Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка резерва коронарного потока в мышиной модели сердечной недостаточности с сохраненной фракцией выброса с помощью доплеровской эхокардиографии

383 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70135

⸱

24 марта 2026 г.

 ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Nanjing Drum Tower Hospital, Nanjing Drum Tower Hospital Clinical College of Nanjing Medical University, 2Department of Cardiology, Nanjing Drum Tower Hospital, The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School, MOE Key Laboratory of Model Animal for Disease Study, Nanjing University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает быстрый, неинвазивный подход к оценке коронарной микроваскулярной дисфункции в мышиной модели сердечной недостаточности с сохраненной фракцией выброса (HFpEF). Резерв коронарного потока (CFR) определяется локализацией левой коронарной артерии, управляемой доплеровским ультразвуком, рассчитанной как отношение гиперемической и базовой скорости коронарного течения.

Аннотация

Сердечная недостаточность с сохраненной фракцией выброса (HFpEF) представляет собой значительную глобальную нагрузку для здоровья и серьёзную клиническую проблему из-за отсутствия эффективных методов лечения, а патофизиология, основанная в основе, остаётся недостижимой. Коронарная микроваскулярная дисфункция (CMD), которая широко распространена у пациентов с HFpEF, вызывает ишемию миокарда, которая нарушает как диастолическую и систолическую функции левого желудочка. Поскольку дисфункция микрососудистых заболеваний является центральной чертой HFpEF, CMD теперь считается важным фактором его патогенеза. Резерв коронарного потока (CFR), определяемый как отношение максимальной гиперемии к скорости кровотока в покое, является очень ценным маркером ишемии миокарда. Кроме того, он служит комплексным индикатором коронарной вазомоторной дисфункции, измеряя совокупные гемодинамические эффекты как эпикардиальных, так и микрососудистых коронарных артерий на перфузию миокарда. Этот протокол был направлен на оценку изменений CFR в мышиной модели HFpEF с помощью допплеровской эхокардиографии. В этом исследовании контрольные мыши показали более чем двукратное увеличение пиковой скорости коронарного кровотока при вазодилатации, вызванной изофлураном, по сравнению со значениями покоя, тогда как у мышей с HFpEF этот ответ был значительно ослаблен. При HFpEF сниженный CFR предсказывает неблагоприятные результаты и отражает скрытую дисфункцию микрососудистых заболеваний, ставя его ключевым инструментом для изучения прогрессирования заболевания и направления отбора пациентов.

Введение

Сердечная недостаточность (ГФ) с сохраненной фракцией выброса (ГФпЭФ) является доминирующей формой СН и связана с плохим прогнозом. Однако не существует доказанного лечения, способного снизить связанную с этим заболеваемостьи смертность 1,2. Наличие множества факторов риска, включая преклонный возраст, гипертонию, диабет, дислипидемию и ожирение, лежит в основе сложности и гетерогенностиHFpEF 3. В последние годы накопленные данные показали, что коронарная микроваскулярная дисфункция (CMD) является независимым и прямым фактором риска HFpEF, а не сопутствующей 4,5,6. Коронарная микроваскулярная дисфункция, включающая как функциональные, так и структурные аномалии, лежит в основе субэндокардиальной ишемии, диффузного интерстициального фиброза и дисфункции левого желудочка при HFpEF 7,8. Проведены обширные исследования патологической роли CMD при сердечно-сосудистыхзаболеваниях 9,10. Клиническое исследование показало, что дисфункция микрососудистых заболеваний (выявленная нарушением CFR <2.0) напрямую связана с ухудшением диастолической функции левого желудочка и может быть перспективной терапевтической мишенью приHFpEF 11. Эхокардиографическая оценка распространённости микроваскулярной дисфункции при сердечной недостаточности с сохраненной фракцией выброса (PROMIS-HFpEF) показала, что у 75% пациентов с HFpEF был выявлен CMD, согласно измерениям CFR в левой коронарнойартерии 12. Кроме того, аномальный CMD коррелировал с повышенным риском неблагоприятных последствий, включая значительно повышенный рисксмертности 13,14. В результате использование CMD в качестве ключевого биомаркера в животных моделях значительно облегчает исследование патофизиологии HFpEF и способствует валидации успешной репликации фенотипа заболевания.

