Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Исследовательская статья

In vivo Неинвазивное наблюдение динамических изменений волоскового ствола, меланина и коллагена в цикле волосяных фолликулов у мышей

143 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70144

⸱

28 июля 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences, 2Experimental Research Center, China Academy of Chinese Medical Sciences, 3School of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

† These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данном исследовании представлен неинвазивный метод in vivo с использованием микроскопии двухфотонного и второго гармонического поколения для продольного мониторинга морфологии волоскового ствола, динамики меланина и плотности дермального коллагена на протяжении всего цикла волосяных фолликулов у мышей, предоставляя надёжную методологическую основу для терапевтических исследований по выпадению волос.

Аннотация

Традиционные оценки цикла волосяных фолликулов опираются на инвазивные гистологические методы, ограничивающие непрерывное продольные наблюдения. Было выдвинуто гипотеза, что неинвазивная оптическая визуализация, особенно двухфотонная возбуждённая флуоресценция (TPEF) и генерация второй гармонии (SHG), может точно отслеживать и количественно оценивать динамические изменения in vivo в волосковых стержнях, меланине и коллагене в течение нескольких циклов волосяных фолликулов. Волосковые стержни мышей C57BL/6 наблюдались in vivo во время фаз анагена, катагена и телогена с помощью дермоскопии, фотографии и электронной микроскопии. В частности, для количественной оценки динамики меланина использовались TPEF и визуализация при 800 нм, а SHG при 950 нм — для наблюдения изменений коллагена между фолликулярными коллагенами. Для обеспечения точности оптические измерения in vivo были проверены перекрёстно: динамика меланина подтверждалась с помощью кожной фотографии для общего внешнего вида тканей и окрашивания гематоксилина и эозина (HE) для экспрессии волосяных луковиц, а изменения коллагена подтверждались путём оценки плотности и ориентации волокон с помощью системы поляризации жидкостных кристаллов на участках с красным окрашением Sirius. Наблюдения показали, что в анагенной фазе диаметр волоскового стержня и выработка меланина постепенно увеличивались, сопровождаясь значительным снижением межфолликулярной плотности коллагена. Во время фаз катагена и телогена уровень меланина постепенно снижался, а плотность коллагена постепенно восстанавливалась до исходного уровня. Этот проект устанавливает валидированную, неинвазивную in vivo методологию оценки комплексной динамики волосяных фолликулов, предоставляя надёжную экспериментальную основу для доклинической оценки активных агентов для лечения выпадения волос.

Введение

Волосяные фолликулы мышей C57BL/6 демонстрируют синхроничность и регулярность, что обеспечивает экспериментальную удобность и делает их распространённой животной моделью для изучения кожныхзаболеваний 1,2. Волосяные фолликулы входят во вторую телогенную фазу на седьмой неделе после рождения мыши C57BL/6 3. При отсутствии искусственного вмешательства эта телогеновая фаза сохраняется до двенадцатой недели после рождения4. Этот длительный период телогена является распространённой временной точкой, используемой в исследованиях для синхронизации цикла роставолосяных фолликулов 5. После искусственной депиляции мышей волосяные фолликулы сразу же начинают входить ванагенную фазу 6.

После перехода в фазу роста стволовые клетки в области выпуклости размножаются и дифференцируются во внешнюю оболочку корня, растут вниз, увеличивая длинуфолликула 7. Основание волоскового стержня поднимается вверх по мере углубленияфолликула 8. Стволовые клетки в луковице непрерывно дифференцируются в ствол волоска и внутреннюю корневуюоболочку 9. Секреция коллагена и меланина в коже также быстро меняется в 10-й фазеанагена, играя важную роль в развитии волосяныхфолликулов 11,12. В исследованиях, связанных с выпадением волос, секреция меланина обычно оценивается по цвету кожи, что не позволяет точноопределить 13. На сегодняшний день исследования коллагена в основном были сосредоточены на развитии и старении, а не на циклической динамике количественной оценки.

