LC-MS/MS с твердофазной экстракцией (SPE-LC-MS/MS) обладают высокой специфичностью и чувствительностью для количественной оценки rT3 и T2, они требуют дорогостоящей приборной обработки и менее подходят для экранирования с высокой пропускной способностью. В отличие от этого, анализ DIO1-SK может быть реализован в стандартных лабораторных условиях и прошёл предварительное подтверждение для использования с микросомами печени человека, демонстрируя высокую воспроизводимость и предсказаемость 6,7. В сравнительном исследовании результаты реакции на SK, в частности выброс йодида, были напрямую сравниваны с количественной оценкой метаболитов гормонов щитовидной железы (rT3 и T2) с помощью SPE-LC-MS/MS 15. Результаты показали сильное соответствие между двумя подходами по различию тестовых веществ и ингибирующих потенций. Для всех тестируемых веществ изменения активности высвобождения йодидов (IRA), измеряемые реакцией SK, тесно отражали изменения уровней rT3 и T2, определяемые масс-спектрометрией. Это дополнительно подтвердило валидность показаний SK как суррогата деятельности DIO1. Эти сравнительные анализы подтверждают, что SK-анализ предоставляет надёжную и надёжную альтернативу более сложным аналитическим методам, а выброс йодидов можно с уверенностью измерять для оценки ингибирования DIO1 in vitro.

Однако метод SK имеет определённые ограничения, которые необходимо учитывать: он подвержен интерференциям от веществ, содержащих свободный йодид в качестве примеси, высвобождающих йодид неферментативно или реагирующего с компонентами анализа, такими как дитиотрейтол (DTT). DTT включен в качестве редукционного кофактора для поддержания каталитической компетентности дейодиназы путем поддержки регенерации активного участка селеноцистеина в его восстановленном состоянии во время оборота. Поскольку ДТТ является сильным редуктивом, некоторые тестируемые вещества (или примеси) могут подвергаться окислительно-восстановительным реакциям, которые могут влиять на колориметрическое показание и, в некоторых случаях, приводить к появлению артефактов, зависящих от ДТТ, не связанных с ферментативным высвобождением йодида. Такие интерференции могут привести к ложноотрицательным результатам ингибирования DIO1, поскольку измеренный йодид может не возникать в результате ферментативного превращения rT3. Таким образом, хотя SK-анализ подходит для рутинного скрининга и большинства тестовых веществ, LC-MS/MS может использоваться для подтверждения при подозрении на интерференции в анализе или для веществ со сложными химическими свойствами.

Анализ DIO1-SK в настоящее время готовится к включению в качестве руководства по тестированию ОЭСР в международный проект PEPPER (Государственно-частная платформа для валидации методов характеристики эндокринных нарушителей), что подчеркивает его растущее значение для регуляторных применений и международной гармонизации стратегий тестирования эндокринных разрушителей. Анализ может быть интегрирован в комплексные in vitro тестовые батареи, поддерживая как оценку химической безопасности, так и механистические исследования эндокринныхнарушений 16. В сочетании с анализами, учитывающими дополнительные ключевые события вдоль пути неблагоприятных исходов для щитовидной железы, это способствует более полному пониманию механизмов нарушения гормонов щитовидной железы.

Кроме того, масштабируемость протокола и высокая воспроизводимость делают его отлично подходящим для средне- и высокопроизводительного скрининга. Это крайне важно для оценки большого количества веществ во время разработки лекарств и в академической среде, как недавно былопоказано 11. Исследователи, заинтересованные в ингибировании DIO1, будь то для скрининга, механистической токсикологии или принятия регуляторных решений, получат пользу от надёжного, доступного и универсального анализа. Валидация этого метода сделает его стандартным инструментом для исследований нарушений гормонов щитовидной железы и оценки химической безопасности.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед проведением основного анализа необходима серия подготовительных шагов для обеспечения точности, воспроизводимости и достоверности анализа DIO1-SK. Эти предварительные действия включают литье ионообменных фильтрующих пластин, заполненных смолой, которые критически важны для эффективного разделения и минимизации фоновых помех в реакции SK. Реакция Санделла-Кольтхоффа регулярно стандартизируется с использованием стандартных кривых йодидов для мониторинга систематических изменений и поддержания качества анализа. Активность микросом печени человека измеряется для определения партийно-специфической ёмкости выброса йодида, обеспечивая стабильную ферментативную эффективность во всех экспериментах. Вместе эти шаги обеспечивают прочную основу для последующего основного анализа и оценки данных, поддерживая получение воспроизводимых и интерпретируемых результатов.