В настоящее время методы оценки функции коронарной микроваскулярной системы, такие как позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ), сердечно-сосудистый магнитный резонанс (КМР), фракционный резерв потока (ФФР) и индекс микроциркуляторного сопротивления (ИМР), трудно применять в исследованиях грызунов из-за малых размеров животных и ограниченного доступа специализированного оборудования для визуализации. Резерв коронарного потока (CFR) рекомендован международными рекомендациями как инструмент для изучения коронарнойфизиологии 15,16. Кроме того, CFR служит надёжным маркером сердечно-сосудистой ишемии, показателем коронарно-сосудистой дисфункции и ценным прогностическим индикатором сердечно-сосудистогориска 17. Допплеровская эхокардиография для оценки CFR — это проверенный и воспроизводимый метод оценки глобальной функции коронарных сосудов в доклинических моделях грызунов. Хотя предыдущие исследования сообщали об использовании CFR в моделях мыши/крыс с ишемией-реперфузией миокарда18,19, он никогда не применялся на животных моделях HFpEF. Кроме того, метод оценки CFR, описанный в этом исследовании, который быстро определяет LCA с помощью цветной доплеровской эхокардиографии, может быть распространён на различные животные модели, включая диабетическую кардиомиопатию, гипертоническую болезнь сердца и хронические воспалительные или аутоиммунные заболевания. В настоящем исследовании, учитывая отсутствие эпикардиального коронарного стеноза в мышиной модели, снижение коронарного резерва (CFR) в первую очередь отражает коронарную микроваскулярную дисфункцию, а не совокупный вклад эпикардиального и микрососудистого. Таким образом, CFR служит надёжным суррогатным маркером CMD в этой модели HFpEF.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры соответствовали протоколам, утверждённым Институциональным комитетом по этике больницы Нанкина Drum Tower (Одобрение No 20011141) и соответствовали руководящим принципам20 Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE). В этом исследовании модель HFpEF была установлена у самцов C57BL/6J (BW, ~25 г) возрастом от шести до восьми недель. В течение всего экспериментального периода мыши содержались в комнате без специфических патогенов (SPF) при контролируемых условиях температуры (23 ± 1 °C), влажности (65%–70%) и 12-часовом цикле свет/темнота. Все животные имели ad libitive доступ к еде и воде. После исследования мышей анестезиировали 1,5% изофлураном и эвтаназии путём вывиха шейки матки. Используемые реагенты и оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Создание модели мыши HFpEF

  1. Случайным образом распределите мышей на две группы: контрольную (CTRL) группу и группу HFpEF, в каждой по восемь мышей.
  2. Использовать установленный протокол 21,22,23,24,25 для индуцирования модели мыши HFpEF следующим образом:
    1. Кормите мышей в возрасте от шести до восьми недель высокожирной диетой (HFD, 60% жира) и обеспечивайте 0,5 г/л N-нитро-L-аргинин метилэфира (L-NAME), растворённого в питьевой воде в течение 8 недель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Готовьте питьевую воду L-NAME в коричневых бутылках, чтобы избежать освещения, и обновляйте её каждые 2–3 дня.
  3. Кормите мышей по возрасту стандартным нормальным рационом и обеспечивайте регулярную питьевую воду в течение того же времени, что и контрольная группа.

