Методическая статья

Выделение и идентификация первичных фибробластоподобных синовиальных клеток у пациентов с ревматоидным артритом

533 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70116

⸱

24 февраля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of TCM Rheumatology, China-Japan Friendship Hospital, 3Beijing Key Lab for Immune-Mediated Inflammatory Diseases, China-Japan Friendship Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает метод выделения и идентификации высокочистых первичных фибробластоподобных синовиоцитов (FLS) из синовиальной ткани пациентов с ревматоидным артритом для надёжного моделирования заболевания и скрининга лекарственных препаратов.

Аннотация

Ревматоидный артрит (РА) — это хроническое аутоиммунное воспалительное заболевание, характеризующееся синовиальной гиперплазией и прогрессирующей разрушением суставов как основной патологической чертой. Фибробластоподобные синовиоциты (ФЛС) признаются ключевыми клеточными компонентами патогенеза РА, характеризующимися агрессивным, опухоподобным поведением, которое способствует разрушению хряща и костей. Выделение и очистка ревматоидных фибробластоподобных синовиоцитов (RA-FLS) являются критически важным инструментом для изучения механизмов заболевания и оценки потенциальных терапевтических препаратов. Здесь мы представляем комплексный протокол изоляции, культивирования и функциональной валидации первичного РА-ФЛС человека из резецированных образцов синовиальной ткани, полученных во время операции по замене коленного сустава у пациентов с РА. Этот метод использует свежую синовиальную ткань и применяет последовательный ферментативный процесс с использованием трипсина и коллагеназы типа II для максимального выделения RA-FLS из тканевой матрицы. Наконец, идентификация клеток достигается с помощью иммунофлуоресценции виментина и проточной цитометрии, дополненной функциональной оценкой пролиферации, вызванной TNF-α. Этот протокол позволяет получать культуры высокой чистоты RA-FLS с специфическими фенотипическими характеристиками и воспалительной чувствительностью, предоставляя исследователям надежный способ получения краткосрочной культуры, полученной от пациентов RA-FLS, подходящих для скрининга лекарств, механистических исследований и применений в тканевой инженерии.

Введение

Ревматоидный артрит (РА) — это хроническое аутоиммунное воспалительное заболевание, характеризующееся симметричным полиартритом периферических суставов, с оценочной глобальной распространённостью 0,5%-1% и потенциальным вызовом различных системных и внечленныхосложнений 1,2,3,4,5. Основной патологической особенностью РА является хронический синовит, опосредованный аутоиммунными реакциями, что дополнительно приводит к формированию инвазивной ткани паннуса, разрушающей суставный хрящ и подхондральнуюкость 6,7. Среди них синовит является самым ранним и центральным патологическим признаком РА. Фибробластоподобные синовиоциты (ФЛС), являющиеся доминирующими резидентными клетками синовии, играют ключевую роль в организации как воспаления синовиа, так и разрушениякостей 8,9. Во время синовиального воспалительного ответа при РА ревматоидный артрит фибробластоподобные синовиоциты (RA-FLS) теряют свой нормальный «регуляторный» фенотип и вместо этого демонстрируют «провоспалительный» профиль10. Этот сдвиг приводит к массовому образованию воспалительных цитокинов, которые могут активировать связанные энергетические метаболические пути, что приводит к увеличению клеточной пролиферации и дополнительному усилению синовиального воспалительногокаскада 11,12,13. Одновременно RA-FLS взаимодействует с другими иммунными клетками (такими как макрофаги, Т-клетки и В-клетки), поддерживая устойчивое хроническое воспалительноесостояние 14,15. Кроме того, RA-FLS обладают раковыми характеристиками, включая повышенную миграционную способность, инвазивность, неконтролируемое размножение и устойчивость к апоптозу, а также активно участвуют в процессах эрозии хряща икостей 16.