1. Предварительная работа

  1. Подготовка буферов и реагентов
    1. Заранее подготовьте все буферы и запасные растворы, как описано в Таблице 1. Храните аликвоты как указано, чтобы обеспечить стабильность и воспроизводимость.
    2. В день анализа подготовьте свежую смесь субстрата для каждой пластины на 96 лунок. Для одной пластины на 96 лунок комбинируйте 5,75 мл буфера HEPES/EDTA (50 мМ HEPES, 2,16 мМ EDTA, pH 7,0), 0,5 мл оттаявшего 1 M DTT и 10 мкл 6 мМ rT3 (растворённых в DMSO). Аккуратно перемешайте и держите субстрат на льду до использования.
  2. Подготовка справки
    1. Приготовьте 10-1 M запасной раствор референсного контроля 6-PTU в соответствующем растворителе (например, DMSO) свежим в день проведения анализа.
    2. Подготовьте разбавление этого запаса в соотношении 1:10 вdiH 2O(RI-C8) для достижения концентрации DMSO 10% и подготовьте серию разбавлений из этого запаса в 10 % DMSO вdiH 2O, как описано в таблице 2.
  3. Подготовка положительного контроля
    1. Приготовьте 10-2 M запасной раствор положительного контроля ауротиоглюкозы в соответствующем растворителе (например, DMSO) и храните его до 6 месяцев при 4 °C.
    2. В день анализа разведите запас до 10-3 млн вdiH 2O, чтобы достичь концентрации DMSO 10% DMSO.
  4. Подготовка отрицательного контроля
    1. Приготовьте 10-2 M запасной раствор отрицательного контроля 1-тио-β-D-глюкозной соли только что в день проведения анализа.
    2. В день анализа разведите запас до 10-3 млн вdiH 2O, чтобы достичь концентрации DMSO 10% DMSO.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда соблюдайте соответствующие меры безопасности, особенно при работе с опасными химикатами, такими как арсенит натрия и серная кислота. Все реагенты должны быть приготовлены с помощью деионизированной воды и хранить в соответствии с рекомендациями производителя. Субстратная смесь, после приготовления, и размораженный DTT aliquot предназначены для однократного использования в день анализа и не должны замораживаться.
  5. Литье ионообменной смолы
    1. Используйте подходящий прямоугольный прозрачный контейнер для приготовления.
    2. Добавьте около 250 г (или нужное количество) ионообменной смолы в большой контейнер и помойте. Промывайте с добавлением 10% уксусной кислоты; Дайте смолиной подвеске отдохнуть 10 минут.
    3. После того как подвеска осесть на 10 минут, слегка наклоните и аспирируете супернатант. Стирайте не менее 5 раз в сумме или пока краска не перестанет просачиваться в растворитель.
    4. После последнего этапа промывки добавьте 10% уксусной кислоты, чтобы она составила примерно 50% от общего объёма.
    5. Наклоните контейнер так, чтобы смола двигалась в одну сторону, и стабилизируйте контейнер в наклонённом положении. Подождите ~10 минут, пока фазы разделятся.
    6. Поставьте фильтровую пластину на 96 лунок поверх 96-колодной пластины и добавьте 100 мкл уксусной кислоты 10% в каждую скважину 96-колодной фильтрующей пластины.
    7. Наконечники, используемые для литья смолы, вырежьте на высоте ~1 см, чтобы расширить отверстие в конце, и отлийте по 300 мкл ионообменной смолы в каждую скважину фильтра с 96 лунками.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наконечники, используемые в нашей работе, имеют максимальный объём 1 200 мкл и могут быть прикреплены к многоканальным пипеткам.
    8. Элюируйте уксусную кислоту, центрифугирая в пластину глубиной 96 с 100–200 × г в центрифуге с вращающимся ротором для микротитровых пластин на 1 минуту. Проверьте, равномерно ли смола распределена по пластине.
    9. Запечатайте пластину непроницаемым пластиковым листом и храните при 4 °C максимум 6 месяцев.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Известно, что компоненты ионообменной смолы влияют на реакцию SK, если их неправильно промыть. Удалённый супернатант может быть использован непосредственно в реакции SK (использовать 50 мкл образца супернатирования, добавить 50 мкл церия и, наконец, 50 мкл раствора арсенита) и сравнивать с образцом уксусной кислоты 10% (контрольный блок) для полного вымывания компонентов.
  6. Стандартизация реакции Санделла–Кольтхоффа
    1. Подготовьте разбавление йодида из соответствующего источника йодида (например, стандартного раствора йодида) с рекомендуемыми концентрациями 1 500, 1 000, 750, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 25, 10, 5 и 1 нМ йодида с использованием соответствующего йодидного стандарта вdiH 2O.
    2. Добавьте 50 мкл чистогодиН 2O в качестве контроля и 50 мкл приготовленных йодидных разбавлений в пластину с 96 лунками в тройном экземпляре, как описано на схеме на рисунке 1.
    3. Добавьте 50 мкл раствора церия 40 мМ во все скважины и начните реакцию, добавив 50 мкл раствора арсенита 25 мМ во все скважины.
    4. Как можно скорее после добавления раствора арсенита измеряйте абсорбцию с помощью считывателя пластин на 415 нм (±2 нм), записывая оптическую плотность (OD) каждую минуту в течение 21 минуты, а также записывая начальный OD.
    5. Оцените результаты, как описано в разделе 4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно фонΔOD 21 минута > 0,3 в чистом контролеdiH 2O требует внимания и дальнейшего изучения основных причин (например, загрязнение в партии As или Ce, низкое качество воды).
  7. Оценка активности микросом
    1. Подготовьте максимальную концентрацию (RI-C8) эталонного элемента (6-PTU), как описано в шаге 1.2.
    2. Подготовьте шесть разбавлений микросом, как описано в Таблице 3 , и смесь субстрата, как описано в Таблице 1.
    3. Добавьте 10 мкл разбавления растворителя 10% (v/v) вdiH 2O (например, 10% DMSO вdiH 2O) и 10 мкл 10-2 M 6-PTU (RI-C8) в пластину на 96 лунок в тройном экземпляре, как описано в схеме пластины на рисунке 2.
    4. Добавьте 40 мкл разбавления микросомы вdiH 2O (в результате получается 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,68 и 0 мкг микросомального белка на одну скважину) в пластину на 96 лунок, как показано на схеме пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поставщики обычно предоставляют концентрацию микросомального белка. Если нет, можно использовать стандартные методы количественной оценки белков, хотя в этом исследовании мы их не применяли.
    5. Добавьте 50 мкл свежеприготовленной субстратной смеси в каждую скважину и запечатайте пластину непроницаемым пластиковым листом.
    6. Поставьте 96-колодную пластину на шейкер в инкубаторе (37 °C при 850 об/мин) и инкубировать 2 часа.
    7. После инкубации положите пластину на лед, чтобы остановить реакцию.
    8. Проведите ионный обмен аналогично шагу 2.2.
    9. Переносите соответствующие количества образца из глубокой скважины, полученной на этапе ионообмена, на свежую пластину из 96 лунок для измерения разбавления 1:2 (25 мкл образца + 25 мкл уксусной кислоты) и 1:4 (12,5 мкл образца + 37,5 мкл 10% уксусной кислоты), сохраняя неизменное расположение пластины.
    10. Оценить результаты, описанные в разделе 4, и определить фактор разбавления образцов в 10% уксусной кислоте, а также концентрацию микросомного белка, которая всё равно приводит к максимальным возможным значениямΔOD 21 мин-BG в реакции Санделла-Кольтхоффа без достижения плато насыщения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно выброс йодида ΔODв течение 21 минуты > 0,5 легко достичь при разбажении уксусной кислоты 1:4 или 1:2 при 20 мкг микросомального белка на образец скважины и обычно составляетоколо ΔOD 21 минуты 1. Более высокие концентрации микросомного белка не рекомендуются для использования, так как они увеличивают фоновое и неспецифическое связывание во время анализа. Рекомендуется повторить измерение серии разбавления 6-PTU с использованием установленной концентрации микросомы и коэффициента разбавления для подтверждения результата.
  8. Оценка растворимости тестовых элементов
    1. Растворите испытательный продукт при 100 мМ или 200 мг/мл в подходящем растворителе (например, DMSO) при комнатной температуре. Смешайте или вихрь и визуально проверьте растворение (микроскоп).
    2. Если он не растворён, соникуйте до 5 минут и проверьте снова. Если он ещё не растворён, нагрейте при 37 °C до 60 минут и снова проверяйте.
    3. Если он нерастворим, разведите дополнительно или приготовьте новый бульон в меньшей концентрации и повторите процедуру. Если DMSO не подходит, попробуйте воду или этанол как альтернативные растворители.
    4. После растворения приготовьте разбавление в соотношении 1:10 вdiH 2O(10% растворителя) и повторите оценку (смешивание, соникация, нагрев по необходимости).
    5. Для имитации условий анализа подготовьте разбавление тестового вещества на 1% в буфере анализа и повторите проверку растворимости.
  9. Подготовка тестового изделия и определение дальности
    1. Приготовьте раствор из тестового изделия в наивысшей концентрации растворимости в подходящем растворителе (желательно DMSO), как это определяется при оценке растворимости на шаге 1.8.
    2. Для анализа дальности подготовьте восемь разбавлений тестового элемента с последовательными шагами разбавления 1:10 (v/v) с использованием стандартного раствора и 10% DMSO вdiH 2O.
    3. Проведите анализ дальности для оценки профиля ингибирования тестового изделия, выполняя шаги, описанные в разделе 2. Если тестовый элемент показывает ≥25% ингибирование при любой концентрации, скорректируйте диапазон концентраций для финальных анализов, включив как минимум три концентрации в линейный диапазон ингибирования и две концентрации ниже 10% IRA, если применимо.
    4. Если тестовый продукт показывает <25% ингибирование во всех протестируемых концентрациях, используйте ту же серию разведения для финальных тестов. В этом случае дальноопределенный анализ может считаться одним из трёх обязательных независимых анализов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите как минимум два, желательно три независимых эксперимента для каждого тестового элемента, чтобы обеспечить воспроизводимость и надёжность результатов. Если выбрано другое разбавление для лучшего покрытия диапазона активности, допускается отклонение от коэффициента разбавления 1:10. Порог в 25% в этой стратегии тестирования (см. шаги 1.9.3 и 1.9.4) отличает эффекты тестовых заданий от отрицательных контрольных, учитывая исходную вариабельность активности и обеспечивая дополнительный запас безопасности. Этот порог обеспечивает надёжную классификацию ингибиторных профилей.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Планировка пластин для стандартной йодидовой кривой. Этот рисунок показывает 96-колодцевую схему пластин, используемую для генерации стандартной кривой йодида. Скважины содержат последовательное разбавление йодида в диапазоне от 1 нМ до 1 500 нм, а также контрольные элементыdiH 2O.  Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-protocol-2
Рисунок 2: Схема пластин для титрирования микросомных белков и тестирования референсных элементов. Этот рисунок показывает схему пластин из 96 лунок для титрирования микросомных белков и тестирования референсных ингибиторов (6-PTU). Ряды содержат всё больше микросомального белка на колодцу, как с 6-PTU, так и без него.  Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