В настоящее время основным ограничением при оценке циклов волосяных фолликулов и регенеративных терапий является зависимость от разрушительных гистологических конечных показателей, что требует эвтаназии разных когорт животных в определённые моментывремени 14. Это предотвращает непрерывное, продольное отслеживание одной и той же фолликулярной микросреды на протяжении нескольких циклов. Кроме того, традиционные неинвазивные методы, такие как дерматоскопия, не имеют достаточного проникновения в ткани для визуализации изменений глубокихфолликулов 15, а макроскопические наблюдения не позволяют точно количественно оценить меланин, что затрудняет обнаружение корня волос с дефицитом меланина во время поздней регрессии и фазпокоя 16,17. В то время как различные оптические технологии продвинули продольные наблюдения in vivo 18,19, такие как жидкокристаллическая поляриметрия для оценки коллагеновыхволокон 20,21, конфокальная микроскопия кожидля наблюдения пигментации 22,24 и оптическая когерентная томография для измерения толщиныкожи 25,26,27, мультифотонная микроскопия предлагает уникально убедительное решение. Совместное использование двухфотонной возбуждающей флуоресценции (TPEF) и генерации второй гармонии (SHG) даёт явные преимущества: оно позволяет безметочное, высокоразрешающее оптическое сечение глубоко в дерму, что позволяет одновременно in vivo количественно оценивать меланиновую автофлуоресценцию и архитектуру волокон коллагена без экзогенныхкрасителей 28,29. В этом исследовании авторы выдвигают гипотезу, что неинвазивная визуализация TPEF/SHG может динамически и точно количественно оценивать эти структурные изменения с точностью, сопоставимой с инвазивными гистологическими золотыми стандартами. Решая эту ключевую научную проблему, исследование направлено на создание надёжной, продольной модели визуализации in vivo для поддержки неинвазивной оценки терапевтических препаратов при алопеции30.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все методы, связанные с использованием позвоночных испытуемых, выполнялись в соответствии с институциональными рекомендациями. Все экспериментальные процедуры на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Экспериментального исследовательского центра Китайской академии медицинских наук Китая (код протокола: ERCCACMS11-2210-03). Все материалы, использованные в этом исследовании, перечислены в Таблице материалов.

Подготовка животных и макроскопические наблюдения
Самцы мышей C57BL/6, возрастом 6–7 недель и весом 20 ± 2 г, были получены у коммерческого поставщика. Мыши были разделены на когорту гистологического анализа (n = 39) и непрерывную когорту in vivo визуализации (n = 3). Спинная шерсть всех мышей была депилирована для синхронизации цикла волосяных фолликулов. Статус роста волос изучался через день с 2-го по 26-й день после депиляции. Спины мышей в группе фотографирования фотографировали через день до 26-го дня с помощью камеры. Сохранялось фиксированное фокусное расстояние 15 см, а также обеспечивались стабильные стандартные лабораторные условия для точного документирования макроскопических изменений.

In vivo Визуализация TPEF и SHG
Сеансы визуализации проводились на 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 и 26 днях после депиляции. Мыши были анестезиированы с помощью изофлурана. Полная потеря сознания обеспечивалась наблюдением за частотой дыхания и проверкой рефлекса стопы с лёгким защипыванием пальцев. Анестезированная мышь была закреплена на сцене двухфотонного микроскопа. Для TPEF-съёмки меланина микроскоп оснащался 25-кратным водяным погружением (числовая апертура = 1,05), а длина волны возбуждения была установлена на 800 нм. Было проведено z-стековое сканирование автофлуоресценции меланина, достигнувшее общей глубины сканирования 45 мкм. Размер шага был установлен на 2 мкм, разрешение изображения — на 1 024 × 1 024 пикселя, а скорость захвата — на 4 мкс/пиксель. Для SHG-съёмки коллагеновых волокон длина волны возбуждения была отрегулирована до 950 нм с использованием того же 25-кратного водного погружения объектива. Было инициировано z-стековое сканирование с верхней поверхности дермы до общей глубины сканирования 45 мкм, сохраняя размер шага 2 мкм, разрешение изображения 1 024 × 1 024 пикселя и скорость захвата 4 мкс/пиксель. После сеанса визуализации мышь аккуратно извлекали из стадии микроскопа, изофлуран прекратили, и её помещали на согревающую подушку до полного прихода в сознание, после чего возвращали в домашнюю клетку.