2. Оценка резерва коронарного потока с помощью эхокардиографии

  1. Предшествуют эхокардиографической оценке с помощью анестезии мыши путём вдыхания 1,5% испарённого изофлурана, введённого при 1,5–2,0 л/мин с 100% O₂ в анестезиологической камере.
    ВНИМАНИЕ: Изофлуран — летучий анестетик. Обеспечьте достаточную вентиляцию во время работы. Надевайте нитриловые перчатки при добавлении жидкого изофлурана в вапорайзер, чтобы избежать контакта с кожей.
  2. Подтвердите отсутствие реакции на щипки кожи и стимуляцию пальцев ног или хвоста, затем положите животное на спину на платформу для визуализации.
  3. Переключите аппарат для газовой анестезии из камеры в маску и поддерживайте постоянную концентрацию анестезии 1,5% на протяжении всей процедуры.
  4. Получите физиологические данные (ЭКГ и дыхание), нанеся проводящий гель на медный лист (электроды ЭКГ) платформы визуализации и прикрепив к ним четыре лапы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте изофлурана на уровне 1,5% для поддержания и поддерживайте температуру тела близко к 37 °C с помощью встроенной платформы для потепления. Поддерживайте целевую частоту дыхания 100–140 вдохов в минуту для обеспечения физиологической стабильности во время визуализации.
  5. Удалите волосы на груди, нанеся депиляционный крем с аппликатором с ватным наконечником.
  6. Протрите лишний крем и рыхлую шерсть влажной марлей, чтобы подготовиться к визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полностью удалите остаточный депиляционный крем, чтобы избежать раздражения или токсичности кожи.
  7. Нанесите стерильную смазочную офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание склеры.
  8. Нанесите ультразвуковой гель в переднюю часть сердца и разместите платформу для визуализации примерно под углом 30°–45° относительно горизонтали.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте воздушных пузырьков в ультразвуковом геле.
  9. Медленно разместите высокочастотный ультразвуковой преобразователь на линии парастерины и выровняйте его параллельно груди, чтобы получить скорректированный обзор левого желудочка по отрегулированной длинной оси парастерины (PLAX) (рисунок 1A).
  10. Наклоните зонд, чтобы обеспечить лёгкий контакт с грудной стенкой, избегая сдавливания.
  11. Нажмите кнопку Bright Mode , чтобы переключиться на режим яркости.
  12. Отрегулировать угол зонда и платформы визуализации, чтобы определить левую коронарную артерию (ЛКА).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Определите левый желудочек (LV), левое предсердие (LA), переднюю стенку левой желудочка (LVAW), заднюю стенку левой желудочка (LVPW), межжелудочковую перегородку (IVS), аорту (AO), легочную артерию (PA), лёгочную вену (PV), митральный клапан (MV) и папиллярную мышцу в акустическом окне.
  13. Активируйте режим цветного доплера, нажав кнопку цветного доплера на сенсорном экране. В реальном времени поток от аортального клапана (в сторону зонда) выглядит красным.
  14. Скорректируйте угол и положение зонда, чтобы визуализировать полный LCA от аортального синуса до дистальной ветви, минимизируя помехи от потока в лёгочной вене.
  15. Активируйте режим импульсно-волнового доплера (PW). Расположите окно измерения PW параллельно направлению кровотока LCA (рисунок 1B,C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте угол инсонации ниже 60° и применяйте коррекцию угла в реальном времени, выравнивая курсор Доплера параллельно коронарному потоку.
  16. Выберите Сохранить клип, чтобы запечатлеть базовую форму скорости потока LCA.
  17. Увеличьте концентрацию изофлурана до 3% и наблюдайте постепенное увеличение скорости коронарного потока.
  18. После 45 секунд непрерывного воздействия 3% изофлурана выберите «Сохранить клип » для фиксации гиперемической коронарной скорости потока.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Постоянно контролируйте кровоток LCA. Если объём образца PW дрейфует из-за дыхательных или сердечных движений, приостановить получение, вернуться в режим цветного доплера для повторной идентификации LCA, переместить гейт PW и возобновить режим PW.
  19. После завершения приёма изофлурана прекратите вдыхание изофлурана и удалите ультразвуковой гель. Положите мышь на грелку, пока она полностью не восстановится, затем верните её в клетку.