2. Проведение анализа DIO1–SK

  1. Инкубация микросомов с помощью тестового предмета
    1. Подготовьте эталонный элемент, как описано в шаге 1.2, а также положительный и отрицательный контроль, как описано в шагах 1.3 и 1.4. Подготовьте тестовые изделия с подходящими концентрациями в соответствии с протоколом, описанным в шагах 1.8 и 1.9.
    2. Подготовьте смесь субстрата, как описано в Таблице 1 , и подготовьте микросуспензию в заранее заданной концентрации белка согласно шагу 1.7, разбавляя тщательно размораженный, алицитированный раствор микросомы вdiH 2O. Микросомную суспензию держите на льду до необходимости для инкубации.
    3. Следуя расположению пластин, показанных на рисунках 3 и 4 (если одновременно оценивается более двух тестовых элементов), добавьте 10 мкл концентраций эталонных элементов, положительного и отрицательного контроля, контроля растворителя (10% (v/v) растворителя вdiH 2O) и концентраций тестовых изделий в скважины.
    4. Добавьте 40 мкл микросомной суспензии во все скважины. Добавьте 50 мкл свежеприготовленной смеси субстрата в образцы.
    5. Запечатайте пластину непроницаемым пластиковым листом и поместите её на шейкер в инкубатор (37 °C при 850 об/мин) на 2 часа; После инкубации положите пластину на лёд, чтобы остановить реакцию.
    6. После инкубации поставьте пластину на лёд, чтобы остановить реакцию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пластину можно хранить на льду до измерения для сохранения целостности образца. Первая пробная пластина содержит восемь концентраций эталонного изделия, тогда как каждая дополнительная пластина в тот же день содержит только самую высокую концентрацию эталонного изделия, оставляя больше места для дополнительных тестовых элементов при необходимости.
  2. Разделение с помощью ионообменных смолоносных фильтрующих пластин с 96 лунками
    1. Поставьте подготовленную ионообменную смолу с 96-колодной фильтрующей пластиной, как это сделано на этапе 1.5, поверх пластины глубиной 96 лунок и добавьте 150 мкл 10% уксусной кислоты в каждую скважину ионообменной смоловой пластины на 96 лунок, чтобы увлажнить смолу в колонках.
    2. Элюируйте уксусную кислоту, центрифугая в используемую пластину скважины глубиной 96 с 100–200 × г в центрифуге с откидывающимся ротором для микротитровых пластин на 1 минуту.
    3. Замените использованную пластину скважины глубиной 96 на новую пластину на 96 глубин.
    4. Добавьте 133 мкл уксусной кислоты 10% в каждую яме инкубированной пластины на 96 лунок начиная с шага 2.1.6 и ненадолго встряхните пластину, чтобы перемешать раствор.
    5. Перенесите 175 мкл образцов, подготовленных на предыдущем этапе, на ионообменную смолу фильтровую пластину с 96 лунками, сохраняя исходную структуру пластины.
    6. Пропустите образцы через смолу и в пластину скважины глубиной 96 путём центрифуга (100–200 × г) в центрифуге с отворотным ротором для микротитровых пластин на 1 минуту. Снимите ионообменную смолу фильтровую пластину на 96 лунок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина с образцами глубиной 96 может быть запечатана непроницаемым пластиковым листом и хранится при 4 °C не менее 3 месяцев. Это позволяет проводить дополнительные измерения в случае ручных/технических ошибок или изменений коэффициента разбавления в реакции или измерении Санделла–Кольтхоффа в последующие дни.
  3. Реакция Санделла-Колтхоффа
    1. В зависимости от установленного коэффициента разбавления образцов в 10% уксусной кислоте для используемой партии микросомов (см. шаг 1.7), добавьте 50 мкл неразбавлённого или правильно разбавленного образца в новую пластину на 96 лун.
    2. Добавьте 50 мкл раствора церия 40 мМ (подготовленного как описано в Таблице 1) во все скважины и начните реакцию, добавив 50 мкл раствора арсенита 25 мМ (подготовленного как описано в Таблице 1) во все скважины.
    3. Как можно скорее после добавления раствора арсенита измеряйте абсорбцию с помощью считывателя пластин на 415 нм (±2 нм), записывая оптическую плотность (OD) каждую минуту в течение 21 минуты, а также записывая начальный OD.

figure-protocol-3
Рисунок 3: Схема пластины для параллельного тестирования двух тестовых элементов. 96-колодцевая схема для тестирования двух тестовых элементов в тройном экземпляре с несколькими концентрациями, а также с копиями отрицательных, положительных, растворительных контролей и эталонного элемента. Использовался как первая пробная пластина дня. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-protocol-4
Рисунок 4: Схема пластин для параллельного тестирования трёх испытательных элементов. 96-колодная схема пластин для тестирования трёх тестовых элементов в тройном экземпляре с разными концентрациями, с копиями отрицательных, положительных и растворительных контролей. Эталонный элемент включён только при максимальной концентрации, так как он полностью протестирован на первой пластине (см. рисунок 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

3. Тестирование на помехи (± микросомах и ± DTT)

  1. Подготовьте максимальную концентрацию (RI C8) эталонного изделия (6 PTU), как описано в шаге 1.2, и подготовьте раствор и разбавления тестового изделия (включая максимальную концентрацию тестового изделия).
  2. Подготовьте суспензию микросомы в определённой концентрации на скважину (см. шаг 1.7), разбавляя аккуратно размораживаемые алицитированные микросомы вdiH 2O. Держите суспензию микросомы на льду до использования.
  3. Приготовьте две смеси субстрата: стандартную смесь с DTT, как описано в Таблице 1, и идентичную смесь без DTT (опустить только DTT).
  4. В назначенные скважины пластины с 96 скважинами согласно рисунку 5: 10 мкл RI C8, 10 мкл 10% (v/v) DMSO вdiH 2O (контроль растворителя) и 10 мкл разбавления каждого тестового элемента.
  5. Добавьте 40 мкл суспензии микросомы в скважины, обозначенные как «с микросомами», и 40 мклдиН 2Oв колодцы, обозначенные как «без микросом», согласно рисунку 5.
  6. На льду добавьте 50 мкл смеси субстрата с DTT в колодцы, обозначенные как «с DTT», и 50 мкл смеси субстрата без DTT в колодцы, обозначенные как «без DTT» (рисунок 5).
  7. Запечатайте пластину непроницаемым пластиковым листом и инкубуйте на шейкере в инкубаторе (37 °C, 850 об/мин) в течение 2 часов.
  8. После инкубации поставьте пластину на лёд, чтобы остановить реакцию.
  9. Выполнить разделение ионного обмена и количественную оценку йодидов с помощью реакции SK, описанное в шагах 2.2 и 2.3, и оценить результаты, как описано в разделе 4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта установка из одной пластины (рисунок 5) проверяет максимальную концентрацию тестового изделия параллельно с микросомами и без микросом, а также без DTT, чтобы отличить активность ферментативного DIO1 от артефактов анализа. Увеличение IRA ≥20% в скважинах без микросомов указывает на интерференцию SK (выделение/показание йодидов независимо от DIO1), и вещество классифицируется как «неприменимое в анализе DIO1 SK» и исключено из анализа. Различия между условиями при ДТТ и без ДТТ помогают выявить ДТТ-зависимое высвобождение йодида как дополнительный механизм интерференции.