В последние годы FLS широко применяются в виде моделей in vitro для изучения воспалительных заболеваний суставов, таких как РА, что частично обусловлено ограничениями современных фармацевтических препаратовпервой линии 17,18,19. Они применяются в двумерных культурах, 3D-моделях и системах орган-на-чипе для изучения механизмов заболевания, валидации терапевтических целей и проведения скринингалекарственных препаратов 20,21,22,23. Кроме того, RAFLS служат основой для передовых приложений, включая синовиальные органоиды, полученные пациентами, для прогнозирования реакции DMARD; генетическое редактирование с помощью CRISPR/Cas9 для изучения функции генов прогрессирования РА; а также как клеточный источник для инженерии функциональных трансплантатов синовиальнойткани 24, 25, 26.

Получение краткосрочной культуры РА-ФЛС из синовиальной ткани пациентов с ревматоидным артритом служит начальным шагом для многих экспериментов. По сравнению с клеточными линиями FLS, кратковременные культивируемые пациентские RA-FLS сохраняют межпациентскую гетерогенность и специфические для заболевания характеристики, что позволяет более достоверно представить транскрипционные факторы, связанные с заболеванием, и различия в регуляции путей. В результате выход клеток, скорость роста и функциональная производительность могут зависеть от специфических факторов, таких как возраст, продолжительность заболевания, история медикаментов и активность заболевания, что приводит к определённой степени вариабельности между партиями. Поэтому исследователям следует оценить клинический фон источника ткани перед использованием и проводить эксперименты в ранних проходах (P3-P7) для поддержания фенотипической стабильности клеток.

В этом исследовании подробно описан упрощённый протокол извлечения и идентификации RA-FLS из синовиальной ткани колена. Метод использует последовательное ферментативное расщепление (трипсин, затем коллагеназа типа II) в сочетании с мягкой механической диссоциацией. Данные свидетельствуют о том, что такие оптимизированные многоступенчатые ферментативные стратегии обычно превосходят методы одноферментных или непоследовательных смешанных ферментов, что может снижать жизнеспособность клеток и фенотип 27,28,29,30. Для сравнения, представленный протокол позволяет более эффективно и мягко изолировать высокожизнеспособные, высокочистые RA-FLS, минимизируя повреждение клеток и фенотипические потери для обеспечения пригодности для дальнейших функциональных анализов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

В этом исследовании собрана синовиальная ткань пациентов с ревматоидным артритом, проходящих операцию по замене суставов в Китайско-японской больнице дружбы. Все пациенты предоставили письменное информированное согласие перед операцией. Собранная информация и биологические образцы обрабатывались с учётом строгих мер для обеспечения конфиденциальности пациентов и безопасности данных. Оставшиеся образцы синовиальной ткани утилизировались в соответствии с нормами биобезопасности. Использование синовиальной ткани коленного сустава у пациентов с ревматоидным артритом в данном исследовании было одобрено Этическим комитетом Китайско-японской больницы дружбы (Одобрение No 2025-KY-223). Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Получение и подготовка синовиальной ткани

ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите синовиальную ткань, полученную во время операции, в стерильный контейнер, наполненный 0,9% физиологическим раствором (PBS), чтобы предотвратить загрязнение при переносе из операционной в кабинет биобезопасности. Используйте погружение в этанол, а затем промывайте раствором пенициллина-стрептомицина в качестве критически важных шагов для предотвращения бактериального или грибкового загрязнения, обеспечивая успех последующих экспериментов.

  1. Погрузите свежую синовиальную ткань в центрифугу объёмом 50 мл с PBS и перенесите её в биобезопасный шкаф.
  2. Перенесите синовиальную ткань в чашку Петри, содержащую 75% этанола, и погрузите в течение 30 секунд для дезинфекции.
  3. Удалите жировую и костную ткань из синовиальной ткани с помощью стерильных хирургических ножниц и щипцов, а затем перенесите оставшуюся ткань в новую чашу для культуры.
  4. Промыйте полученную синовиальную ткань 3 раза PBS, содержащим 10% пенициллина/стрептомицина.