Сбор тканей и гистологическая обработка
Отдельная группа из трёх мышей из гистологической группы была эвтаназирована через день с 2 по 26-й день согласно институциональным рекомендациям, что гарантирует, что ни одна мышь не была повторно использована для продольного гистологического отбора. Хирургически был удален образец ткани спинной кожи длиной 2 см × 2 см, точно расположенный в месте пересечения горизонтальных и вертикальных средних линий на спине каждой мыши. Вырезанная кожная ткань была размещена плоско на твёрдом листе для предотвращения загибания краёв и немедленно погружена в пробирку с 4% параформальдегида. Фиксированные ткани были обезвожены и внедрены для получения парафиновых срезов толщиной 6 мкм. Перед удалением воска парафиновые секции нагревались на подогревателе в течение 120 минут. Секции были окрашены гематоксилином и эозином (HE) и Sirius Red с использованием стандартных наборов для окрашивания согласно инструкциям производителя. Срезы закреплялись с помощью нейтральной резинки и наблюдались с помощью перевёрнутого микроскопа. Для жидкостно-кристаллической поляризации девощённые и окрашенные Sirius Red срезы фотографировались под поляризованным световым микроскопом. Унифицированный поляризатор устанавливался путём пересечения поляризатора и анализатора ровно под углом 90° для достижения максимального тёмного фона (состояния вымирания), и этот удельный угол постоянно фиксировался при всех последующих запечатлениях изображений.

Дермоскопия in vivo и электронная микроскопия волосковых стволов
Перед выщипыванием область роста дорсальных волос была оценена in vivo с помощью клинического дерматоскопа с увеличением в 20 раз. Регенерация волос количественно оценивалась с помощью стандартной системы оценки 0–3, основанной на появлении и плотности волоска (0 = отсутствие видимых волос; 1 = редкое появление волос; 2 = умеренная плотность волос; 3 = плотное, полное покрытие волос). Для обеспечения беспристрастного отбора дискретизации дорсальная депилированная область каждой мыши визуально делилась на четыре равных квадранта. Генератор случайных чисел использовался для выбора двух квадрантов на мышь, и из каждого выбранного квадранта с помощью стерильных щипцов из каждого квадранта вырывались пять новых волосяных стержней. Выщипнутые волоски немедленно погружались и фиксировались в 2,5% глутаральдегиде в фосфатном буфере 0,1 M (pH 7,4) в течение 4 часов при 4 °C для сохранения ультраструктуры. Неподвижные волочки были промыты три раза в буфере с 0,1 млн фосфатов и последовательно обезвожены через серию градированного этанола (50%, 70%, 80%, 90% и 100%) в течение 15 минут при каждой концентрации, после чего следовала критическая точка сушки с использованием жидкогоCO2. Высохшие валы для волос монтировались горизонтально на проводящей двусторонней углеродной ленте, прикреплённой к алюминиевым заголовкам. Образцы были покрыты слоем 10 нм золотым слоем с использованием вакуумного напыливателя в течение 60 секунд, чтобы предотвратить зарядку электронов. Покрытые образцы вставлялись в сканирующий электронный микроскоп, а волосковые участки наблюдались с помощью ускоряющегося напряжения 5,0 кВ. Ультрамикроскопические морфологические изменения систематически оценивались с помощью изображений с увеличением 500x и 1000x, в частности документируя диаметр стержня волоска, структурную целостность и расположение кутикулярных чешуек.