figure-protocol-5
Рисунок 5: Планировка пластин для проверки на помехи. На этом рисунке показана схема пластин с 96 лунками для интерференционного тестирования, где тестовые элементы, эталонный элемент и контроль растворителя тестируются как с микросомами, так и без них в присутствии ДТТ, а также без микросом, и без ДТТ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

4. Оценка данных

  1. Оценка активности DIO1
    1. Определите значенияΔOD 21 мин , вычитая значения 21 мин всех образцов из начальных измеренных (0 мин) значений:
      figure-protocol-6
    2. Определите значения ΔOD-BG, вычитая среднее значенияΔOD 21 минут ингибируемых 10 3 M 6-PTU (RI) из ΔOD21min значений всех образцов:
      figure-protocol-7
    3. Нормализуйте значения тестового изделия до соответствующих контрольных значений растворителя, деля значения тестового изделия(ов) (TI)ΔOD 21min-BG TI на средние значенияΔOD 21min -BG SC соответствующего контроля растворителя (SC), генерируя значения активности высвобождения йодида (IRA) в %.
      figure-protocol-8
    4. Постройте значения IRA различных концентраций тестовых заданий в программном обеспечении статистики, при этом значения IRA по оси y (линейные) и концентрации тестовых заданий по оси x (логарифмические).
    5. Используйте алгоритм кривой подгонки для визуализации зависимости концентрации и отклика (например, «[Ингибитор] против ответа — Переменный наклон (четыре параметра)» в выбранном статистическом ПО. «Верх» — максимальный отклик, «Вниз» — самый низкий отклик, а «HillSlope» — крутость кривой:
      figure-protocol-9
    6. Определите IC50 эталонного элемента и, если применимо, тестового элемента.
    7. Вычислите коэффициент дисперсии (CV) логарифмичного IC50 оценки эталонного элемента в %:
      figure-protocol-10
    8. Вычислим IRA отрицательного контроля, нормализованного к контролю растворителя в %:
      figure-protocol-11
    9. Вычислим IRA положительного контроля, нормализованного к контролю растворителя в %:
      figure-protocol-12
    10. Вычислим z'-фактор:
      figure-protocol-13
    11. Для проверки достоверности эксперимента сравните рассчитанные значения с критериями принятия в таблице 4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения действительного анализа должны быть выполнены все критерии.
    12. Классифицировать тестовые элементы как полные ингибиторы, парциальные ингибиторы или неингибиторы на основе их максимального ингибирования и IC50 , как изложено в Таблице 5.

Результаты

Рисунок 6 даёт обзор рабочего процесса анализа DIO1-SK и ключевых этапов стандартизации, необходимых для успешного внедрения метода в лаборатории. Рабочий процесс (рисунок 6A) обобщает последовательные фазы анализа, включая использование микросом человеческой печени, инкубацию с помощью тестовых элементов и контрольных элементов, извлечение йодидов посредством ионообменного разделения и колориметрическую количественную оценку йодидов с помощью реакции Санделла–Кольтхоффа (SK). Рисунок 6B выделяет стратегию стандартизации, лежащую в основе надёжной производительности и валидных результатов, включая (i) стандартизацию реакции SK, (ii) тестирование активности микросом, специфичную для партий, (iii) оценку растворимости и интерференционное тестирование, (iv) дальномерный анализ и (v) корректировку концентраций тестовых изделий на основе первого валидного теста.

Ключевым элементом этой стратегии является тестирование микросомной активности по порциям, поскольку партии микросомов печени могут существенно различаться по активности дейодинации rT3, что требует определения соответствующей концентрации фермента для каждой новой партии до проведения рутинного тестирования веществ.

Эта поэтапная стратегия тестирования критически важна для внедрения: только после проверки базовой эффективности анализа (контроль, поведение реакции SK и активности микросом) и стандартизации условий теста можно ожидать, что тестирование веществ даст достоверные, интерпретируемые профили ингибирования.

figure-results-1
Рисунок 6: Рабочий процесс и этапы стандартизации анализов DIO1 SK. (A) Рабочий процесс иллюстрирует использование человеческих печенных микросом, установку пластины на 96 лунок, инкубацию с помощью тестовых элементов и контролей, экстракцию йодидов и колориметрическую количественную оценку с помощью реакции SK. Каждый шаг изображается последовательно, чтобы подчеркнуть основные фазы анализа. (B) Этапы стандартизации включают стандартизацию реакции Санделла-Кольтхоффа, тестирование активности микросом, специфическую для партии, оценку растворимости и интерференционное тестирование, анализ дальности и корректировку концентраций тестовых изделий на основе первого валидного теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Опираясь на рабочий процесс и стандартизацию, показанные на рисунке 6, рисунок 7 иллюстрирует, как лаборатории определяют соответствующую концентрацию микросомного белка (и разбавление после ионного обмена), чтобы достичь достаточного динамического диапазона при сохранении сигмоидального ингибирующего ответа для референсного ингибитора. На рисунке 7A ΔOD21min-BG увеличивается с увеличением микросомального белка и зависит от разбавления после ионного обмена (неразбавленное, 1:2, 1:4). Для последующих экспериментов выбирается разбавление, дающее максимальное количество ΔOD21min-BG при сохранении сигмоидального отклика (пример: разбавление 1:2). На рисунке 7B сравниваются кривые ингибирования 6-PTU по количеству микросомных белков, чтобы определить наименьшую концентрацию белка, которая всё ещё даёт сигмоидальную кривую (пример: 5 мкг белка/скважины), тем самым балансируя чувствительность с фоном.

Важно, что этот этап оптимизации должен выполняться каждой лабораторией при реализации метода, поскольку требуемая концентрация белка зависит от активности используемой партии микросом, что требует специфической партии стандартизации концентрации фермента.

figure-results-2
Рисунок 7: Микросомная активность и ингибирование с помощью 6-PTU. (A) График показывает увеличение активности в виде фонового (BG) корректированного сигнала Санделла-Колтхоффа (ΔOD 21 мин n-BG) с увеличением количества микросомального белка на скважину (log10[μg белок/колодца]), протестированного при неразбавленных соотношениях 1:2 и 1:4. Для будущих экспериментов будет использоваться максимальное разбавление с наибольшим значением ΔOD21 min–BG, а также с сигмоидальной формой. В данном случае это разбавление 1:2. (B) Кривая концентрации и ответа эталонного ингибитора 6-пропил-2-тиурацила (6-PTU), показывающую активность высвобождения йодида (IRA в %) с графиком по сравнению с log10[концентрация (M)] при различных микросомных нагрузках белка (5, 7,5 и 10 мкг белка/скважины). Значения IRA нормализуются относительно контроля растворителя. Точки данных обоих графов представляют среднее ± SD из трёх технических реплик (колодц) на каждое условие из одного репрезентативного теста активности микросом. Кривые подгонялись нелинейной регрессией с использованием четырёхпараметрической логистической ("переменного наклона") модели (ингибитор против отклика). Наименьшая концентрация белка с сигмоидальной кривой будет использована для будущих экспериментов; В данном случае — 5 мкг/скважины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

После завершения рабочих процессов и этапов стандартизации (рисунок 6) и установления соответствующей концентрации микросомного белка для выбранной партии микросомов (рисунок 7) основные параметры анализа устанавливаются для проведения рутинного тестирования веществ. На этом этапе тестовые элементы могут оцениваться вместе с набором контроля пластин (эталонный элемент, контроль растворителя и положительные/отрицательные контроли) в стандартизированном формате пластин, что обеспечивает надёжную нормализацию и последовательную интерпретацию профилей ингибитора.