2. Пищеварение синовиальной ткани

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте трипсин для нарушения клеточных соединений и внеклеточного матрикса в синовиальной ткани для последующего выделения. Применяйте коллагеназу типа II для селективного разрушения структуры внеклеточного матрикса, способствуя диссоциации клеток от матрицы. Стерилизуйте все хирургические ножницы, щипцы и клеточные ситета, необходимые для рассечения синовиальной ткани, путём автоклава перед использованием. После переваривания фрагменты ткани должны выглядеть рыхлыми с потрёпанными краями, а среда может стать слегка мутной. Непереваренная ткань останется компактной и непрозрачной.

  1. Многократно измельчите ткань ножницами на фрагменты размером 1 мм × 1 мм.
  2. Добавьте 0,25% трипсина в ткань и переварите при 37 °C в шейкере постоянной температуры (при 100-150 об/мин) или в клеточном инкубаторе в течение 30 минут.
  3. Приготовьте 10% раствор сыворотки из плода крупного рогатого скота (FBS) с использованием фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
  4. Переместите ткань в центрифугные трубки объемом 15 мл или 50 мл в зависимости от количества ткани, а затем нейтрализуйте и переварите её с помощью PBS, содержащей 10% сыворотку плода бычьего скота (FBS).
  5. Центрифуга (4 °C, 500 × г, 5 минут), затем сбросьте супернатант и оставьте гранулу.
  6. Подвесьте пеллету в PBS.
  7. Центрифугу (4 °C, 500 × г, 5 мин), затем сбросьте супернатант и удержите гранулу.
  8. Добавьте 100 мг коллагеназы типа II к 50 мл среды DMEM, чтобы получить раствор коллагеназы типа II с концентрацией 2 мг/мл.
  9. Фильтруйте подготовленный раствор коллагеназы типа II через мембрану диаметром 0,22 мкм для стерилизации.
  10. Добавьте 2 мг/мл коллагеназу типа II и переварите в шейкере при постоянной температуре 37 °C (при 100-150 об/мин) или в клеточном инкубаторе в течение 4 часов.

3. Выделение и культура фибробластоподобных синовиоцитов

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все процедуры клеточной культуры на шкафу для биобезопасности в стерильных условиях и носите стерильные перчатки для предотвращения загрязнения.

  1. Подготовьте полную среду DMEM, дополнив базальную среду DMEM сывороткой 10% плодовой бычьей сыворотки, пенициллином 100 U/ml и стрептомицином 100 мкг/мл.
  2. Поставьте 100-сетчатое сито на стерильную чашку Петри и вылейте переваренную синовиальную ткань и жидкость на сито.
  3. Перенесите сито клетки с остаточной тканью в другую стерильную чашку Петри.
  4. Оставшуюся ткань на сито перемоловайте с помощью конца стержня шприца объёмом 20 мл, пока не останутся только белые волокнистые остатки, и больше не будет проявления клеточной суспензии.
  5. Прополосните сито соответствующим объёмом полного DMEM-среды.
  6. Соберите все фильтраты, центрифугите (4 °C, 500 × г, 5 минут) и сбросьте супернатант.
  7. Суспензируйте гранулу в PBS, в центрифуге (4 °C, 500 × g, 5 мин) и выбросьте супернатант.
  8. Суспензировать клетки в полном среде DMEM.
  9. Проведите подсчёт клеток и перенесите их в колбу для культуры.
  10. Инкубировать колбу в инкубаторе для культуры клеток (37 °C, 5% CO₂).
  11. Замените среду через 48 часов.
  12. Переварите клетки трипсином и проходите в соотношении 1:3, когда они достигнут полного слияния.

4. Идентифицировать RA-FLS с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания виментина

ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно разогрейте раствор PBS, используемый для мытья ячеек, в водяной бане при 37 °C. Все объёмы реагентов, указанные в этом разделе, стандартизированы для формата пластин с 48 ячинами. Объёмы должны масштабироваться пропорционально в зависимости от площади роста при использовании пластин другого формата.