Данные и статистический анализ
Параметры изображения измерялись и количественно оценивались с помощью универсального программного обеспечения для анализа изображений. Все статистические анализы и графические представления проводились с использованием стандартного программного обеспечения для статистического анализа. Для данных непрерывного in vivo мониторинга, полученных с одних и тех же животных в нескольких временных точках, статистическая значимость определялась с помощью анализа дисперсии с повторяющимися измерениями (RM-ANOVA), за которым следовал пост-хок тест Бонферрони. Для гистологических данных, включающих независимые образцы животных, для оценки статистических различий использовался обычный односторонний ANOVA, за которым следовал пост-хок тест Тьюки. Все результаты были выражены в виде среднего ± стандартного отклонения (SD). Различия считались статистически значимыми на уровне *p < 0,05, p < 0,01 и ***p < 0,001.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Наблюдение за шерстью мыши
Фотографические наблюдения роста мышиной шерсти представлены на рисунке 1A. Появление волос через поверхность кожи началось на 10-й день, при этом рост продолжался с 12-го по 16-й день (p < 0,05). Впоследствии покрытие волос достигло плато с 18-го по 26-й день (p > 0,05) (рисунок 1B). Кроме того, дермоскопия способствовала неинвазивному in vivo наблюдению ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Модель мыши C57BL/6 была выбрана потому, что её вторая телогенная фаза стабильно сохраняется с 7-й по 12-ю неделю. Поскольку 26-дневное окно наблюдения полностью относится к этой статической фазе, наблюдаемые глубокие динамические изменения явно обусловлены прогрессией цикла, вызванного депиляцией, полностью исключая естественные возрастные колебания. При депиляции в телогеновой фазе волосяные фолликулы сразу переходят в анагенную фазу. Насколько известно автору, это исследование предста...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, описанную в этой статье. Препринт этой статьи доступен в публичном репозитории BioRxiv в следующемсправочнике 42.

Благодарности

Эта работа была поддержана Фондом инноваций Китайской академии китайских медицинских наук (ID: CI2025C001), Научно-техническим инновационным проектом Китайской академии медицинских наук (Грант No NLTS2025004), а также фундаментальные исследовательские фонды для центральных исследовательских институтов общественного благосостояния (Грант No JJPY2025002).

Вклад автора: Концептуализация, Гайин Хэ и И Ван; расследование — Мэнхуа Лю, Сяою Ван и Фэнлун Ван; куратор данных — Мэнхуа Лю; сценарий — подготовка оригинального черновика, Мэнхуа Лю; приобретение финансирования, И Ван. Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
мыши C57BL/6,Beijing Vital River Laboratory Animal TechnologySCXK (Jing) 2021-0006Используются для создания животных-моделей
Цифровая DSLR-камераCanonEOS 80DИспользуется для фотографирования спины мышей
Набор для окрашивания H&ELtdSolarbio Science & Technology Co.G1120Используется для окрашивания тканевых срезов
Инвертированный микроскопOlympusBX51Используется для фотографирования
ЛзофлуранRWD Life Science Co.R510-22-16Используется для анестезии животных
Mai Tai DeepSeeSpectraPhysicsMai Tai HPИспользуется для TPEF и SHG in vivo изображений
Медицинский электронный дерматоскопChina Chuanghong Medical Technology Co.CH-DSIS-2000Используется для in vivo изображения цвета кожи
Поляризующий световой микроскопOlympusBX51-PИспользуется для изображения окрашивания Сириус Ред
Сканирующий электронный микроскоп (СЭМ)Hitachi High-Tech CorporationSU8010Для наблюдения ультраструктуры волосяных стеблей
Набор для окрашивания Сириус РедSolarbioG1472Для окрашивания коллагеновых волокон
Аппарат для анестезии малых животныхRWD Life Science Co.R500Используется для анестезии животных