Рисунок 8 демонстрирует дискриминацию с помощью анализов на основе поведения концентрации и реакции при активности по высвобождению йодидов (IRA). Эталонный ингибитор 6-PTU (рисунок 8A) показывает концентрационно-зависимое снижение IRA, обеспечивая ожидаемый профиль сигмоидального ингибирования, как и ожидается для проверки эффективности анализа. Таниновая кислота (рисунок 8B) демонстрирует ингибиторный профиль, сопоставимый с эталонным ингибитором (максимальное ингибирование > 90%) при указанных условиях. Три самые высокие концентрации этого вещества показали отрицательные значения IRA. Значения IRA <0 % не отражают биологически значимого «отрицательного высвобождения йодида», а возникают в результате процедуры вычисления (фоновый вычитание и нормализация в контрольном растворителе), которая может вызывать небольшие флуктуации в контроле растворителя в отрицательные нормированные значения. Соответственно, значения IRA ниже 0% считаются эквивалентными 0% (исходной линии) для интерпретации результатов. Дибутилфталат (рисунок 8C) не демонстрирует ингибирования (максимальное ингибирование ниже 25%) в исследованном диапазоне концентраций, что представляет собой неингибиторный профиль. Вместе эти профили показывают, что анализ может различать ингибирующее и нетормозирующее поведение в стандартизированных условиях. Система тестирования также может выявлять парциальные ингибиторы, которые показывают максимальный уровень торможения от 25% до 90% (данные не представлены). Более подробную информацию о их классификации можно найти в Таблице 5.

figure-results-3
Рисунок 8: Поведение доза-ответ в анализе DIO1–SK отличает ингибиторы от неингибиторов. Кривые доза–ответ показывают активность высвобождения йодида (IRA в %) на графике относительно концентрации log10 (M) для (A) эталонного ингибитора 6-PTU, (B) представительного ингибитора (таниновой кислоты) и (C) репрезентативного неингибитора (дибутилфталат). Значения IRA рассчитывались после фонового вычитания и нормализовались в зависимости от контроля растворителя. Символы обозначают среднее ± SD (n = 3) из одного независимого эксперимента, каждый из которых выполняется с тремя техническими репликами (скважинами) на концентрацию. Кривые подгонялись нелинейной регрессией с использованием четырёхпараметрической логистической ("переменного наклона") модели (ингибитор против отклика). Значения IRA ниже 0% считаются эквивалентными 0% (базовой линии) для интерпретации результатов. Эти данные показывают, что анализ даёт сигмоидальный профиль ингибирования для эталонного ингибитора и может подтвердить, является ли кривая концентрационно-ответной ингибирующей или нетингибиторной в стандартизированных условиях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

В допустимом анализе контроли растворителя (SC) показывают чёткое разделение сигнала ΔODна 21 минуту от полностью ингибируемого эталонного состояния (6-PTU, RI-C8). В примерном наборе данных (10 независимых запусков) каждая пластина включала n = 9 технических репликий для SC и полностью ингибируемого референса (6-PTU при 10−3 M). По пластинам средние значения SC ΔOD21 мин варьировались от 1,383 до 1,819 (средние значения ± SD: 1,565 ± 0,114), тогда как средние значения ΔOD21 минуты для ингибируемого 6-PTU — от 0,258 до 0,771 (среднее значение ± SD: 0,473 ± 0,087). Расчёт ΔOD в этом анализе основан на разнице междуOD 0 мин иOD 21min, а валидность анализа обычно подтверждается порогом z′-фактора >0,5.

В 10 независимых анализах 6-PTU обеспечил сигмоидальную кривую концентрации-отклик с значениями IC50 в диапазоне от 1,20E-06 M до 5,02E-06 M (средняя ± SD: 2,74E-06 M ± 1,13E-06 M). Критерии принятия значений IC50 в эталонном диапазоне от 1.00E-06 до 1.00E-05 основаны на данных предыдущих валидационных исследований. Однако значения IC50 существенно зависят от конкретной партии микросом, и могут проявлять значительную вариабельность. Тем не менее, ожидается, что эти вариации останутся в пределах того же порядка величины.

Качество анализа можно резюмировать с помощью z′-фактора, который отражает как окно сигнала, так и вариабельность элементов управления. В описанном наборе данных шесть опорных кривых были связаны с z′-факторами в диапазоне от 0,544 до 0,774 (среднее ± SD: 0,658 ± 0,062), что соответствует широко используемой цели принятия z′ > 0,5.

На практике неоптимальные результаты можно выявить по отклонениям в фоне анализов и/или несоответствию заранее заданным критериям принятия. Например, высокий фон реакции Санделла–Кольтхоффа указывается, когда чистая пустота diH₂O показывает ΔOD > 0,3, что требует исследования (например, загрязнение реагентами или проблемы с качеством воды). Такие фоновые увеличения могут уменьшить динамический диапазон анализа и повысить вариабельность контроля, тем самым способствуя невыполнению критериев принятия, включая z′-фактор ниже 0,5. Скважины, показывающие очевидные технические артефакты (например, осадки или аномальное изменение цвета), исключаются из оценки как исключения. Исключения, определяемые методом тестирования выбросов с блок-графиком, также исключаются. Если критерии приема не выполнены после удаления выбросов, анализ считается недействительным и должен быть повторен.

Реагент/БуферИнформация о приготовлении
Кислотный раствор аммония церия (40 мМ (NH4)4Ce(SO4)4*2H2O, 0,5 М H2SO4) (250 мл)Добавьте 6,32 г (NH4)4Ce(SO4)4*2H2O и 125 мл diH2O в объёмную колбу объёмом 250 мл. Добавьте 125 мл 1 M H2SO4, чтобы получить итоговый объём 250 мл. Храните при комнатной температуре до 6 месяцев.
DTT (Аликвоты 1 М)Aliquot — готовый или поставленный раствор DTT 1 M в H2O в виде аликвотов по 0,5 мл в микроцентрифугных трубках по 1,5 мл и хранится при -20°C до 6 месяцев.
Буфер HEPES (50 мМ) / EDTA (2,16 мМ) (pH 7,0)Используя объёмную колбу объемом 250 мл, добавьте 12,5 мл 1 M HEPES раствора, 201 мг этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) и заполните до 250 мл диH2O. Храните при 4°C до 3 месяцев.
rT3 Solution («трубки для смеси подложки»)Растворить rT3 в DMSO до конечной концентрации 6 мМ, аликвотировать в порциях по 10 мкл в центрифугных трубках на 15 мл и хранить при -20°C до 6 месяцев.
Раствор натрия арсенита (25 мМ NaAsO2, 0,8 М NaCl, 0,5 М H2SO4) (250 мл)Добавьте 0,81 г NaAsO2, 11,7 г NaCl и 125 мл diH2O в объёмную колбу объемом 250 мл. Добавьте 125 мл 1 M H2SO4, чтобы получить итоговый объём 250 мл. Храните при комнатной температуре до 6 месяцев.

Таблица 1: Подготовка буферов и реагентов. В этой таблице подробно описаны этапы подготовки и инструкции по хранению всех буферов и запасных растворов, используемых в анализе DIO1 SK, включая буфер HEPES/EDTA, DTT, раствор rT3, раствор кислотного аммония церия и раствор натрия с арсенитом.