  1. Переварить клетки трипсином, снова суспензировать собранные клетки и разбавить до 1 ×10 4 клеток/л с использованием полной среды DMEM.
  2. Посеять RA-FLS в пластину на 48 лунок при 200 мкл на колодцу.
  3. Поместить в инкубатор для клеточной культуры (37 °C, 5% CO₂) и инкубировать 24 часа.
  4. Сбросьте среду и трижды промой клетки с предварительно подогретым PBS.
  5. Добавьте 4% параформальдегида, чтобы зафиксировать клетки на 10 минут, сбросьте фиксатор и трижды промывайте с помощью PBS.
  6. Подготовьте 150 мкл раствора Triton X-100 с 0,1% в PBS на каждую скважину. Убедите полное смешивание с помощью вихря или мягкой инверсии перед использованием.
  7. Добавьте раствор Triton X-100 с 0,1% в колодцы и инкубировать 10 минут для проникновения клеток.
  8. Отбросьте раствор Triton X-100 с 0,1% и трижды промой с помощью PBS.
  9. Добавьте 150 мкл раствора для блокирования без животных в каждую скважину, инкубуйте при комнатной температуре в течение 1 часа.
  10. Отбросьте решение для блокировки. Добавьте в каждую яме 150 мкл первичного рабочего раствора антитела виментина (разбавленного 1:200 разбавляющим веществом антител).
  11. Инкубировать с первичным антителом при 4 °C ночью.
  12. Отбросьте первичное антитело и промыйте клетки пять раз с помощью PBS.
  13. Добавьте 150 мкл вторичного антитела Alexa Fluor 488-конъюгированного против кроликов IgG (разбавленных в соотношении 1:50 в универсальном разбавлении антител) в одну яму, и инкубировать при 37 °C в течение 1 часа, защищаясь от света.
  14. Отбросьте вторичное антитело и трижды промите клетки PBS.
  15. Добавьте одну каплю крепления с DAPI-антифейдом на одну скважину и сушите 10 минут в темноте.
  16. Наблюдайте и делайте изображения с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа, оснащённого объективом 20× и соответствующими фильтрами для DAPI и FITC/GFP.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Промыйте клетки PBS, полностью заполнив колодцы PBS, инкубируя 5 минут, а затем убрав PBS. Эта процедура составляет один цикл стирки.

5. Количественно определить RA-FLS и оценить чистоту с помощью проточной цитометрии

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте Виментин и CD90 в качестве положительных маркеров для выявления RA-FLS, а CD68, CD14 и CD11b — как отрицательные контроли, чтобы исключить загрязнение иммунных клеток. Виментин служит внутриклеточно-специфическим промежуточным филаментным белком, преимущественно локализованным в цитоплазме RA-FLS. CD90 функционирует как критический поверхностный маркер, высоко экспрессируемый на RA-FLS, что позволяет отличать их от иммунных клеток. Хотя CD68, CD14 и CD11b специфически экспрессируются в макрофагах, моноцитах и миелоидных клетках, они используются как отрицательные маркеры для исключения загрязнения иммунных клеток. Присваивать флуорохромы маркерам поверхности клеток на основе их специфичности связывания и следить за отсутствием пересечения флуоресцентных каналов. Например, в этом эксперименте CD90 и CD68 используют один и тот же флуорохром; поэтому не добавляйте их в одну и ту же центрифугную трубку. Перед инкубацией антителами к виментину добавьте фиксационные и проницаемые агенты для нарушения клеточной мембраны. Если потоковый цитометр обладает достаточным количеством флуоресцентных каналов, маркеры, такие как CD90 и CD68, могут быть назначены разным каналам для многоцветного одновременного анализа с целью дальнейшего повышения эффективности обнаружения и информационного содержания.