3. Статистический анализ

  1. Средние измерения из трёх последовательных сердечных циклов отслеживаются в программном обеспечении для анализа для получения базовой и пиковой скоростей потока LCA. Вычислите CFR как отношение гиперемической пика диастолической скорости коронарного потока к базовой пиковой диастолической коронарной скорости (CFV).
  2. Внедрить двойной слепой дизайн между экспериментатором и аналитиком данных. Оценить нормальность с помощью теста Шапиро–Уилка. Анализировать нормально распределённые данные с помощью двухстороннего непарного t-теста Студента. Анализируйте ненормально распределённые данные с помощью теста Манна–Уитни U.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом исследовании участвовали 16 мышей (HFpEF, n = 8; использовались CTRL, n = 8). Левая коронарная артерия была идентифицирована с помощью цветного Доплера в виде парастернального длинного ося (PLAX), а скорость коронарного потока измерялась с помощью импульсно-волнового (PW) доплера. После получения достаточного количества и воспроизводимых изображений с каждой мыши при концентрациях изофлурана 1,5% (исходная) и 3% (гиперэмичная) была определена26 CFR путём ус...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В данном исследовании представлен протокол, использующий неинвазивный, простой и воспроизводимый метод для оценки макро- и микрососудистой дисфункции в животных моделях с HFpEF. Доплеровская эхокардиография для оценки коронарного резерва признана Европейским кардиологическим обществом как валидированный и воспроизводимый метод15. При нормальных физиологических условиях у мышей C57BL/6J резерв коронарного потока ожидается ≥2.0. В этом исследовании, по сравнению с г...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что нет конкурирующих финансовых или коммерческих интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Фондом для выдающихся молодых учёных в Нанкине — ключевой проект, поддерживаемый Фондом развития медицинской науки и технологий, Департаментом здравоохранения Нанкина (JQX22001); Китайский фонд постдокторских наук (2023M731631); Финансирование клинических испытаний от аффилированной больницы Drum Tower, Медицинской школы Нанкинского университета (2024-LCYJ-PY-29); Исследовательский фонд провинции Цзянсу, комиссия по здравоохранению и планированию семьи (MQ2024049).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Монитор физиологии животныхFujifilmVEVO 3100Отслеживайте частоту сердечных сокращений, дыхание и температуру тела
Мыши C57GemPharmatech Co., Ltd
КамераКанон, ЯпонияEOS R50Запишите положения платформы для визуализации и ультразвукового датчика
Депиляционный кремVeet, французскийУдаление волос
МарляCurityCAR-6339-PKСтерильный
ИзофлуранНАГРАДАR510-22-10Анестезия
N-нитро-L-аргинин метилэфир (L-NAME)Сигма-ОлдричN5751Введение в модель мышей HFpEF
Исследовательские диеты — 60% жира и bbsp;  Research Diets, Inc.   D12492Диета с высоким содержанием жиров
Хирургическая термостатическая грелкаGlobalebio, КитайGE0-20WКонтроль температуры
Ультразвуковой гельЛаборатории ПаркераW60698LГель для ультразвуковой передачи
Vevo 3100 для доклинической визуализацииFujifilmVEVO 3100Эхокардиография
Программное обеспечение VevoLABFujifilmVevoLAB 3.2.6Анализ данных эхокардиографии