Название эталонного разбавления элементаРеферентная концентрация разбавления элемента [M]10% DMSO [μL]Справочный пунктИтоговая концентрация эталонного элемента в анализе [M]
RI-C81.00E-0245050 мкл 10-1 м эталонных запасов1.00E-03
RI-C71.00E-0345050 мкл RI-C81.00E-04
RI-C61.00E-0445050 мкл RI-C71.00E-05
RI-C53.16E-05342158 мкл RI-C63.16E-06
RI-C41.00E-0545050 мкл RI-C61.00E-06
RI-C33.16E-0645050 мкл RI-C53.16E-07
RI-C21.00E-0645050 мкл RI-C41.00E-07
RI-C11.00E-0745050 мкл RI-C21.00E-08

Таблица 2: Подготовка эталонных разбавлений. В этой таблице приведена подготовка последовательных разбавлений для эталонного элемента (6-PTU), включая концентрации, объёмы DMSO и конечные концентрации, используемые в анализе.

Микросомы на колодцу [мкг]diH2O [μL]Разбавление микросомы [μL]Итоговая концентрация фермента в анализе [мкг/мл]
2078020 мкл стандартного раствора микросомов 20 мг/мл200
10400400 мкл микросомы 20 мкг на разбавление скважины100
5400400 мкл микросомы 10 мкг на разбавление скважины50
2.5400400 мкл микросомы 5 мкг на разбавление скважины25
1.25400400 мкл микросомы 2,5 мкг на разбавление скважины12.5
0.68400400 мкл микросомы 1,25 мкг на разбавление скважины6.8

Таблица 3: Приготовление разбавления микросом. В этой таблице приведена схема разбавления микросомального белка на скважину, включая необходимые объемы раствора диH₂O и раствора микросом, чтобы достичь конечной концентрации микросомного белка для анализа.

Критерии приемаРекомендуемое значение срега
Численные
IC50 эталонного пункта [M]1*10-05 - 1*10-06
CV журнала IC50 оценки эталонного элемента [%]< 3
Отрицательный контроль ИРА [%]80 - 120
Положительный контроль ИРА [%]< 20
z'-Factor> 0,5
Бинарный
Форма эталонного элемента (сигмоидальная?)Да
Итоговая кривая концентрации-отклика эталонного элемента состоит минимум из шести концентраций из трёх репликатДа
Итоговая кривая концентрации и отклика тестового элемента состоит минимум из шести концентраций из трёх репликатДа

Таблица 4: Критерии приема для анализа DIO1 SK. В этой таблице перечислены критерии приемки валидности анализа, такие как диапазон IC₅₀, коэффициент вариации, значения IRA для контрольных элементов, z'-фактор и требования к кривым концентрации и отклика. Окна приема были получены из ранее опубликованных исследований валидации DIO1-SK6, включая оценку воспроизводимости на основе пяти независимых загонов, которые определяли эталонное окно IC₅₀. В примерном наборе данных из 10 независимых забегов производительность z′-фактора варьировалась от 0,544 до 0,774 (среднее ± SD: 0,658 ± 0,062), поддерживая порог принятия z′, используемый здесь.

Категория (по эффективности)Подкатегория (по силе)Ингибирующая активностьПорог
Категория 1: полный ингибиторA: Мощный полный ингибиторПолностью ингибирует активность DIO1 при концентрации, сопоставимой с эталонным элементом 6-PTUМаксимальное торможение превышает 90% и IC50 при верхнем диапазоне IC50 6-PTU или ниже
B: слабый полный ингибиторПолностью ингибирует активность DIO1 при более высоких концентрациях, чем эталонный элемент 6-PTUМаксимальное торможение превышает 90% и IC50 выше верхнего диапазона IC50 при 6-PTU
Категория 2: частный ингибитор-Полного торможения нет, но больше, чем отрицательный и растворительный контрольМаксимальное торможение от 25% до 90%
Категория 3: не ингибитор-Не ингибирует DIO1 (то же самое, что и отрицательный и растворительный контроль).Максимальное торможение ниже 25%

Таблица 5: Классификация тестовых препаратов на основе ингибирующей силы и эффективности DIO1. Тестовые продукты классифицируются на три группы эффективности (полные, частичные или неингибиторные) на основе их максимального ингибирования активности DIO1. Полные ингибиторы дополнительно подклассифицируются по мощности в зависимости от их IC₅₀ относительно эталонного элемента 6-PTU.

Обсуждение

Анализ DIO1-SK предоставляет нерадиоактивную, экономичную и масштабируемую альтернативу традиционным методам оценки активности DIO1, таким как радиометированные анализы или масс-спектрометрия. Его предварительная валидация микросом человеческой печени и сильное соответствие с измерениями уровня гормонов щитовидной железы SPE-LC-MS/MS подтверждают его надёжность и регуляторную значимость, что отражено в его включении в рабочий план руководства по тестированию ОЭСР. Простота реакции Санделла-Кольтхоффа (SK) делает анализ доступным для лабораторий без передовых приборов.

В настоящем протоколе несколько практических аспектов были определены более подробно по сравнению с ранее опубликованными процедурами DIO1-SK для дополнительной поддержки устойчивости и воспроизводимости в рутинном формате с 96 ямеками. Эти уточнения сосредоточены на обосновании концепции контроля (растворительные, отрицательные и положительные контроли), решении использовать свежеприготовленные ионообменные смоляные пластины вместо повторного использования ранее отлитых пластин, а также на условиях реакции SK, которые повышают устойчивость к работе в многоколодных пластинах, при этом сохраняя биологическую интерпретацию в соответствии с предыдущими работами постандартизации 6,7.

Несмотря на свои сильные стороны, необходимо выполнить несколько критически важных шагов для точного количественного определения йодида, выделяемого при преобразовании rT3 в T2, опосредованном DIO1. Это достигается с помощью реакции Санделла-Кольтхоффа, которая требует точного тайминга и стабильного обращения с реагентами для обеспечения воспроизводимости. Реакция SK — это быстрый каталитический процесс, при котором йодид ускоряет восстановление жёлтого церия (IV) до бесцветного церия (III) с помощью арсенита; Скорость изменения цвета прямо пропорциональна концентрации йодида. Поскольку реакция проходит быстро после добавления мышьяка, важно начать измерение без задержек. В формате пластин с 96 лунками медленное или непоследовательное добавление мышьякового раствора может привести к значительной вариабельности между скважинами. Поэтому настоятельно рекомендуется использовать многоканальную пипетку или автоматический дозатор для обеспечения равномерного и быстрого добавления реагентов во всех скважинах.

Для максимизации сравнимости между скважинами и пластинами порядок добавления реагентов в реакции SK должен быть согласован с описанным рабочим процессом: церий присутствует как хромогенный субстрат, а реакция инициируется добавлением арсенита, что определяет время начала и, следовательно, требует быстрого, синхронизированного дозирования. Альтернативные заказы на добавление реагентов в этой схеме не оценивались; поэтому изменение порядка не рекомендуется при воспроизведении протокола. Кроме того, концентрация церия может влиять на практические характеристики показания SK (например, окно сигнала и устойчивость). Хотя 25 мМ церия определялся как валидированное стандартное состояние при ранней стандартизации анализов, более высокие концентрации, такие как 40 мМ, увеличивали окно сигнала и z′-фактор, не влияя на значения IC50 или биологическую интерпретацию, как уже описано впредыдущей работе 6. В этом протоколе используется 40 мМ церия для обеспечения полного и быстрого комплексирования йодидов в условиях анализа, а также для повышения прочности и стабильности сигнала при рутинных измерениях на пластинах. Критерии приема (например, значения z′-фактора, IC50 референтного ингибитора) основаны на исторических показателях, зафиксированных в предыдущих валидационных исследованиях, и предназначены как рутинная проверка эффективности анализа.