  1. Переваривайте RA-FLS третьего поколения с использованием трипсина без EDTA.
  2. Прекратить расщепление полной средой DMEM, центрифугой (4 °C, 500 × г, 5 минут) и выбросить супернатант.
  3. Повторно суспензировать гранулу в PBS, провести подсчет клеток и отрегулировать концентрацию до 1 × 10⁶ клеток/мл с помощью PBS.
  4. Распределите ячейки по трём центрифугным трубкам, добавляя к каждой трубке по 200 мкл суспензии ячейки.
  5. Добавьте антитело CD11b (разбавленные 1:100 в универсальном разбавлении антител) при итоговом объёме 100 мкл в пробирку 1. Вихрь для смешивания.
    1. После 15 минут инкубации добавьте 1 мл фиксационного/проницательного агента в трубку 1, промешайте вихрь и инкубируйте 30 минут, защищённых от света.
    2. Добавьте буфер фиксации/проникливости объемом 1 в трубку 1 для завершения пермеабилизации, вихрь для смешивания, центрифугу (4 °C, 500 × г, 5 мин) и сбросьте супернатант.
    3. Приготовьте 100 мкл коктейля виментина и антитела CD68 (каждый разбавлен 1:100 универсальным разбавителем антител), добавьте в пробирку 1, введите в вихрь для смешивания и инкубируете, защищённые от света, в течение 30 минут.
    4. Добавьте буфер фиксации/проницаемости 1 мл в трубку 1, вихрь для смешивания, центрифугу (4 °C, 500 × г, 5 мин) и сбросьте супернатант.
    5. Добавьте 100 мкл вторичного антитела Alexa Fluor 488 конъюгированного против кроличьего IgG (разбавленного 1:50 в универсальном разбавлении антител) в пробирку 1. Вихрь для смешивания и инкубации, защищённый от света в течение 30 минут.
    6. Добавьте 1 мл буфера в трубку 1, вооружитесь в вихрь для смешивания, центрифугите (4 °C, 500 × г, 5 мин) и сбросьте супернатант.
    7. Добавьте 300 мкл буфера в Трубку 1 и создайте вихрь для смешивания для загрузочного образца.
  6. Добавьте антитела CD90 и CD14 (каждое разбавлено в 1:100 универсальным разбавляющим средством) в пробирку 2 до итогового объёма 100 мкл. Оставьте трубку 3 без антител в качестве отрицательного контроля.
    1. После 15 минут инкубации добавьте 1 мл PBS в трубки 2 и 3.
    2. Центрифугные трубки 2 и 3 (4 °C, 500 × г, 5 мин), сбросьте супернатант, добавьте 300 мкл буфера и замешайте для загрузочного образца.
  7. Проведите взятие проточной цитометрии подготовленных образцов.
  8. Анализируйте данные потоковой цитометрии и выполняйте статистику с помощью совместимого программного обеспечения.

6. Измерение пролиферации RA-FLS, вызванной TNF-α, с помощью анализа MTS

  1. Переваривайте RA-FLS третьего поколения с использованием трипсина без EDTA.
  2. Прекратить расщепление полной средой DMEM, центрифугой (4 °C, 500 × г, 5 минут) и выбросить супернатант.
  3. Суспензировать гранулу в полной среде DMEM, провести подсчёт клеток и разбавить до 1 × 10⁵ клетки/л.
  4. Засейте восстановленные клетки в пластину с 96 лунками при 100 мкл на колодцу.
  5. Инкубировать пластину в инкубаторе клеточной культуры до момента склеянения, затем разделить на группы контроля и вмешательства.
  6. Добавьте 10 нг/мл TNF-α в группу вмешательства и равный объём PBS в пустую контрольную группу.
  7. После 24 часов вмешательства добавьте в каждую скважину реагент MTS по 10 мкл и продолжите инкубацию в инкубаторе клеточной культуры.
  8. После часа инкубации измерьте поглощение (OD) на 490 нм с помощью считывателя микропластин.
  9. Рассчитывайте жизнеспособность клеток на основе значения OD каждой скважины.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