Ссылки

  1. Müller-Röver S, et al. A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages. J Invest Dermatol. 2001;117(1):3-15.
  2. Lin X, Zhu L, He J. Morphogenesis, Growth Cycle and Molecular Regulation of Hair Follicles. Front Cell Dev Biol. 2022;10:899095.
  3. Wang WH, et al. Studying Hair Growth Cycle and Its Effects on Mouse Skin. J Invest Dermatol. 2023;143(9):1638-1645.
  4. Stenn KS, Paus R. Controls of hair follicle cycling. Physiol Rev. 2001;81(1):449-494.
  5. Paus R, Cotsarelis G. The biology of hair follicles. N Engl J Med. 1999;341(7):491-7.
  6. Pineda CM, et al. Intravital imaging of hair follicle regeneration in the mouse. Nat Protoc. 2015;10(7):1116-30.
  7. Hu XM, et al. A systematic summary of survival and death signaling during the life of hair follicle stem cells. Stem Cell Res Ther. 2021;12(1):453.
  8. Greco V, et al. A two-step mechanism for stem cell activation during hair regeneration. Cell Stem Cell. 2009;4(2):155-69.
  9. Hsu YC, Li L, Fuchs E. Transit-amplifying cells orchestrate stem cell activity and tissue regeneration. Cell. 2014;157(4):935-49.
  10. Xing YZ, Guo HY, Xiang F, Li YH. Recent progress in hair follicle stem cell markers and their regulatory roles. World J Stem Cells. 2024;16(2):126-136.
  11. Raja E, Clarin MTRDC, Yanagisawa H. Matricellular Proteins in the Homeostasis, Regeneration, and Aging of Skin. Int J Mol Sci. 2023;24(18):14274.
  12. Ojeh N, et al. In vitro. skin models to study epithelial regeneration from the hair follicle. PLoS One. 2017;12(3):e0174389.
  13. Wang F, et al. Pilose antler extracts promotes hair growth in androgenetic alopecia mice by activating hair follicle stem cells via the AKT and Wnt pathways. Front Pharmacol. 2024;15:1410810.
  14. Schneider MR, Schmidt-Ullrich R, Paus R. The hair follicle as a dynamic miniorgan. Curr Biol. 2009;19(3):R132-42.
  15. Bardou D, Bouaziz H, Lv L, Zhang T. Hair removal in dermoscopy images using variational autoencoders. Skin Res Technol. 2022;28(3):445-454.
  16. Navarrete-Dechent C, Jaimes N, Marchetti MA. Unveiling melanomagenesis through the dermatoscope. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2021;35(5):1038-1039.
  17. Liatsopoulou A, et al. Handheld dermatoscope versus digital camera for hair counts in laser facial hair removal. J Cosmet Laser Ther. 2023;25(1-4):38-44.
  18. Bromage TG, et al. Circularly polarized light standards for investigations of collagen fiber orientation in bone. Anat Rec B New Anat. 2003;274(1):157-68.
  19. López De Padilla CM, et al. Picrosirius Red Staining: Revisiting Its Application to the Qualitative and Quantitative Assessment of Collagen Type I and Type III in Tendon. J Histochem Cytochem. 2021;69(10):633-643.
  20. Feng F, Mao H, Wang A, Chen L. Two-Photon Fluorescence Imaging. Adv Exp Med Biol. 2021;3233:45-61.
  21. Fernández-Domper L, Ballesteros-Redondo M, Vañó-Galván S. Trichoscopy: An Update. Actas Dermosifiliogr. 2023;114(4):T327-T333.
  22. Zhai X, Vyas S, Yeh JA, Luo Y. Two-photon fluorescence imaging of subsurface tissue structures with volume holographic microscopy. J Biomed Opt. 2020;25(12):123705.
  23. Dulebo A, et al. Second harmonic atomic force microscopy imaging of live and fixed mammalian cells. Ultramicroscopy. 2009;109(8):1056-60.
  24. Zuhayri H, et al. In Vivo. Quantification of the Effectiveness of Topical Low-Dose Photodynamic Therapy in Wound Healing Using Two-Photon Microscopy. Pharmaceutics. 2022;14(2):287.