Использование микросом печени человека вводит биологическую вариабельность, что делает стандартизацию партийной активности выделения йодидов для микросом, специфичной для частиц. Тщательная подготовка ионообменных фильтрующих пластин, заполненных ионообменной смолой, необходима для предотвращения неравномерного распределения смолы по фильтрующей пластине и полного отделения йодида от потенциально мешающих веществ. Что касается рабочего процесса с использованием смолы, были выбраны фильтрующие пластины с инообменным раствором, заполненные смолой, чтобы минимизировать потенциальный риск дополнительной изменчивости, возникающей при насыщении смолы, переноса йодида или белка, а также возможной потери эффективности связывания при повторном использовании. Повторное использование смолы и фильтрующих пластин технически осуществимо, однако может содержать некоторые риски, которые не были систематически оценены в данном исследовании. Он может вызвать дрейф от партии к партии, если способность связывать смолу уменьшается или если остаточные компоненты матрицы остаются в слое после предыдущих запусков. Для лабораторий, рассматривающих переработку, прагматичной рекомендацией является проверка эффективности смолы после повторного использования (например, мониторинг поведения фона и стандартных кривых и обеспечение стабильного захвата йодида) и прекращение повторного использования при увеличении фона, сокращения динамического диапазона или неравномерного разделения. Рекомендуется использовать фильтрующие пластины, заполненные смолой, для одноразового использования, так как этот протокол был специально разработан на основе этой методологии.

Кроме того, растворимость каждого тестового изделия должна быть определена в соответствующем аппарате, так как максимальная тестируемая концентрация ограничена растворимостью (обычно до 1 мМ с 1% DMSO). Поскольку все тестовые соединения применяются в DMSO в качестве растворителя, контролёр растворителя определяет исходную активность DIO1 при условиях, соответствующих анализу, и служит наиболее подходящим эталонным условием для нормализации и сравнения. В отличие от этого, 1-тио-β-D-глюкозная соль натрия была включена в отрицательный контроль, поскольку она структурно схожа с положительной контрольной ауротиоглюкозой (АТГ), но химически инертна относительно дейододинации йодотиронина и не мешает микросомным окислительным системам или каталитической активности DIO1. Его включение помогает отличить истинно специфические эффекты DIO1 от неспецифических эффектов, связанных с добавлением соединений, обработкой или взаимодействием матриц анализа. Контрольный режим без обработки/без транспортных средств не использовался в качестве основного эталонного состояния, поскольку он не отражал бы реальную анализную среду, в которой присутствует DMSO во всех скважинах, обработанных соединениями; Таким образом, контроль растворителя является релевантной базой для интерпретации анализа.

Устранение неполадок сосредоточено на выявлении помех в реакции SK. Йодсодержащие, хелатируемые или сильно окисляющие вещества могут искусственно влиять на колориметрическийпоказатель 14,17,18. Для решения этой проблемы протокол включает тестирование на интерференцию без микросом. Кроме того, использование дитиотрейтола (ДТТ) в качестве кофактора также может приводить к неферментному высвобождению йодидов из некоторых веществ. В таких случаях рекомендуются ортогональные методы, такие как SPE-LC-MS/MS, для подтверждения ингибирования DIO1. Неспецифические интерференции через общие денатурирующие эффекты (например, поверхностно-активные вещества) могут вызывать ложноположительные результаты, поэтому общая стратегия выявления частых нападающих с использованием инструментов in silico или интегрированных методов тестирования может быть полезной.

Анализ имеет несколько ограничений. Он подвержен помехам от тестовых веществ, которые реагируют с компонентами анализа или высвобождают йодид независимо от активности DIO1. Анализ не различает специфическое ингибирование DIO1 и неспецифическое вмешательство в функцию фермента или структурную целостность. Для повышения специфичности можно параллельно анализировать ингибирование дополнительных микросомных ферментов, а сравнение ингибирующих потенций в различных ферментных анализах может дать дополнительные доказательства.

Ещё одной стратегией выявления возможных артефактов является включение тестов на целостность или жизнеспособность, как это обычно проводится в клеточных in vitro тестах, для определения максимальной концентрации теста. Хотя для DIO1-SK отсутствует прямой тест целостности, его использование в in vitro тестовой батарее позволяет интегрировать данные о цитотоксичности из других клеточных тестов для инфилляции выбора концентрации. Если такая информация о перекрёстном анализе недоступна, верхняя концентрация в анализе DIO1-SK ограничена растворимостью, что может не отражать релевантные воздействия in vivo. Однако для лучшего определения и интерпретации концентраций in vitro можно использовать токсикокинетические подходы.

Анализ DIO1-SK особенно ценен в токсикологическом скрининге и механистических исследованиях нарушений эндокринной системы. Он решает ключевое событие в гомеостазе гормонов щитовидной железы и может быть интегрирован в батарейки для тестов in vitro. Его надёжность, воспроизводимость и адаптивность к различным лабораторным условиям и требованиям к пропускной способности делают его ценным инструментом для оценки химической безопасности и регуляторной валидации. Анализ обеспечивает надёжную in vitro меру ингибирования DIO1 в стандартизированных условиях и поддерживает классификацию тестовых веществ относительно хорошо охарактеризованного референсного ингибитора (6-PTU). Однако данные in vivo о ингибировании DIO1 ограничены, и прямая корреляция результатов ингибирования DIO1 in vitro с эффектами in vivo в настоящее время неприменима для оценки предиктивности in vivo. Соответственно, результаты анализов следует интерпретировать как механистические доказательства вмешательства в одно ключевое событие в метаболизме гормонов щитовидной железы и интегрироваться с дополнительными доказательствами (например, другими методами мо-анализа щитовидной железы и ортогональными измерениями при необходимости). Важно отметить, что анализ DIO1–SK был оценён в нескольких исследованиях, ориентированных на валидацию (оптимизация/стандартизация, оценка предиктивности и анализ устойчивости/точности)6,7,15, и по мере продвижения метода к внедрению ОЭСР настоящая статья предоставляет пошаговый уровень процедурной детализации, предназначенный для облегчения передачи и последовательного внедрения в дополнительных лабораториях.

Раскрытие информации

Авторы К.С., Н.Х., Д.Ф.-В. и Р.Л. являются сотрудниками химической компании BASF SE, которая может использовать анализ DIO1 для разработки и регистрации коммерческих продуктов в будущем.