С помощью протокола мы успешно выделили кратковременные культуры, полученные пациентами RA-FLS. Приведена схематическая схема процедурного рабочего процесса (рисунок 1). При световой микроскопии RA-FLS проявил преобладающий морфологический фенотип веретенообразных и неправильных многоугольных клеток. Клетки демонстрировали обширное цитоплазматическое распространение с удлинёнными отростками. Границы клеток казались слегка нечеткими в местах контакта или пере...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол устанавливает воспроизводимый метод выделения и краткосрочной культуры РА-ФЛС у пациентов с РА, успех которого подтверждается высокой жизнеспособностью клеток, характерным фенотипом, экспрессией специфических маркеров и оперативной реакцией на воспалительные стимулы.

Критические шаги и технические аспекты
Надёжность этого метода зависит от нескольких критически важных этапов. Во-первых, свежая синовиальная ткань должна быть не...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не отмечают конфликтов интересов в этой работе и подтверждают, что использование Figdraw для генерации рисунка 1 соответствует условиям лицензирования платформы.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (No 82074223 и 8207141673) и ключевым проектом на уровне центрального правительства: Создание устойчивого использования ценных ресурсов китайской медицины (No 2060302).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Alexa Fluor 488-конъюгированный антикроличий IgGЧжуншань Цзинцяо БиотехнологияZF-0511
0,25% трипсин-ЭДТА (1 раз)Gibco25200-072
4% параформальдегидSolarbioP1110
Alexa Flour674 античеловеческий CD68Biolegend562111
Решение для блокировки без животныхТехнология клеточной сигнализации15019
Античеловеческий APC CD90Biolegend559869
BD FACSDiva Software 8.0.2BD Biosciences657925
BD LSRFortessaBD Biosciences647177
BV605 противочеловеческий CD11bbidegend563015
CellTiter 96 Анализ пролиферации клеток с одним раствором (MTS)PromegaG358A
Коллагеназа IISolarbioC8150
Флуоресцентная монтажная среда с DAPIЧжуншань Цзинцяо БиотехнологияZLI-9556
Флуоресцентная монтажная среда с DAPIЧжуншань Цзинцяо БиотехнологияZLI-9556
Модифицированная орлиная среда Dulbecco (DMEM), высокий уровень глюкозыHyCloneSH30022.01
Сыворотка плода крупного рогатого скота — Superfine (FBS)Шанхайская Чжунцяо Синьдань биотехнологияZQ0500
Античеловеческий препарат FITC CD14Biolegend325604
PBS, 1 и раз; (pH 7.4) Фосфатно-буферный физиологический растворServicebioG4202
Раствор смеси пенициллина-стрептомицина (двойные антибиотики) 100 раз;Шанхайская Чжунцяо Синьдань биотехнологияCSP006
Универсальный буфер для блокировки белка и разведения антител QuickBlockBeyotimeP0270-500 мл
Рекомбинантный человеческий TNF-и альфа;Peprotech300-01A
Окрашивание по фактору транскрипцииeBioscience00-5523-00
Triton X-100SolarbioT8200
Раствор Trypsin (без EDTA)Beijing Labgic Technology Co., Ltd.BL526A