  25. Gerger A, Hofmann-Wellenhof R, Samonigg H, Smolle J. In vivo. confocal laser scanning microscopy in the diagnosis of melanocytic skin tumors. Br J Dermatol. 2009;160(3):475-81.
  26. Ilie MA, et al. Current and future applications of confocal laser scanning microscopy imaging in skin oncology. Oncol Lett. 2019;17(5):4102-4111.
  27. Al-Chaer RN, Bouazzi D, Jemec G, Mogensen M. Confocal microscopy and optical coherence tomography of inflammatory skin diseases in hairs and pilosebaceous units: A systematic review. Exp Dermatol. 2023;32(7):945-954.
  28. Graf BW, Boppart SA. Multimodal In Vivo. Skin Imaging with Integrated Optical Coherence and Multiphoton Microscopy. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 2012;18(4):1280-1286.
  29. Urban G, et al. Combining Deep Learning With Optical Coherence Tomography Imaging to Determine Scalp Hair and Follicle Counts. Lasers Surg Med. 2021;53(1):171-178.
  30. Sagawa N, et al. Role of increased vascular permeability in chemotherapy-induced alopecia: In vivo. imaging of the hair follicular microenvironment in mice. Cancer Sci. 2020;111(6):2146-2155.
  31. Duverger O, Morasso MI. Epidermal patterning and induction of different hair types during mouse embryonic development. Birth Defects Res C Embryo Today. 2009;87(3):263-72.
  32. Liu M, et al. Pilose antler extract promotes hair growth in androgenic alopecia mice by promoting the initial anagen phase. Biomed Pharmacother. 2024;174:116503.
  33. He G, et al. Non-invasive assessment of hair regeneration in androgenetic alopecia mice in vivo .using two-photon and second harmonic generation imaging. Biomed Opt Express. 2023;14(11):5870-5885.
  34. Chu X, et al. Functional regeneration strategies of hair follicles: advances and challenges. Stem Cell Res Ther. 2025;16(1):77.
  35. Fu D, et al. Dihydrotestosterone-induced hair regrowth inhibition by activating the androgen receptor in C57BL6 mice simulates androgenetic alopecia. Biomed Pharmacother. 2021;137:111247.
  36. Köhler C, et al. Mouse Cutaneous Melanoma Induced by Mutant BRaf Arises from Expansion and Dedifferentiation of Mature Pigmented Melanocytes. Cell Stem Cell. 2017;21(5):679-693.e6.
  37. Nishimura EK, Granter SR, Fisher DE. Mechanisms of hair graying: incomplete melanocyte stem cell maintenance in the niche. Science. 2005;307(5710):720-4.
  38. Driskell RR, et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 2013;504(7479):277-281.
  39. Matsumura H, et al. Hair follicle aging is driven by transepidermal elimination of stem cells via COL17A1 proteolysis. Science. 2016;351(6273):aad4395.
  40. Sayama A, et al. Morphological and Biochemical Changes During Aging and Photoaging of the Skin of C57BL/6J Mice. J Toxicol Pathol. 2010;23(3):133-9.
  41. Lynch B, et al. How aging impacts skin biomechanics: a multiscale study in mice. Sci Rep. 2017;7(1):13750.
  42. Liu M, He G, Wang F, Wang Y. In vivo. non-invasive observation of dynamic changes in hair shaft, melanin, and collagen during the C57BL/6 follicle cycle [preprint]. bioRxiv. 2025. doi:10.1101/2025.09.15.676351.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

БиологияВыпуск 233Выпуск 233Пустое значениеВыпускГенерация второй гармоникианагенмыши C57BL/6алопеция
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.