Благодарности

Авторы выражают благодарность доктору Андреасу Веберу за его работу при первоначальном создании анализа DIO1-SK.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1-тио-и бета;-D-глюкозная соль натрияСигма-ОлдричT6375-1GCAS 10593-29-0
3,3',5'-трийодотиронин (rT3) Санта-Крус БиотехнологияSC-209692CAS 5817-39-0
6-пропил-2-тиурацил (6PTU)SupelcoP3755-10GCAS 51-52-5
Уксусная кислотаТермо Фишер9526-33CAS 64-19-7
Аналитический балансNANAспособен точно весить до 30 г при читаемости 0,1 мг
Оксид мышьяка натрия (NaAsO2)Термо Фишер041533.APCAS 7784-46-5
Пробирные пластины (формат с 96 колодцами)MerckZ707902-108EAнапример, пластины для культуры тканей, пластина с 96 лунками, плоское дно, полистирол, 0,34 см², стерильная, 108/cs, TPP
Ауротиоглюкоза (АТГ)Сигма-ОлдричA0606-5MGCAS 12192-57-3
центрифугные трубки 15 и 50  mLMerckZ707724-800EA, Z707716-320EAнапример, центрифугные трубки ТПП, объёмом 15 и 50 мл, полипропилен и nbsp;
Центрифуга с вращающимся ротором для микротитровых пластинNANAДолжно быть достаточно высоко, чтобы поместить скважину глубиной 96 и фильтрующую пластину на 96 лунок сверху (как минимум около 6 см в высоту).
Церий (IV) сульфат аммония (Ce(NH4)4(SO4)4)Сигма-Олдрич22269-100G-FCAS 10378-47-9
CO2-инкубаторNANAспособен поддерживать температуру 37°; C, 5% CO2 и ≥ 90% влажности
Глубокие скважинные плиты (формат с 96 скважинами)Supelco575653-Uнапример, плита для сбора скважины SPE 96-Deep Square Well Depth Square Well объёмом 2 мл, полипропилен
Диметилсульфоксид (DMSO)AppliChemA3672,0250CAS 67-68-5
Дитиотрейтол (DTT)Сигма-ОлдричD9779-1GCAS 3483-12-3
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) Сигма-ОлдричAPO456787707-500GCAS 6381-92-6
Фильтрующие пластины (формат с 96 колодцами)MerckWHA77002810например, микропластины, 96-колодцы, прозрачный полистирол, 800 и микро; L, ДНК-связывание, Whatman
Герметики для пластинТермо Фишер232698например, герметическая лента, полиэстер, стерильная, герметичная лента, полиэстер, стерильная, Nunc
HEPESPan BiotechP05-01100CAS 7365-45-9
Микросомы печени человекаBiovitX008070Например, микросомы печени INVITROCYP 150-донорские, объединённые человеческой печени и печени
Йодид (стандарт IC)Supelco41271-100MLнапример, стандарт йодида для IC, 1000 мг/л в воде, Sigma-Aldrich
Ионообменная смола, например Dowex 50WX2Рот334.4CAS 12612-37-2; Mesh 100-200
Микроцентрифугные трубки 1,5  mLMerckEP0030120086-1PAKнапример, Eppendorf® Микроцентрифугные трубки с безопасным замком, объёмом 1,5 мл, натуральные
Многоканальный дозатор, способный выдавать от 50 до 300 и bbsp; & микро; L за шагNANANA
Многоканальная пипетка, способная передавать от 10 до 100  & микро; L за шагNANANA
pH-метр с электродными и калибровочными буферамиNANAспособные считывать +/- 0,1 pH единицы
Фотометр для измерения поглощенияTecan Trading AGNAнапример, Sunrise Absorbance Reader, INSTSUN-3
Пипеты, способные доставлять от 1 до 10 и nbsp; & микро; LNANANA
Пипеты, способные подавать от 10 до 100 и nbsp; & микро; LNANANA
Пипеты, способные передавать от 100 до 1000 и nbsp; & микро; L NANANA
Пипеты для больших объёмовNANAСерологические пипетки, например, 10, 25, 50 мл
Шейкер для пластинТермо ФишерNAнапример, микротитровая пластина Thermo Scientific H+P MONOSHAKE VORTEXER, управляемая напрямую
Репитерная пипеткаNANANA
Хлорид натрия (NaCl)Сигма-ОлдричS9888-25GCAS: 7647-14-5, например, хлорид натрия, реагент ACS и GE; 99.0 %
Программное обеспечение для статистикиNANAСпособен проводить регрессионный анализ, отражающий характеристики анализа, и вычислять ингибирующие концентрации, например, GraphPad Prims 8, GraphPad
Серная кислота (H2SO4) Supelco1007311000CAS 7664-93-9
Объёмная колбаNANAСертифицированный с определённым объёмом

Ссылки

  1. Kabir, E. R., Rahman, M. S., Rahman, I. A review on endocrine disruptors and their possible impacts on human health. Environ Toxicol Pharmacol. 40 (1), 241-258 (2015).
  2. Yue, B., et al. Human exposure to a mixture of endocrine disruptors and serum levels of thyroid hormones: a cross-sectional study. J Environ Sci. 125, 641-649 (2023).
  3. Köhrle, J. The deiodinase family: selenoenzymes regulating thyroid hormone availability and action. Cell Mol Life Sci. 57 (13), 1853-1863 (2000).
  4. Zhang, J., Lazar, M. A. The mechanism of action of thyroid hormones. Annu Rev Physiol. 62 (1), 439-466 (2000).
  5. França, M. M., et al. Human type 1 iodothyronine deiodinase (DIO1) mutations cause abnormal thyroid hormone metabolism. Thyroid. 31 (2), 202-207 (2020).
  6. Weber, A. G., et al. Assessment of the predictivity of the DIO1-SK assay to investigate DIO1 inhibition in human liver microsomes. Appl Vitro Toxicol. 9 (2), 44-59 (2023).
  7. Weber, A. G., et al. A new approach method to study thyroid hormone disruption: optimization and standardization of an assay to assess the inhibition of DIO1 enzyme in human liver microsomes. Appl Vitro Toxicol. 8 (3), 67-82 (2022).
  8. Renko, K., Hoefig, C. S., Hiller, F., Schomburg, L., Köhrle, J. Identification of iopanoic acid as substrate of type 1 deiodinase by a novel nonradioactive iodide-release assay. Endocrinology. 153 (5), 2506-2513 (2012).
  9. Renko, K., et al. An improved nonradioactive screening method identifies genistein and xanthohumol as potent inhibitors of iodothyronine deiodinases. Thyroid. 25 (8), 962-968 (2015).
  10. Olker, J. H., et al. Screening the ToxCast phase 1, phase 2, and e1k chemical libraries for inhibitors of iodothyronine deiodinases. Toxicol Sci. 168 (2), 430-442 (2019).
  11. Sane, R., et al. Identification and characterization of highly potent and isoenzyme-selective inhibitors of deiodinase type I via a nonradioactive high-throughput screening method. Thyroid. 35 (5), 576-589 (2025).
  12. Visser, T. J., Van Overmeeren, E. Binding of radioiodinated propylthiouracil to rat liver microsomal fractions: stimulation by substrates for iodothyronine 5′-deiodinase. Biochem J. 183 (1), 167-169 (1979).
  13. Hindrichs, C., et al. A novel and fast online SPE-LC-MS/MS method to quantify thyroid hormone metabolites in rat plasma. Chem Res Toxicol. 37 (1), 33-41 (2024).
  14. Kolthoff, I. M., Sandell, E. B., Lingane, J. J. A modified persulfate-arsenite method for manganese. Anal Chem. 8 (1), 73-73 (1936).
  15. Stefanidis, K., et al. Assessment of the robustness and accuracy of the deiodinase 1 Sandell–Kolthoff assay: a comparative analysis. Appl Vitro Toxicol. 10 (4), 80-90 (2024).
  16. Satya, S., et al. Guidance document on standardised test guidelines for evaluating chemicals for endocrine disruption. OECD Environ Health Saf Publ. 150, (2012).
  17. Joseph, O., Eberle, M., Lieberman, M. Metabolites in urine that interfere with the Sandell–Kolthoff assay for urinary iodine. Biol Trace Elem Res. 202 (2), 466-472 (2024).
  18. May, W., Wu, D., Eastman, C., Bourdoux, P., Maberly, G. Evaluation of automated urinary iodine methods: problems of interfering substances identified. Clin Chem. 36 (6), 865-869 (1990).

Перепечатки и разрешения

Теги

Колориметрическая оценка активности дейодиназы 1 в микросомах печени человека с помощью реакции Санделла-Кольтхоффа
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.