Ссылки

  1. Di Matteo, A., Bathon, J. M., Emery, P. Rheumatoid arthritis. Lancet. 402 (10416), 2019-2033 (2023).
  2. Uke, P., Maharaj, A., Adebajo, A. A review on the epidemiology of rheumatoid arthritis: An update and trends from current literature. Best Pract Res Clin Rheumatol. 39 (1), 9(2025).
  3. Wu, D., et al. Systemic complications of rheumatoid arthritis: Focus on pathogenesis and treatment. Front Immunol. 13, 13(2022).
  4. Chen, G., Yan, Z., Wang, Y., Tao, Q. Rheumatoid arthritis and fibromyalgia syndrome: A bibliometric and bioinformatics perspective on comorbidity research. J Multidiscip Healthc. 18, 6811-6827 (2025).
  5. Zhao, Y., Chen, G. Y., Fang, M. Research trends of rheumatoid arthritis and depression from 2019 to 2023: A bibliometric analysis. J Multidiscip Healthc. 17, 4465-4474 (2024).
  6. Komatsu, N., Takayanagi, H. Mechanisms of joint destruction in rheumatoid arthritis - immune cell-fibroblast-bone interactions. Nat Rev Rheumatol. 18 (7), 415-429 (2022).
  7. Zhang, Y. Y., Gao, Z. J., Chao, S. S., Lu, W. J., Zhang, P. P. Transdermal delivery of inflammatory factor-regulated drugs for rheumatoid arthritis. Drug Deliv. 29 (1), 1934-1950 (2022).
  8. Bottini, N., Firestein, G. S. Duality of fibroblast-like synoviocytes in RA: Passive responders and imprinted aggressors. Nat Rev Rheumatol. 9 (1), 24-33 (2013).
  9. Smolen, J. S., et al. Rheumatoid arthritis. Nat Rev Dis Primers. 4, 23(2018).
  10. Liu, Y., et al. Regulatory fibroblast-like synoviocytes cell membrane-coated nanoparticles: A novel targeted therapy for rheumatoid arthritis. Adv Sci. 10 (4), 15(2023).
  11. Li, C. L., et al. A transformable nanoplatform precisely positions fibroblast-like synoviocytes via FAP-α for improved rheumatoid arthritis therapy. Adv Healthc Mater. 15 (2), e03277(2026).
  12. Meng, Q. L., Wei, K., Shan, Y. E3 ubiquitin ligase gene BIRC3 modulates TNF-induced cell death pathways and promotes aberrant proliferation in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes. Front Immunol. 15, 10(2024).
  13. Chen, L., et al. AMPK signaling in osteoarthritis: From mechanisms to targeted therapeutics. Front Pharmacol. 16, 1681610(2025).
  14. Bakinowska, E., et al. The role of mesenchymal stromal cells in the treatment of rheumatoid arthritis. Cells. 13 (11), 17(2024).
  15. Filer, A. The fibroblast as a therapeutic target in rheumatoid arthritis. Curr Opin Pharmacol. 13 (3), 413-419 (2013).
  16. Promila, L., et al. Mitochondrial calcium uniporter regulates human fibroblast-like synoviocytes invasion via altering mitochondrial dynamics and dictates rheumatoid arthritis pathogenesis. Free Radic Biol Med. 234, 55-71 (2025).
  17. Wang, X. C., He, J. X., Zhang, Q., He, J., Wang, Q. W. Constructing a 3D co-culture in vitro synovial tissue model for rheumatoid arthritis research. Mater Today Bio. 31, 16(2025).
  18. Shi, R. Y., et al. Monocyte membrane-coated drug nanocrystals for enhanced targeted therapy of rheumatoid arthritis. J Control Release. 384, 14(2025).
  19. Smolen, J. S., et al. EULAR recommendations for the management of rheumatoid arthritis with synthetic and biological disease-modifying antirheumatic drugs: 2019 update. Ann Rheum Dis. 79 (6), 685-699 (2020).
  20. Chen, G. Y., et al. Mechanisms of total glucosides of paeony in alleviating methotrexate-induced liver injury. Drug Des Devel Ther. 19, 3407-3423 (2025).
  21. Philippon, E. M. L., et al. A novel 3D spheroid model of rheumatoid arthritis synovial tissue incorporating fibroblasts, endothelial cells, and macrophages. Front Immunol. 14, 11(2023).
  22. Lin, X., et al. Sesamol serves as a p53 stabilizer to relieve rheumatoid arthritis progression and inhibits the growth of synovial organoids. Phytomedicine. 121, 14(2023).