Ссылки

  1. Redfield, M. M., Borlaug, B. A. Heart Failure With Preserved Ejection Fraction: A Review. JAMA. 329 (10), 827-838 (2023).
  2. Withaar, C., Lam, C. S. P., Schiattarella, G. G., de Boer, R. A., Meems, L. M. G. Heart failure with preserved ejection fraction in humans and mice: embracing clinical complexity in mouse models. Eur Heart J. 42 (43), 4420-4430 (2021).
  3. Borlaug, B. A. Evaluation and management of heart failure with preserved ejection fraction. Nat Rev Cardiol. 17 (9), 559-573 (2020).
  4. Paulus, W. J., Tschope, C. A novel paradigm for heart failure with preserved ejection fraction: comorbidities drive myocardial dysfunction and remodeling through coronary microvascular endothelial inflammation. J Am Coll Cardiol. 62 (4), 263-271 (2013).
  5. Shah, S. J., et al. Prevalence and correlates of coronary microvascular dysfunction in heart failure with preserved ejection fraction: PROMIS-HFpEF. Eur Heart J. 39 (37), 3439-3450 (2018).
  6. Lee, J. F., et al. Evidence of microvascular dysfunction in heart failure with preserved ejection fraction. Heart. 102 (4), 278-284 (2016).
  7. Freed, B. H., et al. Prognostic Utility and Clinical Significance of Cardiac Mechanics in Heart Failure With Preserved Ejection Fraction: Importance of Left Atrial Strain. Circ Cardiovasc Imaging. 9 (3), 191-200 (2016).
  8. Taqueti, V. R., et al. Coronary Flow Reserve, Inflammation, and Myocardial Strain: The CIRT-CFR Trial. JACC Basic Transl Sci. 8 (2), 141-151 (2023).
  9. Zhao, J., et al. Heart-gut microbiota communication determines the severity of cardiac injury after myocardial ischaemia/reperfusion. Cardiovasc Res. 119 (6), 1390-1402 (2023).
  10. Zhao, J., et al. Excessive accumulation of epicardial adipose tissue promotes microvascular obstruction formation after myocardial ischemia/reperfusion through modulating macrophages polarization. Cardiovasc Diabetol. 23 (1), 236(2024).
  11. Rush, C. J., et al. Prevalence of coronary artery disease and coronary microvascular dysfunction in patients with heart failure with preserved ejection fraction. JAMA Cardiol. 6 (10), 1130-1143 (2021).
  12. Hage, C., et al. Association of coronary microvascular dysfunction with heart failure hospitalizations and mortality in heart failure with preserved ejection fraction: a follow-up in the PROMIS-HFpEF study. J Card Fail. 26 (11), 1016-1021 (2020).
  13. Allan, T., Dryer, K., Fearon, W. F., Shah, S. J., Blair, J. E. A. Coronary microvascular dysfunction and clinical outcomes in patients with heart failure with preserved ejection fraction. J Card Fail. 25 (10), 843-845 (2019).
  14. Kelshiker, M. A., et al. Coronary flow reserve and cardiovascular outcomes: a systematic review and meta-analysis. Eur Heart J. 43 (16), 1582-1593 (2022).
  15. Knuuti, J., et al. 2019 ESC Guidelines for the diagnosis and management of chronic coronary syndromes. Eur Heart J. 41 (3), 407-477 (2020).
  16. Vancheri, F., Longo, G., Vancheri, S., Henein, M. Coronary microvascular dysfunction. J Clin Med. 9 (9), 2880(2020).
  17. Zacchigna, S., et al. Towards standardization of echocardiography for the evaluation of left ventricular function in adult rodents: a position paper of the ESC Working Group on Myocardial Function. Cardiovasc Res. 117 (1), 43-59 (2021).
  18. Guo, Z., et al. Dynamic assessments of coronary flow reserve after myocardial ischemia reperfusion in mice. J Vis Exp. (198), e65492(2023).
  19. Kelm, N. Q., Beare, J. E., LeBlanc, A. J. Evaluation of coronary flow reserve after myocardial ischemia reperfusion in rats. J Vis Exp. (148), e59675(2019).
  20. Percie du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 18 (7), e3000410(2020).
  21. Schiattarella, G. G., et al. Nitrosative stress drives heart failure with preserved ejection fraction. Nature. 568 (7752), 351-356 (2019).
  22. Guo, Y., et al. iNOS contributes to heart failure with preserved ejection fraction through mitochondrial dysfunction and Akt S-nitrosylation. J Adv Res. 43, 175-186 (2023).
  23. Xiong, Y., et al. Inhibition of ferroptosis reverses heart failure with preserved ejection fraction in mice. J Transl Med. 22 (1), 199(2024).
  24. Chen, J., et al. Nitazoxanide protects against heart failure with preserved ejection and metabolic syndrome induced by high-fat diet (HFD) plus L-NAME "two-hit" in mice. Acta Pharm Sin B. 15 (3), 1397-1414 (2025).
  25. Lanzer, J. D., et al. Single-cell transcriptomics reveal distinctive patterns of fibroblast activation in heart failure with preserved ejection fraction. Basic Res Cardiol. 119 (6), 1001-1028 (2024).
  26. Lenzarini, F., Di Lascio, N., Stea, F., Kusmic, C., Faita, F. Time course of isoflurane-induced vasodilation: a Doppler ultrasound study of the left coronary artery in mice. Ultrasound Med Biol. 42 (4), 999-1009 (2016).
  27. Yang, J. H., et al. Endothelium-dependent and independent coronary microvascular dysfunction in patients with heart failure with preserved ejection fraction. Eur J Heart Fail. 22 (3), 432-441 (2020).
  28. Silvani, A., et al. Physiological mechanisms mediating the coupling between heart period and arterial pressure in response to postural changes in humans. Front Physiol. 8, 163(2017).
  29. Mohan, M., Anandh, B., Thombre, D. P., Surange, S. G., Chakrabarty, A. S. Effect of posture on heart rate and cardiac axis of mice. Indian J Physiol Pharmacol. 31 (3), 211-217 (1987).
  30. Franssen, C., et al. Myocardial microvascular inflammatory endothelial activation in heart failure with preserved ejection fraction. JACC Heart Fail. 4 (4), 312-324 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.