  23. Lee, M. S., Kim, S., Lee, J. H., Bae, Y. S., Lee, S. K. Synovium-on-a-chip reveals fibroblast-macrophage crosstalk underpinning joint homeostasis and evaluation of gout therapies. Adv Healthc Mater. 14 (18), 16(2025).
  24. Kim, D., et al. 3D in vitro synovial hyperplasia model on polycaprolactone-micropatterned nanofibrous microwells for screening disease-modifying anti-rheumatic drugs. Mater Today Bio. 26, 10(2024).
  25. Murakami, A., et al. Human CD4(+) T cells regulate peripheral immune responses in rheumatoid arthritis via insulin-like growth factor-like family member 2. Sci Immunol. 10 (110), eadr3838(2025).
  26. Yue, S., et al. Unveiling the therapeutic potential: Targeting fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis. Expert Rev Mol Med. 27, e18(2025).
  27. Clister, T., et al. Optimization of tissue digestion methods for characterization of photoaged skin by single-cell RNA sequencing reveals preferential enrichment of T cell subsets. Cells. 13 (3), (2024).
  28. Hu, Z., et al. Novel strategy for primary epithelial cell isolation: Combination of hyaluronidase and collagenase I. Cell Prolif. 56 (1), e13320(2023).
  29. Sueters, J., Schipperheijn, R., Huirne, J., Smit, T., Guler, Z. Reproducibility and consistency of isolation protocols for fibroblasts, smooth muscle cells, and epithelial cells from the human vagina. Cells. 14 (2), 76(2025).
  30. Jiang, D. X., et al. Primary isolation, culture, and phenotypic verification of rat knee articular chondrocytes. J Vis Exp. (225), e69509(2025).
  31. Donlin, L. T., et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Res Ther. 20 (1), 139(2018).
  32. Zhang, F., et al. Deconstruction of rheumatoid arthritis synovium defines inflammatory subtypes. Nature. 623 (7987), 616(2023).
  33. Li, P. F., et al. Comparative proteomic analysis of polarized human THP-1 and mouse RAW264.7 macrophages. Front Immunol. 12, 13(2021).
  34. Zhu, E. B., et al. Biomimetic cell stimulation with a graphene oxide antigen-presenting platform for developing T cell-based therapies. Nat Nanotechnol. 19 (12), 1914-1922 (2024).
  35. Sato, N., Bamford, R. N., Bryant, B. R., Tagaya, Y., Waldmann, T. A. Accessory cells precondition naive T cells and regulatory T cells for cytokine-mediated proliferation. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (15), 13(2023).
  36. Krishnaswamy, J. K., Alsén, S., Yrlid, U., Eisenbarth, S. C., Williams, A. Determination of T follicular helper cell fate by dendritic cells. Front Immunol. 9, 16(2018).
  37. Ndeupen, S., et al. Langerhans cells and cDC1s play redundant roles in mRNA-LNP-induced protective anti-influenza and anti-SARS-CoV-2 immune responses. PLoS Pathog. 18 (1), 18(2022).
  38. Walsh, M. C., et al. Osteoimmunology: Interplay between the immune system and bone metabolism. Annu Rev Immunol. 24, 33-63 (2006).
  39. Koenderman, L., Tesselaar, K., Vrisekoop, N. Human neutrophil kinetics: A call to revisit old evidence. Trends Immunol. 43 (11), 868-876 (2022).
  40. Montero, R. B., et al. bFGF-containing electrospun gelatin scaffolds with controlled nano-architectural features for directed angiogenesis. Acta Biomater. 8 (5), 1778-1791 (2012).
  41. Yang, C. Y., Yuan, W. W., Liao, G. X., Yu, Q. Q., Wang, L. G. Construction of bFGF/heparin and Fe3O4 nanoparticles functionalized scaffolds aiming at vascular repair and magnetic resonance imaging monitoring. Int J Biol Macromol. 286, 15(2025).
  42. Rim, Y. A., Park, N., Nam, Y., Ju, J. H. Generation of induced-pluripotent stem cells using fibroblast-like synoviocytes isolated from joints of rheumatoid arthritis patients. J Vis Exp. (116), e54072(2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Видео скоро будет доступно

Похожие статьи